馬鈴薯的一種dna指紋圖譜及其獲取方法與其專用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及馬鈴薯的一種DNA指紋圖譜及其獲取方法與其專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯屬茄科多年生草本植物，塊莖可供食用，是世界第四大重要的糧食作物。我 國(guó)是全球馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó)，我國(guó)馬鈴薯育種以品種間或種間雜交為主。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)， 自20世紀(jì)40年代到2000年間，中國(guó)共育成馬鈴薯品種170多個(gè)。近年來(lái)，隨著我國(guó)馬鈴薯 育種進(jìn)程加快，育成的品種數(shù)量迅速增加，2000-2007年省級(jí)以上共審定品種近110個(gè)。但 由于早期對(duì)馬鈴薯品種缺乏系統(tǒng)完善的鑒定方法，致使出現(xiàn)同種多名和同名多種等現(xiàn)象， 品種混亂問(wèn)題給馬鈴薯生產(chǎn)造成很大損失。以往馬鈴薯品種鑒定一直是基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué) 特征，這些性狀易受環(huán)境條件影響。此外，我國(guó)育成馬鈴薯品種的親本基本上是五、六十年 代引自歐洲的四倍體栽培品種，親緣關(guān)系近，后代的遺傳變異停留在近交水平，因此對(duì)其進(jìn) 行形態(tài)學(xué)鑒定及分類相當(dāng)困難。因此，如何快速準(zhǔn)確鑒別馬鈴薯品種種質(zhì)資源，已成為當(dāng)前 馬鈴薯生產(chǎn)及科研中急需解決的問(wèn)題。
[0003] 與形態(tài)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記是建立在基因組DNA基礎(chǔ)之上，其能對(duì)各發(fā)育時(shí)期的 生物個(gè)體、組織、器官甚至細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，不受基因表達(dá)的影響，具有操作簡(jiǎn)便、數(shù)量豐富、 及多態(tài)性高等特點(diǎn)（Kumer，1999)。實(shí)踐證明，分子標(biāo)記可對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確、科學(xué)的鑒定 和評(píng)價(jià)，為育種工作者提供直接、可靠的依據(jù)（邸宏等，2006)。
[0004] 為了充分有效地利用馬鈴薯豐富的種質(zhì)資源，需要建立高效的馬鈴薯DNA分子標(biāo) 記技術(shù)體系并利用其對(duì)馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供馬鈴薯的一種DNA指紋圖譜及其獲取 方法與其專用引物，更充分地、有效地利用馬鈴薯豐富的種質(zhì)資源。
[0006] 本發(fā)明提供的一種獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的專用引物，由序列表的序列SEQ ID ΝΟ:1~7組成。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟A :提取馬鈴薯的基因組DNA ;
[0009] 步驟B :以步驟A的馬鈴薯的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的專用引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0010] 步驟C :對(duì)步驟B中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB(溴 化乙錠）染色顯示馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0011] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟B中，所述PCR擴(kuò)增的程序是：94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，5(rc退火lmin， 72°c延伸I. 5min，其中，變性、退火和延伸三個(gè)步驟循環(huán)35 次，72°C最后一步延伸10min，10°C保存。
[0012] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述PCR擴(kuò)增的體系為20ul，包括：10XPCR含Mg2+ 的 Buffer 2.0ul，2.5mM 的 dNTP 0.5ul，10pmol/ul 每條專用引物 lul，2.5U/ul 的 Taq 酶 0· 4ul，50ng/ul 的 DNA 模板 1.0 ul，ddH20 補(bǔ)足。
[0013] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述馬鈴薯的基因組DNA來(lái)自馬鈴薯植株的幼嫩葉 片。
[0014] 利用所述的方法得到的馬鈴薯DNA指紋圖譜也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述的專用引物在獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的試劑盒，所述試劑盒還有如上所 述的SEQ ID N0:1~7專用引物。
[0017] 采用本發(fā)明的專用引物和本發(fā)明的方法獲得的馬鈴薯DNA指紋圖譜多態(tài)性高、指 紋豐富、重復(fù)性好，在提高馬鈴薯選擇育種的準(zhǔn)確性和效率，縮短育種周期，以及馬鈴薯的 分子標(biāo)記輔助育種中發(fā)揮重要作用。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物Pl獲得的馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0019] 圖2為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物P2獲得的馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0020] 圖3為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物P3獲得的馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0021] 圖4為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物P4獲得的馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0022] 圖5為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物P5獲得的馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0023] 圖6為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物P6獲得的馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0024] 圖7為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物P7獲得的馬鈴薯的DNA指紋圖譜。
[0025] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例2的9份馬鈴薯品種的聚類樹狀圖。
[0026] 圖中，M代表DNA Marker DL2000,從上到下條帶大小依次為2000bp、1000bp、 750bp、500bp、250bp和IOObp ;編號(hào)1-9分別對(duì)應(yīng)中薯11號(hào)、中薯7號(hào)、中薯14號(hào)、費(fèi)烏瑞 它、中薯8號(hào)、冀張薯8號(hào)、中薯13號(hào)、中薯6號(hào)、中薯17號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0028] 以下實(shí)施例中所用的9個(gè)馬鈴薯品種如下：
[0029] 1.中薯11號(hào)、2.中薯7號(hào)、3.中薯14號(hào)、4.費(fèi)烏瑞它、5.中薯8號(hào)、6.冀張薯8 號(hào)、7.中薯13號(hào)、8.中薯6號(hào)、9.中薯17號(hào)。
[0030] 以下實(shí)施例中所用到的馬鈴薯樣品均源自于廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作 物研宄所。
[0031] 實(shí)施例1利用專用引物獲取馬鈴薯的DNA指紋圖譜
[0032] 操作流程：提取馬鈴薯基因組DNA - PCR擴(kuò)增一瓊脂糖凝膠電泳一EB染色一獲得 清晰DNA指紋圖譜一統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
[0033] 具體方法和過(guò)程如下：
[0034] UDNA 提取
[0035] 采用改良具體CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取馬鈴薯樣本的DNA。
[0036] 包括以下分步驟：
[0037] (1)取新鮮馬鈴薯嫩葉，每個(gè)品種取0. 3-0. 5g，用剪刀剪碎，放入研缽中并在研缽 中加入Ig的PVP (聚乙烯吡咯烷酮），分多次倒入足量的液氮，將葉片樣品充分研磨成粉末 狀。
[0038] (2)將全部粉末樣品轉(zhuǎn)移到事先加入了 1.0 mlCTAB提取液且經(jīng)過(guò)65°C預(yù)熱的2ml 離心管中，再加入20 μ 1 β -巰基乙醇，于65°C水浴鍋中溫浴60min，期間上下充分顛倒混 勻，以便DNA充分析出。
[0039] (3)在4°C冷凍離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速為12000rpm離心10min后除去底部殘?jiān)?，吸取?清液到另外一支2ml干凈的離心管，并在上清液中加入0. 5 μ 1的RNaseA (核糖核酸酶A)， 上下充分顛倒混勻，靜置5min。
[0040] (4)加入與上清液等體積的氯仿抽提，上下充分顛倒混勻，靜置5min，然后在冷凍 離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速為12000rpm離心10min。
[0041] (5)吸取上清液并加入與上清液等體積且事先在-40°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇于_40°C 冰箱中沉淀30min，