低丙烯酰胺食品的制作方法
【專利說明】低丙烯酰胺食品
[0001] 本申請為申請?zhí)枮?00680043287. X的分案申請，要求2005年9月20日的優(yōu)先權(quán)。
[0002] 優(yōu)先權(quán)申請的交叉參考
[0003] 本非臨時美國專利申請要求享有2005年9月20日提交的美國臨時申請系列號 60/718, 335和2006年7月28日提交的美國臨時申請系列號60/833, 788的優(yōu)先權(quán)，二者的 內(nèi)容在這里引作參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及在植物中，例如在這些植物的富含淀粉的貯藏器官中下調(diào)和上調(diào)基因 的遺傳方法，以降低在這些器官的加工相關(guān)的加熱后積累的丙烯酰胺的水平。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 加熱含有游離天冬酰胺和還原糖的食品，會導(dǎo)致丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺是在 世界范圍內(nèi)用于合成聚丙烯酰胺的工業(yè)化學(xué)物質(zhì)。暴露于該反應(yīng)性化合物，會導(dǎo)致在組織 中的快速吸收和均勻分布（Barber等人，Neurotoxicology 2001,22,341-353)。在嚙齒動 物中，高濃度丙烯酰胺（>2mg/kg體重）的毒理學(xué)作用包括神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、生殖力減弱和癌 癥（Friedman, J. Agric. Food Chem.，2003, 51，4504-4526) 〇
[0007] 還已知職業(yè)性暴露于高水平的丙烯酰胺會升高人類的神經(jīng)毒性的發(fā)病率（Lo Pachin, Neurotoxicology, 2004, 25, 617-630)，但是沒有記載丙稀酰胺對人類生殖的影 響或致癌作用。丙烯酰胺和它的氧化代謝物環(huán)氧丙酰胺會與血紅蛋白的氨基端纈氨酸 反應(yīng)，形成加合物。加合物形成的程度是暴露水平的良好標(biāo)志物，且暗示著接近100 μ g 的日攝入量（Tareke 等人，J. Agric. Food Chem. ,2002, 50, 4998-5006)。盡管最初認(rèn)為 飲用水、化妝品和吸煙代表著丙稀酰胺背景暴露的唯一主要來源（Bergmark, Chem. Res. Toxicol.，1997, 10, 78-84)，最近的分析表明，油炸的和烘烤的淀粉食品的消耗，構(gòu)成約 36 % 的丙稀酰胺攝入（Becker 和 Pearson, Dietary habits and nutrient intake in Swedenl997-98〇 Riksmaten 1997-98, 1999)〇
[0008] 飲食丙烯酰胺主要源自熱誘導(dǎo)的游離氨基酸天冬酰胺的氨基和還原 糖的羰基之間的反應(yīng)（Mottram 等人，Nature, 2002, 419, 448-449 ;Stadler 等 人，Nature, 2002, 419, 449-450)。新鮮的馬鈴薯塊莖含有非常高水平的天冬酰胺，但是相對 低濃度的還原糖葡萄糖和果糖。但是，在冷藏期間，通過表達(dá)冷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化酶（該酶催化蔗 糖向葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)化），積累還原糖。
[0009] 以前嘗試限制丙烯酰胺在淀粉食品中的積累，沒有產(chǎn)生實(shí)用的且節(jié)省成本的應(yīng) 用?，F(xiàn)有技術(shù)的第一種方法是基于調(diào)整加工參數(shù)，例如表面/體積比，溫度和油炸時間。盡 管這些方法的應(yīng)用可能在減少丙烯酰胺的積累方面是部分有效的，但它會通過減輕顏色、 改變形狀和改變口味和質(zhì)地，改變最終食品的感觀特征。這些改變是不希望的。
[0010] 第二種方法是基于，在加熱前用天冬酰胺酶（EC 3. 5. I. 1)或glurninase(EC 3. 4. 1. 2)溫育部分加工的食品（參見世界專利申請2004/030468 A3和世界專利申請 2004/026042 Al)。該方法是昂貴的，僅能容易地應(yīng)用于可以與所述酶容易地混合的材料， 例如面粉。 toon] 第三種方法將天冬酰胺競爭劑例如甘氨酸加入部分加工的食品中（關(guān)于馬鈴薯 塊莖的世界專利申請2005/025330 Al,關(guān)于烤制咖啡豆的美國專利申請2004/0081724 A1，關(guān)于可可豆的世界專利申請2005/004620 A1，關(guān)于基于玉米的食品的世界專利申請 2005/004628A1)。該方法僅是部分有效的，需要高濃度的添加劑，且因?yàn)槌杀咎叨y以廣 泛應(yīng)用。
[0012] 第四種方法在加熱前將還原糖改變酶（包括醛糖還原酶）加入食品中（參見美國 專利6989167)。該方法不是非常有效，且因?yàn)槌杀咎叨y以廣泛應(yīng)用。
[0013] 第五種方法在加熱前給食品包被選自下述的試劑：含有氨基酸的化合物，氨基酸 鹽，氨基酸酰胺，氨基酸酯，和其混合物（參見世界專利申請2005/077203A3)。該方法僅 是部分有效的，且因?yàn)槌杀咎叨y以廣泛應(yīng)用。
[0014] 第六種方法是基于，選擇含有非常低水平的還原糖和天冬酰胺的種質(zhì)。這樣的種 質(zhì)的可用性，使得將"低糖"和"低天冬酰胺"性狀漸滲到食品工業(yè)可廣泛使用的品種中成 為可能。但是，尚未鑒定出低天冬酰胺作物植物。即使將來發(fā)現(xiàn)了這樣的種質(zhì)，將希望的性 狀漸滲到商業(yè)化品種中也需要至少15-20年。
[0015] 第七種方法遺傳地修飾作物，以降低還原糖水平。該方法是基于下調(diào)參與淀粉降 解的基因，例如馬鈴薯淀粉相關(guān)的Rl和磷酸化酶-L基因的表達(dá)（參見，例如，美國專利申 請2003/0221213 Al)。盡管是部分有效的，從修飾的作物加工的食品仍然含有對照產(chǎn)品的 約三分之一的丙烯酰胺水平。
[0016] 因而，非常需要降低從淀粉作物得到的加工食品中的丙烯酰胺水平的方法。這樣 的方法應(yīng)當(dāng)是節(jié)省成本的，不會降低食品的感觀特征。本發(fā)明提供了這樣的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種降低加工食品中的丙烯酰胺水平的新策 略，所述加工食品通過加熱作物的淀粉組織來得到。獨(dú)特地，該策略采用基因工程的方法， 使作物植物的淀粉組織中的天冬酰胺水平降低了至少50 %。
[0018] 在一個實(shí)施方案中，通過降低天冬酰胺生物合成的水平和/或增加天冬酰胺代謝 的水平，降低作物植物的淀粉組織中的天冬酰胺水平。任一種機(jī)理都可能需要下調(diào)或上調(diào) 直接或間接參與每個天冬酰胺途徑的基因。在一個方面，參與天冬酰胺代謝的基因編碼天 冬酰胺酶。在一個方面，參與天冬酰胺生物合成的基因編碼天冬酰胺合成酶。
[0019] 在另一個方面，間接參與天冬酰胺途徑的基因選自：谷氨酰胺合成酶（GS)基因， 硝酸還原酶（NR)基因，14-3-3基因，和己糖激酶（HXK)基因。
[0020] 在一個方面，通過降低參與天冬酰胺生物合成的至少一個基因的表達(dá)，降低天冬 酰胺生物合成的水平。
[0021] 在一個方面，通過向植物中導(dǎo)入表達(dá)盒，降低參與天冬酰胺生物合成的基因的表 達(dá)，所述表達(dá)盒從5'至3'包含，（i)啟動子，（ii)包含參與天冬酰胺代謝的至少一個基因 的至少一個片段的序列的至少一個拷貝，和任選地，（iii)第二個啟動子或終止子，其中所 述第一個和任選的第二個啟動子以趨同方向排列。
[0022] 在一個方面，用于降低參與天冬酰胺生物合成的基因的表達(dá)的表達(dá)盒含有參與天 冬酰胺代謝的基因的至少一個片段的序列的2個拷貝。
[0023] 在一個方面，所述2個拷貝排列為（i)反向重復(fù)序列或（ii)直接重復(fù)序列。
[0024] 在一個方面，參與天冬酰胺生物合成的基因分離自：馬鈴薯，野生馬鈴薯例如 Solanum phureja,甘薯，山藥，咖啡樹，可可樹，小麥，玉米，燕麥，高梁，或大麥，且 編碼天冬酰胺合成酶。
[0025] 在一個方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含與SEQ ID: 1所示序列的至少一個片段 具有至少70 %同一性的序列。
[0026] 在另一個方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含與SEQ ID: 2所示序列的至少一個片 段具有至少70 %同一性的序列。
[0027] 在一個方面，通過向植物中導(dǎo)入表達(dá)盒，實(shí)現(xiàn)參與天冬酰胺代謝的基因的超量表 達(dá)，所述表達(dá)盒從5'至3'包含，第一啟動子，參與天冬酰胺生物合成的基因，和終止子。
[0028] 在一個方面，參與天冬酰胺代謝的基因分離自：馬鈴薯，野生馬鈴薯例如Solanum phureja，甘薯，薯蕷，咖啡樹，可可樹，小麥，玉米，燕麥，高梁，或大麥，且編碼天冬 酰胺酶。
[0029] 在一個方面，所述天冬酰胺酶基因包含與SEQ ID:9, 10, 14, 15, 31，32,或33所示 序列具有至少70%同一性的序列。
[0030] 在另一個方面，所述天冬酰胺酶基因包含與SEQ ID: 14所示序列具有至少70%同 一"性的序列。
[0031] 在另一個方面，參與天冬酰胺生物合成的基因是谷氨酰胺合成酶或己糖激酶基 因。
[0032] 在一個方面，所述啟動子是下述基因的啟動子：（i)馬鈴薯顆粒結(jié)合的淀粉合酶 基因，（ii)馬鈴薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，（iii)馬鈴薯泛素-7基因，（iv)馬鈴薯塊 莖特異蛋白（patatin)基因，（V)馬鈴薯類黃酮單加氧酶基因。
[0033] 在一個方面，馬鈴薯顆粒結(jié)合的淀粉合酶基因的啟動子與SEQ ID NO:8的至少一 部分具有至少70%同一性，馬鈴薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的啟動子與SEQ ID N0:7的 至少一部分具有至少70%同一性，馬鈴薯泛素-7基因的啟動子與SEQ ID N0:21的至少一 部分具有至少70%同一性，馬鈴薯塊莖特異性蛋白基因的啟動子與SEQ ID N0:22的至少一 部分具有至少70%同一性，馬鈴薯類黃酮單加氧酶基因的啟動子與SEQ IDN0:13的至少一 部分具有至少70%同一性。
[0034] 在另一個方面，所述啟動子是在用于食品加工的淀粉作物的塊莖、根或種子中表 達(dá)的基因的啟動子。
[0035] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低食品中丙烯酰胺水平的方法，所述食品 通過加熱作物的組織并同時降低該組織中天冬酰胺和還原糖的水平來得到。在一個實(shí)施方 案中，所述組織是作物或植物的淀粉組織。
[0036] 在一個方面，通過下述方式實(shí)現(xiàn)天冬酰胺和還原糖水平的同時降低：（i)下調(diào)參 與天冬酰胺生物合成的基因的表達(dá)，或超量表達(dá)參與天冬酰胺代謝的基因，和（ii)下調(diào)參 與淀粉降解的至少一個基因的表達(dá)。
[0037] 在一個方面，通過向植物中導(dǎo)入表達(dá)盒，下調(diào)參與淀粉降解的基因的表達(dá)，所述表 達(dá)盒從5'至3'包含，（i)啟動子，（ii)包含參與淀粉降解的基因的至少一個片段的序列 的至少一個拷貝，和任選地，（iii)第二個啟動子或終止子，其中所述第一個和任選的第二 個啟動子以趨同方向排列。
[0038] 在一個方面，參與淀粉降解的基因選自：（i)淀粉-相關(guān)的Rl基因，和（ii)淀 粉-相關(guān)的磷酸化酶-L基因。
[0039] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過同時降低組織中天冬酰胺和還原糖的水 平，降低通過加熱作物的組織得到的食品中丙烯酰胺的水平并同時提高該食品的感官特征 的方法。在一個實(shí)施方案中，所述組織是作物或植物的淀粉組織。
[0040] 在一個方面，通過采用"多基因靶向"構(gòu)建體，實(shí)現(xiàn)同時降低，所述"多基因靶向"構(gòu) 建體包含第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含（i)可操作地連接到啟動子上的 天冬酰胺酶基因，或（ii)可操作地連接到啟動子上的天冬酰胺合成酶基因片段的至少一 個拷貝，所述第二表達(dá)盒包含DNA區(qū)段的至少一個拷貝，所述DNA區(qū)段含有可操作地連接到 啟動子上的Rl基因片段和磷酸化酶基因片段，其中所述第一和第二表達(dá)盒可以是相同的 表達(dá)盒。
[0041] 在一個實(shí)施方案中，植物包含用"多基因靶向"構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的至少一個細(xì)胞。 在另一個實(shí)施方案中，所述植物是具有塊莖的。在另一個實(shí)施方案中，所述具有塊莖的植物 是馬鈴薯植物。在另一個實(shí)施方案中，所述具有塊莖的植物含有穩(wěn)定摻入它的基因組中的 盒。
[0042] 在另一個方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)基因塊莖加工的產(chǎn)品，其中（a)轉(zhuǎn)基因塊莖的 至少一個細(xì)胞包含"多基因靶向"構(gòu)建體，且（b)所述產(chǎn)品具有比從相同植物品種的非轉(zhuǎn)基 因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的丙烯酰胺濃度。
[0043] 在另一個方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的產(chǎn)品，其中（a)轉(zhuǎn)基因塊莖的 至少一個細(xì)胞包含"多基因靶向"構(gòu)建體，（b)所述產(chǎn)品具有比從相同物種的非轉(zhuǎn)基因塊莖 生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的丙烯酰胺濃度，且（c)所述產(chǎn)品還表現(xiàn)出比從相同物種的非轉(zhuǎn)基因 塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的非酶性褐變速率。
[0044] 在另一個方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的產(chǎn)品，其中（a)轉(zhuǎn)基因塊莖的 至少一個細(xì)胞包含"多基因靶向"構(gòu)建體，（b)所述產(chǎn)品具有比從相同物種的非轉(zhuǎn)基因塊莖 生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的丙烯酰胺濃度，且（c)所述產(chǎn)品還表現(xiàn)出比從相同品種的非轉(zhuǎn)基因 塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的非酶性褐變速率，且（d)所述產(chǎn)品還表現(xiàn)出比從相同品種的非 轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品增強(qiáng)的感官特征。在一個實(shí)施方案中，所述可食用的植物產(chǎn)品 具有比從沒有根據(jù)本發(fā)明的方法修飾的植物生產(chǎn)的等同產(chǎn)品改善的感官特征。在一個實(shí)施 方案中，所述可食用的植物產(chǎn)品具有選自下述的至少一種改善的感官特征：外觀，風(fēng)味，香 氣，和質(zhì)地。
[0045] 在一個實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因塊莖是馬鈴薯。在另一個實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品是 炸薯?xiàng)l。在另一個實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品是馬鈴薯片。
[0046] 在另一個實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因塊莖是馬鈴薯，且所述轉(zhuǎn)基因塊莖產(chǎn)品在 4°C -12°C儲存約1-30周時，其葡萄糖水平比在與該轉(zhuǎn)基因塊莖相同儲存條件下儲存的相 同物種的非轉(zhuǎn)基因塊莖的葡萄糖水平的50%還低。
[0047] 在一個實(shí)施方案中，所述植物選自：馬鈴薯，玉米，咖啡，可可，和小麥。
[0048] 在另一個實(shí)施方案中，用選自下述的細(xì)菌株轉(zhuǎn)化所述植物：根癌農(nóng)桿菌，三 葉草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛葉桿菌，苜蓿中華根瘤菌和百脈根中慢生根瘤菌 (MesoRhizobium loti)〇
[0049] 在一個方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸序列，其包含編碼多肽的核酸序列，所 述多肽能降低植物中的天冬酰胺水平，并從而降低該植物的加工產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平。
[0050] 在一個實(shí)施方案中，所述核酸序列與選自SEQ ID NO:9, 10, 14, 15, 31，32,和33的 序列或其變體或片段具有至少70%同一性，且所述核酸編碼具有天冬酰胺酶活性的多肽。
[0051] 在另一個實(shí)施方案中，所述變體與SEQ ID N0:9, 10, 14, 15, 31，32,和33中的任 一個序列的序列同一性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %, 75 %,74%,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64%,63 %,62 %,61 % , 或 60%〇
[0052] 在另一個方面，提供了分離的多核苷酸序列，其包含編碼天冬酰胺酶的核酸序列， 所述天冬酰胺酶能降低植物中的天冬酰胺水平，并從而降低該植物的加工產(chǎn)品中的丙烯酰 胺水平。
[0053] 在另一個方面，本發(fā)明提供了具有降低的天冬酰胺酶表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，其 可以用于生產(chǎn)含有低丙烯酰胺含量的加工食品。
[0054] 在另一個方面，本發(fā)明提供了具有低丙烯酰胺含量的食品，其可以通過加工具有 降低的天冬酰胺含量的轉(zhuǎn)基因塊莖得到。
[0055] 基于美國食品藥品管理局?jǐn)?shù)據(jù)（www. cfsan. fda. gov/_ dms/acrydata. html)，在 大量快餐連鎖餐館中生產(chǎn)的典型炸薯?xiàng)l含有超過十億分之100份（PPb)的丙烯酰胺。這樣 的典型炸薯?xiàng)l中丙烯酰胺的平均量是404ppb，通過消耗炸薯?xiàng)l平均每日攝入的丙烯酰胺水 平是0.07微克/kg體重/天。結(jié)果，炸薯?xiàng)l代表著16%的丙烯酰胺總飲食攝入。烘箱烘烤 的薯?xiàng)l和由商業(yè)處理機(jī)生產(chǎn)的馬鈴薯片中丙烯酰胺的平均量分別是698ppb和597ppb。因 而，馬鈴薯-衍生的加工食品（包括炸薯?xiàng)l，烘箱烘烤的薯?xiàng)l，和馬鈴薯片）代表著38% 的丙烯酰胺總飲食攝入。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，在從本發(fā)明的特定品種的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的塊莖得到的炸薯?xiàng)l、烤 薯?xiàng)l或馬鈴薯片中存在的丙烯酰胺水平，比從相同品種的非轉(zhuǎn)基因植物得到的炸薯?xiàng)l、烤 薯?xiàng)l或馬鈴薯片中的丙烯酰胺水平低超過2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10 倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍，20倍，或超過20倍。
[0057] 以十億分之......份表示，從本發(fā)明的塊莖生產(chǎn)的炸薯?xiàng)l可以具有l(wèi)_20ppb，20-40p pb, 40_60ppb, 60_80ppb,或 80-100ppb 的丙稀酰胺。
[0058] 以十億分之……份表示，從本發(fā)明的塊莖生產(chǎn)的烘箱烘烤的薯?xiàng)l、馬鈴薯片或薯 餅（hash brown)可以具有 l-2〇ppb，2〇-40ppb，4〇-6〇ppb，6〇- 8〇ppb，8〇-100ppb, IOO-I2Opp b, 120-140ppb, 140-160ppb, 160-180ppb,或 180-200ppb 的丙烯酰胺。
[0059] 本發(fā)明不限于降低塊莖的油炸食品和馬鈴薯片產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平?？梢愿鶕?jù) 本發(fā)明處理其它食物，以降低丙烯酰胺水平。
[0060] 早餐谷類中的丙烯酰胺水平可以從約50-250ppb降低至低于40ppb的水平，優(yōu)選 降低至低于20ppb的水平。
[0061] 脆餅，如Dare Breton Thin Wheat Crackers和Wasa Original Crispbread Fiber Rye中的丙稀酰胺水平可以從約300_500ppb降低至低于IOOppb的水平，優(yōu)選降低至低于 50ppb的水平。
[0062] 巧克力，如Ghirardelli無糖可可或Hershey可可中的丙稀酰胺水平可以從約 300_900ppb降低至低于200ppb的水平，優(yōu)選降低至低于50ppb的水平。
[0063] 餅干中的丙烯酰胺水平可以從約50_200ppb降低至低于40ppb的水平，優(yōu)選降低 至低于20ppb的水平。
[0064] 咖啡粉中的丙烯酰胺水平可以從約175_350ppb降低至低于60ppb的水平，優(yōu)選降 低至低于30ppb的水平。
[0065] 小麥面包中的丙稀酰胺水平可以從約50_150ppb降低至低于30ppb的水平，優(yōu)選 降低至低于15ppb的水平。
[0066] 應(yīng)當(dāng)理解，許多因素會影響最終的食品中的丙烯酰胺水平。這些因素包括作物、品 種、生長條件、收獲的種子或塊莖的貯存條件、和加工變量，例如加熱穩(wěn)定、加熱時間、油炸 使用的油的類型和暴露的表面。
[0067] 本發(fā)明所述方法的應(yīng)用，會使丙烯酰胺水平降低至少約5%、至少約10%、至少 約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、 50%，至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90 %或超過約90%。
[0068] 附圖簡述
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