64 小時(shí)時(shí)獲取 樣品。保留時(shí)間為1. 9、2. 1、4. 6和9. 8分鐘的峰分別對(duì)應(yīng)于甘油、L-巖藻糖、乳果糖和麥 芽三糖（內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)）。上文描述了 HPLC測(cè)量方法。
[0102] 在圖4B中不出對(duì)于生長(zhǎng)于鹿糖的大腸桿菌BL21 (DE3) IacZ Gal+ araA AwcaJ AfucI AfucK: : (Ptet-IacY) (cscBKAR) (Ptet-wgbLc〇-neo) (Ptet-manCB-PT5-gmd, wcaG-dhfr) (Ptet-afcAC〇-tet)的上清的HPLC分析結(jié)果；在發(fā)酵開(kāi)始后的66. 3小時(shí)時(shí)獲取樣品。保留 時(shí)間為2. 2、4. 6和9. 8分鐘的峰分別對(duì)應(yīng)于L-巖藻糖、乳果糖和麥芽三糖（內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)）。 上文描述了 HPLC測(cè)量方法。
[0103] 通討β -半乳糖苷酶7k解乳果糖并目.通討菌株大腸桿菌BL21 (DE3) IacZ Gali araA Δ wca.T Δ fuel Δ fucK: : (Ptet~lacY) (cscBKAR) (Pte+-wgbLco-neo) (P+"+-manCB_PT1;-gmd, wcaG-dhfr) (P+"+-afcAco_tet)降解單糖
[0104] 通過(guò)離心和過(guò)濾（0.22μπι孔徑）來(lái)獲得來(lái)自分別生長(zhǎng)于蔗糖和甘油的菌株大腸 桿菌 BL21(DE3) IacZ Gal+ araA AwcaJ AfucI AfucK AnagB AnagA:: (Ptet-IacY) (cscBKAR) (Ptet-wgbLco_neo) (Ptet-manCB_PT5-gmd，wcaG-dhfr) (Ptet-afcAco_tet)的產(chǎn) 生L-巖藻糖的培養(yǎng)物的無(wú)菌上清。在新鮮的礦物鹽培養(yǎng)基中1:10稀釋上清。添加 β-半乳糖苷酶（購(gòu)自Sigma Aldrich)至10單位ml/1的濃度并在37°C下進(jìn)行水解3小 時(shí)。在37°C下，在包含相應(yīng)抗生素的2YT富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)菌株大腸桿菌BL21(DE3) IacZ Gal+ araA AwcaJ AfucI Δ fucK: : (Ptet-IacY) (cscBKAR) (Ptet-wgbLc〇-neo) (Ptet-manCB-PT5-gmd，wcaG-dhfr) (Ptet-afcAco_tet)至約 5 的 0D660nm。通過(guò)離心在無(wú)菌條 件下收獲IOmL培養(yǎng)物的細(xì)胞并再懸浮于2mL的包含β-半乳糖苷酶的上清中。在37°C、在 16小時(shí)內(nèi)活細(xì)胞降解單糖，其來(lái)自酶促水解。
[0105] 圖 5 不出通過(guò)大腸桿菌 BL21 (DE3) IacZ Gal+ araA Δ wcaj Δ fuel Δ fucK: : (Ptet-IacY) (cscBKAR) (Ptet-wgbLco_neo) (Ptet-manCB_PT5-gmd，wcaG-dhfr) (Ptrt-afcA C〇-tet)體外酶促水解乳果糖和降解單糖的HPLC分析，其中圖5A示出用蔗糖 生長(zhǎng)培養(yǎng)物的上清（在66. 3小時(shí)時(shí)收獲）的結(jié)果；在添加 β -半乳糖苷酶以前以及在用 β -半乳糖苷酶進(jìn)行處理和降解以后。圖5Β保留時(shí)間為2. 1和4. 4分鐘的峰分別對(duì)應(yīng)于 L-巖藻糖和乳果糖。
[0106] 圖6示出通過(guò)微生物發(fā)酵獲得的經(jīng)純化的L-巖藻糖的I-H NMR譜。為了測(cè)量，將 20mg物質(zhì)溶解于0· 7ml氘化DMS0。
[0107] 呈現(xiàn)的結(jié)果表明，借助于示例性微生物菌株可以以游離形式大規(guī)模地有效地產(chǎn)生 示例性單糖L-巖藻糖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使用微生物生產(chǎn)游離形式的單糖的方法，所述方法包括以下步驟： a) 提供微生物，所述微生物具有用于合成所述單糖的以下酶活性：i)糖基轉(zhuǎn)移酶，所 述糖基轉(zhuǎn)移酶特異性地能夠?qū)⑺鰡翁菑幕罨暮塑账釂翁寝D(zhuǎn)移到受體-底物以形成受 體 -單糖-底物，以及ii)糖苷酶，所述糖苷酶能夠從所述受體-底物釋放所述單糖；其中 所述微生物不能代謝所述單糖； b) 在適合生長(zhǎng)所述微生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，借此產(chǎn)生游離形式的所述單 糖， c) 從所述培養(yǎng)基回收所述游離的單糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于，使用重組微生物，其中所述重組微生物已被 轉(zhuǎn)化以包含以下中的至少一種：i)編碼并不天然存在于所述微生物中的糖基轉(zhuǎn)移酶的核 酸序列，和/或ii)編碼并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，特征在于，所述受體-底物相對(duì)于所述微生物是內(nèi) 源性的或被加入在其中培養(yǎng)所述微生物的所述培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，所述受體-底物選自二糖、優(yōu) 選乳果糖或乳糖，單糖，多糖，糖基化蛋白或脂多糖。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所 述微生物，所述碳源選自甘油、蔗糖、糖蜜、木糖、纖維素、合成氣。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，所述方法是分批或連續(xù)方法。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，從所述培養(yǎng)的微生物的上清 回收所述單糖，其中通過(guò)離心所述培養(yǎng)的宿主微生物以獲得上清和微生物沉淀物來(lái)獲得上 清。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，在步驟c)中在回收所述單糖以 前，將e-半乳糖苷酶加入在其中培養(yǎng)所述宿主微生物的培養(yǎng)基中，和/或在所述微生物中 誘導(dǎo)(6-半乳糖苷酶的內(nèi)源性生產(chǎn)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，在從所述上清回收所述單糖以 前，用e-半乳糖苷酶來(lái)處理所述上清然后與所述培養(yǎng)的宿主微生物接觸。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，產(chǎn)生的所述單糖選自L-巖藻 糖或神經(jīng)氨酸。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，所述方法包括以下步驟： a) 在適合生長(zhǎng)微生物的培養(yǎng)基中提供重組宿主微生物，所述重組宿主微生物已被轉(zhuǎn)化 以包含a)編碼在所述微生物中并不天然存在的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列，以及b)編碼在所 述微生物中并不天然存在的糖苷酶的核酸序列，其中所述微生物不能代謝待產(chǎn)生的所述單 糖， b) 將受體-底物加入在其中培養(yǎng)所述宿主微生物的所述培養(yǎng)基，其中所述受體-底物 是二糖、優(yōu)選乳糖或乳果糖， c) 在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組宿主微生物，借此產(chǎn)生游離形式的所述單糖， d) 從所述培養(yǎng)基回收所述游離的單糖。
12. -種重組宿主微生物，所述重組宿主微生物被轉(zhuǎn)化以能夠生長(zhǎng)于唯一碳源以及包 含a)編碼并不天然存在于所述宿主微生物中的糖基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸序列，以及b)編碼 并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶多肽的核酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組宿主微生物，特征在于，所述重組宿主微生物被進(jìn)一 步轉(zhuǎn)化以缺乏編碼L-巖藻糖異構(gòu)酶、L-墨角藻糖激酶和UDP-葡萄糖：^^一異戊稀磷酸葡 萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的重組宿主微生物，特征在于，所述重組宿主微生物被 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化以包含使所述重組宿主微生物能夠生長(zhǎng)于蔗糖或甘油的基因。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述 的重組宿主微生物，特征在于，所述微生物選自細(xì)菌和酵母。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述 的重組宿主微生物，特征在于，所述宿主微生物是大腸桿菌（Escherichiacoli)菌株或酵 母屬（Saccharomycessp.)菌株。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至11或15和16中任一項(xiàng)所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求12至16 中任一項(xiàng)所述的重組宿主微生物，特征在于，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸是細(xì)菌巖藻糖基 轉(zhuǎn)移酶。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至11和15至17中任一項(xiàng)所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求12 至17中任一項(xiàng)所述的重組宿主微生物，特征在于，編碼糖苷酶多肽的所述核酸是細(xì)菌 1，2-a-L-巖藻糖苷酶。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至11和15至18中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于，重組大腸桿 菌（Escherichiacoli)菌株用作重組宿主微生物，其中在所述重組大腸桿菌菌株中，編碼 0 -半乳糖苷酶、L-巖藻糖異構(gòu)酶、L-墨角藻糖激酶和UDP-葡萄糖：十一異戊烯磷酸葡萄 糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因已被刪除或下調(diào)，并且其中所述重組大腸桿菌菌株已被轉(zhuǎn)化以包 含a)使所述大腸桿菌菌株能夠生長(zhǎng)于作為唯一碳源的蔗糖的基因，所述基因分別編碼蔗 糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子，b)編碼2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，以及 c)編碼1，2-a-巖藻糖苷酶的基因。
20. 具有以下酶活性的微生物用于合成單糖的應(yīng)用：i)糖基轉(zhuǎn)移酶，所述糖基轉(zhuǎn)移酶 特異性地能夠?qū)⑺鰡翁菑幕罨暮塑账釂翁堑孜镛D(zhuǎn)移到受體以形成受體-單糖底物，以 及ii)糖苷酶，所述糖苷酶能夠從所述受體釋放所述單糖，其中所述微生物不能代謝所述 單糖，或者權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所述的重組宿主微生物在生產(chǎn)單糖、尤其是L-巖藻 糖或神經(jīng)氨酸中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于使用微生物來(lái)產(chǎn)生單糖的方法。該微生物具有糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶，其一起工作以合成所期望的游離形式的單糖，其中通過(guò)使用內(nèi)源性提供的核苷酸活化的單糖、糖基化適宜的受體底物并通過(guò)水解反應(yīng)釋放所期望的單糖。再循環(huán)并僅需要催化量的用于反應(yīng)所需要的受體底物。以游離形式來(lái)產(chǎn)生單糖并且獲取自所培養(yǎng)的微生物的上清。
【IPC分類(lèi)】C12P19-18, C12N15-70
【公開(kāi)號(hào)】CN104822839
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380057191
【發(fā)明人】斯特凡·延內(nèi)魏因, 卡特婭·帕爾沙特
【申請(qǐng)人】詹尼溫生物技術(shù)有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2013年9月9日
【公告號(hào)】EP2728009A1, US20150240277, WO2014067696A1