[0124] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，使用序列比對的流水線處理是使用參考基因組實施 的。
[0125] 在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述方法可以進一步包括從檢測到的變體等位 基因的頻率而推測基因型檢出的步驟。
[0126] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述方法可以進一步包括至少一個細胞，優(yōu)選單個 細胞的基因型的單體型分型評估和/或預測。
[0127] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，通過滾環(huán)擴增，擴增可以在基因組的任何所需的部 分進行。優(yōu)選地，滾環(huán)擴增可以在環(huán)狀線粒體DNA上進行。
[0128] 本申請所描述的方法可以被使用/應用到人和動物細胞上，用于胚胎選擇的目 的，用于對由具有不同的等位基因構成的細胞所組成的異種組織的遺傳研宄（例如腫瘤）， 或用于法醫(yī)研宄。成熟的通用方法具有立即應用的價值，用于例如在診所體外受精后人類 胚胎的植入前遺傳學診斷（PGD)，或通過可以在單一實驗中選擇多個（數量性狀）基因座的 胚胎而進行動物育種項目，或用于由不同等位構成的細胞所組成的異種組織（例如腫瘤） 的遺傳研宄，以及通常需要遺傳多態(tài)性分型（例如SNP分型或通過DNA測序的遺傳變異體 檢測）或單體型分型數據的所有遺傳研宄。
[0129] 另外，本發(fā)明基因分型/單體型分型方法的實施方案允許單體型分型多樣性驅動 的進一步表征，主要是減數分裂同源重組，也是有絲分裂重組過程，其在腫瘤發(fā)生過程中可 能會以升高的頻率發(fā)生。體細胞內的和體細胞之間的染色體重排改變了同線等位基因的序 列，導致原癌基因的潛在活化和腫瘤抑制基因的失活。因此，這樣的重組可能引起腫瘤生 成，而且還可能有助于腫瘤進展。由于腫瘤中的這種染色體不穩(wěn)定的細胞是異質性的并且 此外腫瘤活組織檢查被正常的體細胞所污染。本發(fā)明的方法有利地允許獲得在腫瘤進展和 重組過程中更深入的了解。
[0130]因此，本發(fā)明的方法適用于任何類型的細胞。優(yōu)選的細胞是極體，卵裂球，從囊胚 或絨毛取樣的滋養(yǎng)外胚層細胞。優(yōu)選的遺傳物質包括DNA，更特別的是無細胞的DNA。優(yōu) 選的無細胞胎兒DNA是來源于母體血液，血漿或血清。完整的胎兒細胞和胎兒無細胞核酸 (DNA，RNA)兩者可以在母體血液中被鑒定。在母體循環(huán)中的大部分胎兒無細胞核酸的主要 來源于被認為是胎盤細胞的細胞凋亡。如已經上文所提到的，該方法適用于少量這些細胞 類型，即在少數細胞中，特別是在一個或兩個細胞中。當應用在滋養(yǎng)外胚層時，所述少數細 胞可以選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個細胞；特別是多達50個滋養(yǎng)外胚層細胞。
[0131] 為了移除相應的至少一個細胞，在分裂和囊胚階段的透明帶可以通過機械透明帶 鉆孔、酸化Tyrodes溶液或激光而開啟。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，至少一個細胞，優(yōu)選單 個細胞，是人類或動物卵裂球。
[0132] 在特定的實施方案中，基因檢測應用于診斷測試，攜帶者檢測，產前檢查，植入前 的測試，或預測性和癥狀前的測試。在這些特定的實施方案中，基因檢測有助于幫助患者獲 得輔助生殖的成功。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的方法應用于新生兒篩查。在又 一個特定的實施方案中，本發(fā)明的方法應用于法醫(yī)檢測。
[0133] 在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的方法可以應用于確定腫瘤細胞的存在，或 用于確定微小殘留疾病或疾病的進展。在另一個特定的實施方案中，所述方法可應用于確 定腫瘤或癌癥的進展風險。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的方法可以應用于被懷疑為 腫瘤或癌癥細胞的一個或多個細胞。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的方法應用于來 源于懷疑患有腫瘤或癌癥的受試者的流體樣品。優(yōu)選的，所述流體樣品是血液，血漿或血清 樣品。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的方法應用于無細胞的腫瘤DNA。在另一個優(yōu)選的實 施方案中，本發(fā)明的方法應用于環(huán)狀腫瘤DNA。
[0134] 在特定的實施方案中，本發(fā)明的方法適用于簡化代表性測序，并且關于遺傳變異 的問題是通過對一小組未測序全基因組的全基因組區(qū)域的測序而回答的。應用于基因組物 質消化的基因組文庫簡化方法可以使用一個，兩個，三個，四個或更多個限制性內切酶。酶 的選擇可以由所需的標記密度來確定。最經常地，基因組DNA用選擇的一種或多種頻率切 割的限制性內切酶進行消化。產生的限制性片段按尺寸選擇，然后進行測序產生部分而不 是全基因組覆蓋。
[0135] 測序可以應用鳥槍測序法或靶向測序法。具體而言，測序是指大規(guī)模平行測序，也 被稱為下一代測序。優(yōu)選的測序方法包括焦磷酸測序（454)，離子流（Ion Torrent)測序， 11 lumina染色測序，諸如此類。
[0136] 根據本發(fā)明實施方案的方法可以如下實現，在計算機上作為計算機執(zhí)行方法，或 者在專用硬件上，或者以它們的組合。用于根據本發(fā)明的方法的可執(zhí)行代碼可以存儲在計 算機程序產品中。計算機程序產品的實例包括存儲裝置，光存儲裝置，集成電路，服務器，網 絡軟件等。硬件可以包括微控制器或處理器等。
[0137] 在第二個方面，本發(fā)明提供了數據載體，其存儲根據本發(fā)明方法的實施方案的計 算機程序產品。術語"數據載體"等同于術語"載體介質"或"計算機可讀介質"，并且是指參 與提供指令給處理器用于執(zhí)行的任何介質。這樣的介質可以采取許多形式，包括但不限于， 非易失性介質，易失性介質，和傳輸介質。非易失性介質包括，例如，光盤或磁盤，如存儲裝 置，其是大容量存儲部分。易失性介質包括動態(tài)存儲器，例如RAM。計算機可讀介質的常見 形式包括，例如，軟盤，軟磁盤，硬盤，磁帶，或任何其它磁介質，CD-ROM，任何其它光學介質， 打孔卡，紙帶，任何具有孔圖案的其它物理介質，RAM，PROM，EPROM，FLASH-EPR0M，任何其它 存儲器芯片或盒，如下所述的載波，或者該計算機可以讀取的任何其它介質。各種形式的計 算機可讀介質可以涉及攜帶一個或多個指令的一個或多個序列至處理器用于執(zhí)行。例如， 指令可以最初攜帶在遠程計算機的磁盤上。遠程計算機可以將指令加載到其動態(tài)存儲器中 并且使用調制解調器通過電話線發(fā)送指令。計算機系統(tǒng)的本地調制解調器可以通話電話線 接受數據，并且使用紅外發(fā)射器將數據轉換為紅外信號。耦合到總線的紅外檢測器可以接 收在紅外信號中攜帶的數據，并且把數據放置在總線上。所述總線傳送數據到主存儲器，處 理器從主存儲器檢索到并且執(zhí)行指令。由主存儲器接收的指令可以在由處理器執(zhí)行之前或 之后任選地存儲在存儲設備上。所述指令還可以通過網絡中的載波傳送，如LAN，WAN或互 聯(lián)網。傳輸介質可以采取聲波或光波形式，例如在無線電波和紅外數據通信期間所生成的 形式。傳輸介質包括同軸電纜，銅線和光纖，包括構成計算機內總線的金屬線。
[0138] 在第三個方面，本發(fā)明提供通過網絡傳輸根據本發(fā)明的第二個方面的計算機程序 產品。
[0139] 在第四個方面，本發(fā)明提供用于單體型分型至少一個細胞的系統(tǒng)，從而該系統(tǒng)可 以包括控制單元，所述控制單元適于：
[0140]-分離并裂解所述至少一個細胞，
[0141] _擴增至少一個細胞的DNA片段，
[0142]-通過深度測序所述擴增產物的簡化代表性文庫，大規(guī)模平行（全基因組）的遺傳 多態(tài)性分型（基因分型），
[0143]-提供用于變體發(fā)現，基因分型和/或單體型分型的流水線處理。
[0144] 在一個備選的方面，本發(fā)明提供用于單體型分型單個細胞的系統(tǒng)，從而該系統(tǒng)可 以包括控制單元，所述控制單元適于：
[0145]-分離并裂解該單個細胞，
[0146]-擴增該單個細胞的DNA片段，
[0147]-通過深度測序所述擴增產物的簡化代表性文庫，大規(guī)模平行（全基因組）的遺傳 多態(tài)性分型（基因分型），
[0148]-提供用于變體發(fā)現，基因分型和/或單體型分型的流水線處理。
[0149] 在又一個方面，本發(fā)明提供用于單體型分型雙細胞的系統(tǒng)，從而該系統(tǒng)可以包括 控制單元，所述控制單元適于：
[0150] _分離并裂解所述兩個細胞，
[0151]_擴增每個單個細胞的DNA片段，
[0152] -對于每個細胞，通過深度測序所述擴增產物的簡化代表性文庫，來大規(guī)模平行 (全基因組）遺傳多態(tài)性分型（基因分型），
[0153]-生成由兩個分別基因分型的單個細胞之間遺傳多態(tài)性檢出一致所組成的虛擬基 因型，
[0154] _重構所述虛擬基因型的單體型分型（或所述虛擬基因型的選擇）
[0155]-提供用于變體發(fā)現，基因分型和/或單體型分型的流水線處理。
[0156] 在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供適于執(zhí)行本發(fā)明實施方案的系統(tǒng)或裝置。 所述系統(tǒng)或裝置可以包括一個或多個控制單元來以控制本發(fā)明的方法步驟。此外，本發(fā)明 提供裝置的組合，每個裝置適于執(zhí)行一個或多個本發(fā)明的方法步驟。
[0157] 在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供用于生成測序文庫的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)適 于接收樣品，其中靶核酸是以少量存在的，所述系統(tǒng)包括控制單元，所述控制單元控制所述 靶核酸的簡化代表性測序文庫的生成是通過控制
[0158] ?使所述靶核酸片段化；
[0159] ?銜接子連接到所述片段；和
[0160] 魯選擇所述銜接子-連接片段子集。
[0161] 在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供用于生成測序文庫的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括一 個或多個控制單元，其控制：
[0162] 魯包括少量靶核酸的樣品的分離；特別是少數細胞的分離；
[0163] 魯根據本發(fā)明方法的簡化代表性測序文庫的生成；特別是
[0164]-使所述靶核酸片段化，
[0165]-連接銜接子至所述片段，和
[0166] _選擇所述銜接子-連接片段子集。
[0167] 在進一步的實施方案中，所述一個或多個控制單元進一步適于控制所述簡化代表 性測序文庫的測序，特別是深度測序。
[0168] 在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供用于靶核酸的分析的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)適 于接收樣品，其中靶核酸是少量存在的，所述系統(tǒng)包括一個或多個控制單元，所述控制單元 控制
[0169] 魯根據本發(fā)明方法的所述靶核酸的簡化代表性文庫的生成，和
[0170] ?對所述簡化代表性文庫測序。
[0171] 在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供裝置的組合，其包括：
[0172] ?適于分離少數細胞的細胞分離裝置；特別是1至20個細胞；和
[0173] ?樣品處理裝置，其適于：
[0174] _如本文所述，生成簡化代表性文庫，和
[0175]-進行所述簡化代表性文庫的大規(guī)模平行測序。
[0176] 此外，本發(fā)明提供裝置的組合，其包括：
[0177] ?適于分離少數細胞的細胞分離裝置；特別是1至20個細胞；
[0178] ?適于生成根據本發(fā)明方法的簡化代表性文庫的樣品處理裝置；和
[0179] ?大規(guī)模平行測序裝置。
[0180] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明有利地提供通過對單個細胞測序（Sc GBS)而用于高 通量基因分型的方法。
[0181] 本發(fā)明的實施方案提供通用的方法，其可以用于直接鑒定來自不同基因組的遺傳 變異，其有利地，與基因組的尺寸和/或GC含量無關，以及無需關注所使用的高通量大規(guī)模 平行測序的技術來推測基因型和/或單體型。在本發(fā)明另外的實施方案中，可以有利地具 有不同的應用價值，例如：
[0182](1)在人類或非人類生育診所中，在體外或體內所生成的植入前胚胎進行植入前 基因檢測，
[0183] (2)在動物育種計劃中用于基因組選擇的應用，
[0184] (3)在基因測試中心分析異種組織，它由具有不同等位基因組成的細胞所構成 (例如腫瘤），和
[0185] (4)在所有遺傳研宄中需要用于基因型和/或單體型重構的全基因組遺傳變異檢 測。
[0186] 本發(fā)明的實施方案提供在至少一個細胞，優(yōu)選單個細胞或少數細胞中的全基因組 變體的發(fā)現和/或分型，以推測基因型和/或單體型，優(yōu)選來源于簡化代表性測序數據，例 如通過使用目前本領域已知的高通量的大規(guī)模平行測序技術。與測序平臺的設計和化學， 人口變異或基因組組成（如SNP陣列）無關，本發(fā)明的實施方案有利地提供具有成本效益、 快速和通用的策略。樣品可以在測序之前匯集，使用不同的銜接子連接的條形碼使得這種 方法有利的高度可擴展（從低到超深度測序）和具有在診斷上成本效益的適用性。
[0187] 在本發(fā)明實施方案中使用的超深度測序或擴增子測序優(yōu)選地允許檢測極低水平 的突變，和PCR擴增DNA的特定靶向區(qū)域。該方法優(yōu)選地用于鑒定癌癥樣品中低頻率體細 胞突變或發(fā)現稀有的變體。
[0188] 根據本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，該方法可以包括涉及至少一個細胞，優(yōu)選單個細胞、 少數細胞或遺傳物質的以下步驟中的至少一個步驟：
[0189] 1.細胞制備的情況下，所述細胞制備優(yōu)選地包括：
[0190] a.分離至少一個細胞，優(yōu)選地單個細胞或少數細胞，例如從體外或體內生成的植 入前胚胎
[0191] b?裂解該細胞
[0192] 在遺傳物質的情況下，不需要細胞制備并且遺傳物質是從適當的流體例如血液， 血衆(zhòng)或血清中獲得。
[0193] 2.擴增全基因組，優(yōu)選地使用多重置換擴增或任何（全基因組）擴增方法，其例如 可以是基于使用例如（半）隨機引物的PCR;或銜接子連接到用于擴增的單個細胞DNA-片 段和/或通用引物。
[0194] a.在一個可選的步驟中，全基因組擴增可以省略和擴增單個細胞基因組的僅僅所 需片段，例如特異性地使用例如一個引物和滾環(huán)擴增原理的線粒體序列的擴增。滾環(huán)擴增 (RCA)是一種形成連環(huán)體DNA的獨特屬性的分子擴增方法，該連環(huán)體DNA是由成千上萬的 初始序列的銜接重復拷貝組成的。有利的是，可以使用RCA檢測結合到微陣列表面的低至 150個分子。因為RCA的線性動力學，核酸靶分子可以在4個數量級的動態(tài)范圍內被測定。