一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域；具體涉及一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌是一種好氧細菌，也是一種重要的工業(yè)菌種，已經(jīng)被廣泛的應用于畜牧、醫(yī)藥、植物病害防治等領(lǐng)域，具有廣泛的應用前景，顯示出巨大的社會效益和生態(tài)效益?？莶菅挎邨U菌微生態(tài)制劑絕大部分產(chǎn)品都是以活菌發(fā)揮作用的，有效的活菌數(shù)是衡量微生態(tài)制劑質(zhì)量的重要指標，產(chǎn)品中必須含有相當數(shù)量的活菌數(shù)才能發(fā)揮作用。但是微生態(tài)制劑隨著保存時間的延長，活菌數(shù)量不斷減少，在一定時期內(nèi)，其有效活菌數(shù)降低影響其使用效果。枯草芽孢桿菌因其獨特的營養(yǎng)體一一芽孢，使其具有抵抗熱、干燥、輻射、酸、堿等不良環(huán)境的生理特性，所以說芽孢的產(chǎn)生能延長其微生態(tài)制劑的保存期。然而，目前廣泛應用的活菌制劑由于芽孢形成的不穩(wěn)定，仍然普遍存在保存期短、活性不穩(wěn)定等缺點，給實際應用帶來很多困難。
[0003]在現(xiàn)階段的工業(yè)化生產(chǎn)中，由于便于控制影響培養(yǎng)的各個因素，使液態(tài)培養(yǎng)成為工業(yè)發(fā)酵的主要培養(yǎng)手段。然而，在液態(tài)培養(yǎng)中枯草芽孢桿菌產(chǎn)生芽孢的工藝條件不易控制，芽孢形成率低下，與此同時，發(fā)酵過程中常存在著發(fā)酵周期長、活菌數(shù)低等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明解決在枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵過程中芽孢形成相關(guān)工藝條件不易控制、芽孢形成率低，且發(fā)酵周期長、活菌數(shù)低的問題，實現(xiàn)枯草芽孢桿菌高密度培養(yǎng)的同時獲得95%以上的芽孢形成率；提供了一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明中一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法是按下述步驟進行的:一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法是按下述步驟進行的:
[0006]步驟一、菌種的活化:挑取斜面的單菌落菌種接入試管種子培養(yǎng)基，在30°C條件下以70r/min速度震蕩培養(yǎng)16h得到種子液，所述試管種子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化鈉、0.2% K2HPO4,0.2% CaCO3、余量為水，初始pH值為 7.2-7.5 ；
[0007]步驟二、搖瓶種子培養(yǎng):將種子培養(yǎng)基裝入搖瓶中，然后按2%接種量接入步驟一獲得的種子液，再在溫度30°C、速度為180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基配方與步驟一中所述的試管種子培養(yǎng)基相同；
[0008]步驟三、發(fā)酵:將發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，然后按1%接種量接入經(jīng)步驟二獲得的種子液，然后在溫度為30°C、pH值為7、溶氧控制在70%以上(通氣量一般控制在10-15L/min)、罐壓0.01?0.03MPa和攪拌速度為250?400r/min條件下攪拌發(fā)酵；
[0009]步驟四、當發(fā)酵至菌體的殘?zhí)橇繛?.1% ( —般需要耗時20_24h)，開始加入補料液將殘?zhí)橇靠刂圃?.1?0.2之間(補料液的流加速度3mL/min)條件下發(fā)酵，補料5?7h后停止補料后繼續(xù)發(fā)酵4h，然后調(diào)節(jié)pH值為8.5-9并將溶氧控制在90%以上，直至發(fā)酵結(jié)束(一般時間為3-5h)；
[0010]其中步驟三所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的配方如下:0.5%?1.0%葡萄糖、0.2%?0.8%酵母膏、0.1%?0.5%氯化鈉、0.1%?0.4% K2HPO4^0.01%?0.05% MgSO4,0.01%?0.02% MnSO4、余量為水，初始pH值為7.2-7.5 ；
[0011]步驟四所述補料液按質(zhì)量百分比的配方如下:葡萄糖8%?12%，酵母膏3%?5%，初始 pH 值為 7.2-7.5ο
[0012]本發(fā)明通過對枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝的嚴格控制，適時補充特定的補料液，來延長菌株的對數(shù)生長期，使其活菌數(shù)能達到90億/mL ;通過對pH和溶氧的聯(lián)合控制穩(wěn)定的促進枯草芽孢桿菌芽孢的形成，形成率達到95%以上。
[0013]本發(fā)明實現(xiàn)枯草芽孢桿菌的高密度培養(yǎng)的同時提高芽孢形成率，延長其制劑保存期并增加其穩(wěn)定活性，保存期在5年以上。
【具體實施方式】
[0014]本實施方式中采用保藏編號CGMCC N0.10603的枯草芽孢桿菌進行培養(yǎng)，具體方法如下:
[0015]步驟一、斜面種子的活化:挑取斜面的單菌落菌種接入試管種子培養(yǎng)基(5mL)，30°C震蕩(70rpm)培養(yǎng)16h。試管種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉3g/L，K2HP042g/L，CaC032g/L，初始 pH 為 7.2-7.5。
[0016]步驟二、種子的培養(yǎng):搖瓶種子培養(yǎng)基裝液量50/500mL，按2%接種量接入試管種子液，30°C搖床ISOrpm培養(yǎng)16h，得到種子液；搖瓶種子培養(yǎng)基同試管種子培養(yǎng)基。
[0017]步驟三、分批發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉3g/L，K2HP042g/L，MgSO40.2g/L，MnSO40.lg/L，初始 pH 為 7.2-7.5)裝液量 10/20L，按 1%接種量接入搖瓶種子液，30°C，pH值7，通氣量10-15L/min，罐壓0.01-0.03MPa，攪拌50_600rpm發(fā)酵，溶氧控制在70%以上；
[0018]步驟四、發(fā)酵至菌體的對數(shù)生長中后期(殘?zhí)橇繛?.1%左右)6h，開始補料發(fā)酵，補料液(葡萄糖10%，酵母膏4%，初始pH 7.2-7.5)流加速度3mL/min，殘?zhí)橇靠刂圃?br>0.1-0.2之間，補料7h，停止補料繼續(xù)發(fā)酵4h，然后調(diào)節(jié)pH值為8.5_9，提高溶氧到90%以上，直至發(fā)酵結(jié)束(3-5h)。
[0019]本實施方式枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)能達到90億/mL ;形成率達到95%以上。保存期5年以上，5年時活菌數(shù)能達到80億/mL。
【主權(quán)項】
1.一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法，其特征在于一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法是按下述步驟進行的: 步驟一、菌種的活化:挑取斜面的單菌落菌種接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 步驟二、搖瓶種子培養(yǎng)； 步驟三、發(fā)酵:將發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，然后按I %接種量接入經(jīng)步驟二獲得的種子液，然后在溫度為30°C、pH值為7、溶氧控制在70%以上、罐壓0.01?0.03MPa和攪拌速度為250?600r/min條件下攪拌發(fā)酵； 步驟四、當發(fā)酵至菌體的殘?zhí)橇繛?.1 %，開始加入補料液將殘?zhí)橇靠刂圃?.1?0.2之間條件下發(fā)酵，補料5?7h后停止補料后繼續(xù)發(fā)酵4h，然后調(diào)節(jié)pH值為8.5-9并將溶氧控制在90%以上，直至發(fā)酵結(jié)束； 其中步驟三所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的配方如下:0.5%?1.0%葡萄糖、.0.2%?0.8%酵母膏、0.1%?0.5%氯化鈉、0.1%?0.4% K2HPO4^0.01%?0.05% MgSO4,.0.01%?0.02% MnSO4、余量為水，初始pH值為7.2-7.5 ； 步驟四所述補料液按質(zhì)量百分比的配方如下:葡萄糖8%?12%，酵母膏3%?5%，初始 pH 值為 7.2-7.5 ο2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法，其特征在于 步驟一中菌種的活化是按下述操作進行的:挑取斜面的單菌落菌種接入試管種子培養(yǎng)基，在30°C條件下以70r/min速度震蕩培養(yǎng)16h得到種子液，所述試管種子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化鈉、0.2% K2HPO4,0.2% CaCO3、余量為水，初始pH值為7.2-7.5 ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟二中搖瓶種子培養(yǎng)是按下述操作進行的:將種子培養(yǎng)基裝入搖瓶中，然后按2%接種量接入步驟一獲得的種子液，再在溫度30°C、速度為180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化鈉、0.2% K2HP04、0.2% CaCO3、余量為水，初始 pH 值為 7.2-7.5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟三發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化鈉、0.2% Κ2ΗΡ04、0.02% MgS04、0.01 % MnS04、余量為水，初始 pH 值為 7.2-7.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟四所述補料液按質(zhì)量百分比的配方如下:葡萄糖10%，酵母膏4%，初始pH值為.7.2-7.5。
【專利摘要】一種促進枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)方法，本發(fā)明要解決在枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵過程中芽孢形成相關(guān)工藝條件不易控制、芽孢形成率低，且發(fā)酵周期長、活菌數(shù)低的問題。方法如下：菌種的活化；然后搖瓶種子培養(yǎng)，然后發(fā)酵培養(yǎng)，當發(fā)酵至菌體的殘?zhí)橇繛?.1％，開始加入補料液將殘?zhí)橇靠刂圃?.1～0.2之間條件下發(fā)酵，補料5～7h后停止補料后繼續(xù)發(fā)酵4h，然后調(diào)節(jié)pH值為8.5-9并將溶氧控制在90％以上，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母膏、氯化鈉、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、余量為水，初始pH值為7.2-7.5；補料液按的配方：葡萄糖，酵母膏，初始pH值為7.2-7.5。本發(fā)明用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/125
【公開號】CN104894032
【申請?zhí)枴緾N201510345610
【發(fā)明人】孟利強, 趙曉宇, 張淑梅, 李晶, 曹旭, 胡基華, 陳鏡宇
【申請人】黑龍江省科學院微生物研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月19日