一種快速高效的篩查檢測(cè)食品過敏原的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于快速篩查食品中過敏原DNA的檢測(cè)技術(shù)，具體是指使用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)食品中多種過敏原物質(zhì)進(jìn)行快速篩選和鑒別，并可在第一輪反應(yīng)后確定食品中存在 過敏原成分，在第二輪反應(yīng)后確定過敏原的種類。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著食品行業(yè)的發(fā)展，食品種類的增多，食品過敏原的安全問題已經(jīng)成為 社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。食品過敏是由于食物或者食品添加劑引起的IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)的免 疫反應(yīng)，導(dǎo)致消化系統(tǒng)內(nèi)或者全身性的變態(tài)反應(yīng)。食品過敏原產(chǎn)生的過敏反應(yīng)包括呼吸系 統(tǒng)、腸胃系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肌肉和骨骼等不同形式的臨床癥狀，有時(shí)可能產(chǎn)生過敏 性休克（Anaphylactic Shock)，甚至危及生命。當(dāng)攝入了有關(guān)的食物，其中的食品過敏原可 能導(dǎo)致一系列的過敏反應(yīng)。過敏反應(yīng)通常會(huì)在一個(gè)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)，癥狀明顯，有時(shí)表現(xiàn)得會(huì)較 激烈，包括諸如嘔吐，腹瀉，呼吸困難，嘴唇、舌頭或咽喉腫脹，血壓驟降等。而因食品產(chǎn)生的 敏感或不適反應(yīng)卻可能在幾小時(shí)內(nèi)，甚至幾天后才會(huì)發(fā)生，主要的癥狀有：濕瘆，胃腸不適 綜合癥，偏頭痛，麻瘆，鼻炎，全身乏力，哮喘，關(guān)節(jié)炎，疼痛，兒童多動(dòng)癥等。為了能夠有效的 預(yù)防這些危害，保護(hù)人們的身體健康，建立食品過敏原的快速、大量的檢測(cè)方法迫在眉睫。
[0003] 目前，人們已經(jīng)發(fā)明了很多種方法來檢測(cè)食物中的過敏原成分，但仍然有許多問 題需要解決。食品過敏原成分的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要分為蛋白檢測(cè)和DNA檢測(cè)兩種。蛋白檢 測(cè)包括免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等免疫學(xué)方法，而DNA檢測(cè)主要是利用PCR技術(shù)來進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)。在實(shí)際操作中蛋白檢測(cè)方法在食物成分復(fù)雜的情況下干擾太大，受食物基質(zhì)影響較 大，所以PCR技術(shù)在過敏原檢測(cè)上具有很大的優(yōu)勢(shì)。
[0004] 多年來，利用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)，不僅需要消耗大量的時(shí)間和人力，而且也造成了試 劑的浪費(fèi)，使檢測(cè)的成本居高不下。而近些年來，人們也發(fā)明了許多新技術(shù)，比如利用免疫 分析方法來對(duì)多種過敏原進(jìn)行檢測(cè)，或者利用生物芯片的方法來實(shí)現(xiàn)大量快速的檢測(cè)，等 等。這些方法都是為了提升我們?cè)谶^敏原檢測(cè)上的效率，但是現(xiàn)在的問題是有的方法可以 快速、高效的檢測(cè)，但是成本太高，比如生物芯片法。有的成本低，然而檢測(cè)的周期過長(zhǎng)，所 以為了獲得一種快速、高效和低成本的過敏原檢測(cè)方法，我們?cè)谶M(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)比較、分 析后，終于找到了一種通過改進(jìn)優(yōu)化傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR的方法，來解決上述的問題。
[0005] 以往的熒光定量PCR法，通常單次單管反應(yīng)只能檢測(cè)一種或少量幾種過敏原成 分，而在一種食品中往往含有多種過敏原成分，為了確定可能含有的過敏原成分，通常進(jìn)行 很多次檢測(cè)來排除過敏原才能得到最后的結(jié)果。這種單管單次反應(yīng)檢測(cè)一種或幾種過敏 原成分的方法不僅檢測(cè)周期長(zhǎng)、試劑消耗多，而且檢測(cè)范圍窄。為了解決這個(gè)問題，在經(jīng)過 一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，終于找到了快速的篩選檢測(cè)方法，能夠一次性大量的完成多種過敏原 成分的篩選檢測(cè)，不僅縮短了檢測(cè)周期，而且節(jié)省了試劑消耗，使成本大大的降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立一種能夠同時(shí)高效快速篩選檢測(cè)多種過敏原 成分的方法。
[0007] 為此，本發(fā)明公開如下技術(shù)方案：
[0008] (1)稱取Ig(最多2g)粉碎后材料放入50mL離心管中（如樣品含水分太多應(yīng)先考 慮烘干再磨碎，醬類粘稠樣品應(yīng)先濃縮離心，取沉淀物）；
[0009] (2)加入預(yù)熱的IOmLCTAB抽提裂解緩沖液（使用前加入20 μ L蛋白酶Κ、20 μ L RNA、200 μ L β -巰基乙醇），振蕩懸浮后65°C溫浴lh，期間不斷晃動(dòng)，冷卻至室溫后，5000g 離心10min ;
[0010] (3)取上清950 μ L加入2mL離心管中，加入等體積氯仿異戊醇（24 : 1)輕柔混勻 靜置 5min，12000rpm 離心 15min ;
[0011] (4)取上清750 μ L加入2mL離心管中，加入等體積氯仿異戊醇（24 : 1)輕柔混勻 靜置 5min，12000rpm 離心 15min ;
[0012] (5)取上清500 μ L加入I. 5mL離心管中，加入300 μ L異丙醇，50 μ L乙酸鉀溶液， 輕輕顛倒混勾，室溫靜置30min，12000rpm離心15min，棄上清；
[0013] (6)加入I. 0mL70%乙醇溶液，將沉淀懸浮浸泡，并將離心管傾斜，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)圈 后室溫靜置2min，12000rpm離心10min，棄上清，如沉淀多重復(fù)此步驟一次；
[0014] (7)小心棄去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100 μ L ddH20,65°C溶解DNA。
[0015] (8)將提取的DNA進(jìn)行多重?zé)晒釶CR。
[0016] 用于熒光PCR快速檢測(cè)過敏原成分的16種特異性引物：
[0017] NO :1雞蛋引物；NO :2牛奶引物；NO :3花生引物；NO :4蕎麥引物；NO :5腰果引物； NO :6開心果引物；NO :7胡桃引物；NO :8胡蘿卜引物；NO :9榛果引物；NO : 10杏仁引物；NO : 11小麥引物；N0:12大豆引物；N0:13芝麻引物；N0:14蝦蟹引物；N0:15魚引物；N0:16芹 采引物，具體引物序列詳見下表：
[0018] 引物列表：
[0019]
[0020]
[0021]
[0022] 用上述各組引物和第一輪探針進(jìn)行第一輪多重PCR，以確定樣品中是否含有過敏 原成分，具體探針標(biāo)記如下：N0 :1-N0 :4探針用FAM通道；NO :5-N0 :8探針用VIC通道；NO : 9-N0 :12探針用Red610通道；NO :13-N0 :16探針用Cy5通道。
[0023] PCR體系的配制：分別將待檢測(cè)的16種過敏原的上游引物、下游引物和第一輪探 針以一定比例混勻。50yLPCR體系如下：
[0024] 1) 2XPCR 緩沖液 25μL 2) 混合上游引物 5pL 3) 混合下游引物 5pL 4) 混合探針 5pL 5) 待測(cè) DNA 2μΙ, 6) ddH20 8pL
[0025] (9)對(duì)熒光PCR結(jié)果進(jìn)行分析，在Ct < 35時(shí)，如果某個(gè)通道出現(xiàn)了陽性擴(kuò)增信號(hào)， 則將該通道內(nèi)的4種過敏原成分分別使用4種熒光標(biāo)記探針（第二輪探針）再次進(jìn)行熒光 PCR擴(kuò)增，就可確定具體過敏原成分。使用本方法可以檢測(cè)含量為0. 1%的過敏原成分。
[0026] 有益效果：本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)一次性快速16種過敏原成分的篩選檢測(cè)，節(jié)省試劑， 環(huán)保高效。
【附圖說明】
[0027] 圖1.第一輪熒光PCR結(jié)果
[0028] 圖2.第二輪熒光PCR結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0030] 實(shí)施例：
[0031] (1)待測(cè)樣品DNA的提取：
[0032] A.分別稱取兩份含0. 1 %花生成分的玉米粉樣品lg，放入50mL離心管中；
[0033] B.加入預(yù)熱的IOmLCTAB抽提裂解緩沖液（已加入20 μ L蛋白酶K和20 yL RNA);
[0034] C.振蕩懸浮后65°C溫浴lh，期間不斷晃動(dòng)，冷卻至室溫后，5000g離心10min ;
[0035] D.取上清950 yL加入2mL離心管中，加入等體積氯仿異戊醇（24 : 1)輕柔混勻 靜置 5min，12000rpm 離心 15min ;
[0036] E.取上清750 μ L加入2mL離心管中，加入等體積氯仿異戊醇（24 : 1)輕柔混勻 靜置 5min，12000rpm 離心 15min ;
[0037] R取上清500 μ L加入L 5mL離心管中，加入300 μ L異丙醇，50 μ L乙酸鉀溶液， 輕輕顛倒混勾，室溫靜置30min，12000rpm離心15min，棄上清；
[0038] G.加入I. 0mL70%乙醇溶液，將沉淀懸浮浸泡，并將離心管傾斜，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)圈后 室溫靜置 2min，12000rpm 離心 IOmin ;
[0039] Η·干燥 DNA 沉淀，加入 50 μ L ddH20,65°C溶解 DNA。
[0040] (2)待測(cè)樣品DNA的多重?zé)晒釶CR :
[0041] A.配置50 μ L PCR反應(yīng)體系：
[0042] 1) 2xPCR 緩沖液 25μL 2) 上游混合引物 5pL 3) 下游混合引物 5μL 4) 混合探針 5μL
[0043] 5) 待測(cè) DNA 2pL 6) ddH20
[0044] Β·將配制完成的PCR反應(yīng)管放入Roche LightCycler96熒光PCR儀中，PCR擴(kuò)增 條件如下：
[0045]
[0046] C.熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果分析：
[0047] 通過分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FAM通道出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線。Ct值為23,如圖1。將 FAM通道中的4種過敏原成分使用第二輪探針和相應(yīng)引物按一定比例混合，進(jìn)行第二輪熒 光 PCR0
[0048] (3) FAM通道中4種過敏原熒光PCR :
[0049] A. PCR反應(yīng)體系如下：
[0050] 1) 2XPCR 緩沖液 IOpL 2) 上游混合引物 2pL 3) 下游混合引物 2pL 4) 混合探針 2pL 5) 待測(cè) DNA 6) CidH2O 3 μι
[0051] 將配制完成的PCR反應(yīng)管放入Roche LightCycler96熒光PCR儀中，PCR擴(kuò)增 條件如下：
[0052]
[0053] C.熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果分析：
[0054] 對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)花生過敏原成分，Ct值為24,如圖2。
[0055] 只通過兩次單個(gè)反應(yīng)管實(shí)驗(yàn)，便可以篩選檢測(cè)出未知樣品中的過敏原成分為花 生。不僅節(jié)約了大量的時(shí)間，而且也減少了試劑成本。
[0056] 上述實(shí)施例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對(duì)本發(fā)明專利的限制；應(yīng)當(dāng)指出的是， 對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思范圍的情況下，還可以作出各種變化和 變型，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；因此，凡跟本發(fā)明權(quán)利要求范圍所做的均等變化與修 飾，均應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求的覆蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速高效的篩查檢測(cè)食品過敏原的方法，其特征包括如下步驟： (1) 將待檢測(cè)過敏原根據(jù)熒光定量PCR儀通道數(shù)量分為幾組，且每組包含的待測(cè)過敏 原數(shù)量與熒光定量PCR儀通道數(shù)也相對(duì)應(yīng)，并設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)通道的檢測(cè)探針； (2) 將待測(cè)過敏原引物和探針按一定比例混合，加入樣品DNA，TaqDNA聚合酶，反應(yīng)緩 沖液，dNTP和水，使體積達(dá)到50yL; (3) 按照優(yōu)化后的PCR條件進(jìn)行PCR反應(yīng)； (4) 根據(jù)第一輪PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的通道包含的待測(cè)過敏原種類進(jìn)行第 二輪熒光PCR檢測(cè)以確定過敏原成分。2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其檢測(cè)范圍，根據(jù)熒光PCR通道的數(shù)量不限于16種。3. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其檢測(cè)種類，不限于本發(fā)明中列舉的16種過敏原成 分。4. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于，PCR體系中各檢測(cè)引物的濃度為 0? 1-1ymol/L，各探針的濃度為 0? 05-0. 5ymol/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)中退火延伸溫度為42-72°C。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速高效的篩查檢測(cè)食品過敏原的方法，并按此方法對(duì)生活中常見的16種過敏原成分進(jìn)行了同時(shí)篩選檢測(cè)。16種過敏原成分包括：雞蛋、牛奶、花生、蕎麥、腰果、開心果、胡桃、胡蘿卜、榛果、杏仁、小麥、大豆、芝麻、蝦蟹、魚、芹菜。包括下列步驟：提取樣品的DNA，將樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，利用PCR儀的多通道，一次性單個(gè)反應(yīng)管同時(shí)篩選檢測(cè)16種過敏原成分，并可在兩輪PCR后確定過敏原成分。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：一次性快速篩選檢測(cè)多種過敏原，即可以節(jié)省大量的時(shí)間，也可以減少試劑的消耗，降低成本。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104894278
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510353251
【發(fā)明人】宋薇, 張斌
【申請(qǐng)人】杭州譜尼檢測(cè)科技有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年6月19日