蛋白多肽類藥物n端定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白多肽類藥物N端定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚乙二醇（PEG)是一種用途極其廣泛的人工合成高分子化合物，主要應(yīng)用于生物 醫(yī)藥、化工、食品、材料科學(xué)等眾多領(lǐng)域。PEG易溶于水和有機(jī)溶劑，具有很好的理化特性和 生物相容性。在生物醫(yī)藥中，PEG因具有兩親性和良好的安全性、生物相容性，且無活性、也 無毒副作用，故作為輔料被廣泛應(yīng)用于藥物制劑以及藥物的緩釋、靶向研宄，還可以通過共 價(jià)連接于蛋白質(zhì)或多肽以改善蛋白、多肽類藥物的生物化學(xué)特性和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，甚至用于 小分子藥物的修飾。大量研宄表明，經(jīng)過PEG修飾的多肽與蛋白類藥物抗原性明顯降低或 消除，穩(wěn)定性增加，藥物半衰期大為延長，療效更好。
[0003] 為了將聚乙二醇與藥物相連接，需要在PEG鏈的末端連接各種具有活性的官能基 團(tuán)。其中，聚乙二醇醛類衍生物（PEG醛）對蛋白質(zhì)N端氨基的定點(diǎn)修飾由于條件溫和、修 飾位點(diǎn)均一等優(yōu)勢而獲得了廣泛的應(yīng)用，且可用于大多數(shù)N端為非活性位點(diǎn)的蛋白多肽類 藥物的修飾，是目前最常用的PEG修飾劑之一。
[0004] 目前，報(bào)道的制備PEG醛的方法主要有氧化法和縮醛法。氧化法是通過直接氧化 PEG鏈的末端羥基而獲得，例如將氧氣加入至PEG和催化劑的混合物中氧化PEG鏈末端的羥 基為醛基，或者以MnO2等作為氧化劑直接氧化末端羥基，但是在大多數(shù)情況下，這些氧化條 件容易導(dǎo)致PEG鏈的分解?？s醛法是通過在PEG鏈末端引入縮醛基團(tuán)隨后水解而獲得，但 是這種方法所用的反應(yīng)物原料較為昂貴而不適于商業(yè)化。
[0005] 另外現(xiàn)有的很多PEG修飾劑尤其是PEG醛類衍生物由于具有活性基團(tuán)，其穩(wěn)定性 較差，為了保證使用時(shí)的修飾效率，往往需要很苛刻的儲存條件，一旦儲存不當(dāng)，不僅嚴(yán)重 影響對蛋白多肽類藥物的修飾效率，而且影響整個(gè)生產(chǎn)工藝，給該項(xiàng)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化帶來很 多不確定因素。例如，聚乙二醇乙醛具有較高的反應(yīng)活性，在制備和儲存中極易發(fā)生羥醛縮 合反應(yīng)而導(dǎo)致副產(chǎn)物，產(chǎn)品質(zhì)量和儲存使用均難以得到有效控制，因此，未能得到很好的開 發(fā)和利用。中國專利CN200610099081. 0公開了用酰胺鍵取代烷氧基類型的基團(tuán)，使聚乙二 醇乙醛類衍生物具有了較高的穩(wěn)定性，但是該衍生物仍然具有活性較高的醛基而存在不穩(wěn) 定因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種能夠得到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的 聚乙二醇化蛋白多肽類藥物的蛋白多肽類藥物N端定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的蛋白多肽類藥物N端定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方 法，包括如下步驟：
[0008] (1)將PEG的端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩幕鶊F(tuán)得到PEG活性中間體，然后用PEG活性 中間體與具有鄰羥基、α-羥基酸、β-氨基醇或α-氨基酮結(jié)構(gòu)的小分子化合物反應(yīng)獲得 聚乙二醇中間體，所述聚乙二醇中間體的結(jié)構(gòu)式①或②如下：
[0009]
[0010] 其中，η為10~3000的整數(shù)，m為0~5的整數(shù)；k為2~8的整數(shù)，表示聚乙二 醇鏈的數(shù)目；
[0011] R為羥基、烷氧基、芳烷氧基，或者是氨基、羧基、氰基、鹵素、環(huán)氧化物、馬來酰亞 胺、吡啶基二硫化物、對甲苯磺酸酯、甲基磺酸酯、對硝基苯碳酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、 N-琥珀酰亞胺基氧、磺基-N-琥珀酰亞胺基氧、馬來酰亞胺基、1-苯并三唑基氧、1-咪唑基 氧、對硝基苯基氧的一種或多種；
[0012] X為醚鍵、硫醚鍵、氨基鍵、酰胺鍵、酯鍵、硫代酯鍵、碳酸酯鍵、氨基甲酸酯鍵、硫脲 鍵的一種或多種組成的連接基團(tuán)，或者是具有雙功能官能團(tuán)的連接基團(tuán)；
[0013] Y為聚乙二醇中間體的末端基團(tuán)，具有鄰羥基、α -羥基酸、β-氨基醇或α -氨基 酮結(jié)構(gòu)；
[0014] Z為連接多個(gè)聚乙二醇鏈的小分子連接基團(tuán)，具有多個(gè)活性基團(tuán)，包括蘋果酸、檸 檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、寡聚氨基酸的一種或多種；
[0015] (2)將聚乙二醇中間體用氧化劑氧化為末端具有活性醛基的聚乙二醇醛類衍生 物，而后用于蛋白多肽類藥物N端的定點(diǎn)聚乙二醇修飾，經(jīng)還原劑的還原胺化作用即可獲 得穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的聚乙二醇化蛋白多肽類藥物，上述將聚乙二醇活性修飾劑的制備與其對蛋白 多肽類藥物的修飾需前后緊密銜接。
[0016] 所述氧化劑為高碘酸或其鹽；所述還原劑為氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉。即通過高 碘酸氧化和氰基硼氫化鈉還原胺化兩個(gè)步驟完成對蛋白多肽類藥物N端氨基的修飾，將聚 乙二醇中間體氧化后無需繁瑣的后處理操作即可直接或是經(jīng)過簡單的超濾、透析等方法除 去小分子雜質(zhì)后用于蛋白多肽類藥物的聚乙二醇修飾，因此，該方法將聚乙二醇活性修飾 劑的制備與其對蛋白多肽類藥物的修飾這兩個(gè)工藝進(jìn)行緊密銜接。
[0017] 在合成聚乙二醇中間體時(shí)，所述PEG活性中間體與小分子之間的連接鍵是醚鍵、 硫醚鍵、氨基鍵、酰胺鍵、酯鍵、硫代酯鍵、碳酸酯鍵、氨基甲酸酯鍵或硫脲鍵的一種或多種。
[0018] 所述PEG活性中間體上的活性基團(tuán)包括氨基、羧基、對硝基苯碳酸醋、磺酸酯（優(yōu) 選甲基磺酸酯和對甲基苯磺酸酯）、膦酸酯（三苯基膦酸酯）、氰基、異氰酸酯、異硫氰酸酯、 硝酸酯、亞硝酸酯、鹵素（優(yōu)選氯和溴）、硫酸酯、鹵代硫酸酯、硝酸酯、鹵代亞硫酸酯、N-琥 珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基的一種或多種。所述PEG活性中間體是兩端具有相同或不同功 能基團(tuán)的PEG活性中間體，或是單端封閉的PEG活性中間體。這里優(yōu)選為單甲氧基聚乙二 醇（mPEG)。
[0019] 所述小分子化合物包括3-氨基-1，2-丙二醇、3-氯-1，2-丙二醇、3-溴-1，2-丙 二醇、2, 3-二羥基丙酸、3-巰基-1，2-丙二醇、二硫蘇糖醇、氨基葡萄糖、半乳糖胺、葡萄糖 酸、絲氨酸、蘇氨酸、異絲氨酸、3-氨基-2-羥基己酸、4-氨基-5-羥基戊酸、2-氨基-3-羥基 戊酸、2-氨基-3-羥基-3-甲基丁酸、4-氨基-3-羥基丁酸、3-氨基-4-羥基丁酸、1，4-二 胺-2- 丁醇、4-氨基-2-羥基丁酸、酒石酸的一種或多種。
[0020] 上述聚乙二醇中間體可以是直鏈、雙鏈、多鏈或者星形、樹形、分叉形結(jié)構(gòu)的聚乙 二醇衍生物，該中間體在PEG鏈的末端引入了鄰羥基、α -羥基酸、β -氨基醇或α -氨基酮 等結(jié)構(gòu)，可被高碘酸及其鹽氧化而獲得相應(yīng)結(jié)構(gòu)的聚乙二醇醛類衍生物，該氧化反應(yīng)所用 溶劑為水，條件溫和，不會(huì)導(dǎo)致PEG鏈的分解，且反應(yīng)可以定量完成。顯而易見的是，上述聚 乙二醇中間體相對于其氧化產(chǎn)物聚乙二醇醛類衍生物具有更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，有利于儲存?zhèn)?用。
[0021] 上述方法的整個(gè)工藝流程均在水溶液中進(jìn)行，條件溫和、操作簡便，且所用試劑來 源方便、廉價(jià)易得，因此，本發(fā)明所涉及的蛋白多肽類藥物N端定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方法被 認(rèn)為是一種適合于商業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)型方法。
[0022] 本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)勢：
[0023] 1.所制備的聚乙二醇中間體相對于其氧化產(chǎn)物聚乙二醇醛類衍生物要更加穩(wěn)定， 有利于儲存?zhèn)溆?；該中間體可以通過比現(xiàn)有方法更加經(jīng)濟(jì)、簡單的方法來獲得具有修飾活 性的聚乙二醇醛類衍生物。
[0024] 2.通過氧化-還原胺化法對蛋白多肽類藥物N端定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方法，將聚 乙二醇中間體的活化（即聚乙二醇醛類衍生物的制備）與其對蛋白多肽類藥物的修飾這兩 個(gè)工藝進(jìn)行緊密銜接，不僅可避免很多聚乙二醇醛類衍生物因儲存不當(dāng)容易失效的問題， 而且是一種短周期、低成本、高效率的聚乙二醇化新技術(shù)。
【附圖說明】
[0025] 圖1為聚乙二醇中間體mPEG20000-Ser經(jīng)氧化-還原胺化法對尿酸酶的聚乙二醇 修飾的SDS-PAGE的結(jié)果；
[0026] 圖中：A為碘液染色的結(jié)果，B為考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果；
[0027] 1 為蛋白 Marker，分子量為 14. 0、25· 0、30· 0、40· 0、50· 0、70· 0 和 100kD，
[0028] 2為未被PEG修飾的尿酸酶，3為經(jīng)PEG修飾的尿酸酶。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0030] 實(shí)施例1 :
[0031] 本實(shí)施例的蛋白多肽類藥物N端定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方法，包括如下步驟：
[0032] (1)將PEG的端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩幕鶊F(tuán)得到PEG活性中間體，然后用PEG活性 中間體與具有鄰羥基、α-羥基酸、β-氨基醇或α-氨基酮結(jié)構(gòu)的小分子化合物反應(yīng)獲得 聚乙二醇中間體；具體本實(shí)施例中采用的PEG活性中間體由單端封閉的PEG的端羥基轉(zhuǎn)變 為活性更高的基團(tuán)而制得。本實(shí)施例中選為單甲氧基聚乙二醇（mPEG5000,平均相對分子量 為5000)。將mPEG5000的端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)閷ο趸教妓狨カ@得PEG活性中間體，然后與小分 子化合物4-氨基-2-羥基丙酸進(jìn)行反應(yīng)得到聚乙二醇中間體mPEG5000-羥基酸，其結(jié)構(gòu)式 為
其中η平均為113，m為2, R為甲 氧基，X為氨基甲酸酯鍵，Y為α -羥基酸結(jié)構(gòu)。
[0033] (2)將聚乙二醇中間體mPEG5000-羥基酸用高碘酸鈉氧化為末端具有活性醛基的 聚乙二醇醛類衍生物，而后用于蛋白多肽類藥物N端的定點(diǎn)聚乙二醇修飾，經(jīng)氰基硼氫化 鈉的還原胺化作用即可獲得穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的聚乙二醇化蛋白多肽類藥物，上述將聚乙二醇活性 修飾劑的制備與其對蛋白多肽類藥物的修飾需前后緊密銜接。
[0034] I. 1聚乙二醇中間體mPEG5000-羥基酸的制備 [0035] 反應(yīng)式：
[0036]
[0037] 取0. 205g氯甲酸對硝基苯酯溶于IOmL無水二氯甲烷中，加入0. 123g 4-二甲氨 基吡啶（DMAP)攪拌，然后Ih內(nèi)滴加5g mPEG5000的二氯甲烷溶液（15mL)，室溫反應(yīng)至溶液 完全澄清。然后加入0. 56g 4-氨基-2-羥基丙酸，室溫反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束后，用lmol/L 鹽酸洗滌有機(jī)相3次，再用飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮后用 冷卻無水乙醚沉淀，抽濾后真空干燥，得白色粉末4. 32g，收率86. 4%。
[0038] 1. 2聚乙二醇中間體mPEG5000-羥基酸的氧化及其對胸腺素的修飾
[0039] 反應(yīng)式：
[0040]
[0041] 取上述產(chǎn)物mPEG5000-羥基酸適量，用0. lmol/L磷酸緩沖液（pH5. 0)配制 成5. 0 X ΙθΛιοΙ/L的溶液，再用0. lmol/L磷酸緩沖液（pH5. 0)分別配制胸腺素溶液 (I. 25X 10_4mol/L)、高碘酸鈉溶液（0. 05mol/L)和氰基硼氫化鈉溶液（0. 02mol/L)。
[0042] 取mPEG5000-羥基酸的溶液400 μ L，加入高碘酸鈉溶液8 μ L，室溫避光攪拌2h后 加入乙二醇5 μ