idum)的1，2-α -L-巖藻糖苷酶基因 afcA (基因庫(kù)登錄號(hào)：AY303700)，其中密碼子被優(yōu) 化以便于在大腸桿菌中表達(dá)。
[0029] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，那些術(shù)語(yǔ)還包括在整個(gè)本發(fā)明中提到的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶 的核酸/多核苷酸和多肽多態(tài)變體、等位基因、突變體、功能等效片段、以及種間同系物，尤 其是這樣的那些：其具有氨基酸序列，該氨基酸序列，尤其是，以及例如，相對(duì)于由大腸桿 菌：0126的wbgL基因（登錄號(hào)ADN43847)編碼的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列 或相對(duì)于來(lái)自兩歧雙歧桿菌的1，2-a -L-巖藻糖苷酶基因 afcA的氨基酸序列，優(yōu)選在至少 約25、50、100、200、500、1000或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上，具有大于約60%氨基酸序列同一 性、65%、70%、75%、80%、85%、90%，優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%或更高的氨基酸序列同一性。在閱讀本發(fā)明以后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到可 以使用任何其他糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶，只要這些酶在微生物中滿足它們的酶活性。最終，必 須相對(duì)于它們待引入的微生物密碼子優(yōu)化糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶的序列。
[0030] 在本發(fā)明的上下文中，如在本文中所使用的，〃功能等效〃是指這樣的多肽，其能 夠顯示和由上述α -1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列編碼的α -1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因產(chǎn) 物或如上所述的巖藻糖苷酶基因產(chǎn)物基本上類似的體內(nèi)活性，如通過(guò)任何數(shù)目的準(zhǔn)則判斷 的，包括但不限于抗原性，即，結(jié)合于抗α -1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或1，2- a -L-巖藻糖苷酶 抗體的能力，免疫原性，即，產(chǎn)生能夠結(jié)合α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或巖藻糖苷酶蛋白或多 肽的抗體的能力，以及酶活性。
[0031] 可以通過(guò)重組DNA技術(shù)并利用在本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生如在整個(gè)本發(fā) 明中提到的糖基轉(zhuǎn)移酶多肽和/或糖苷酶多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可以用 來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體，其包含，例如，α -1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和/或1，2- a -L-巖藻糖苷酶、編 碼序列和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄翻譯控制信號(hào)。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和 體內(nèi)基因重組。參見(jiàn)，例如，描述于 Sambrook et al·，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)中的技術(shù)。
[0032] 目前，以及在整個(gè)本發(fā)明中，〃重組〃是指通過(guò)將來(lái)自一種物種的基因移植或剪接 進(jìn)入不同物種的宿主微生物的細(xì)胞所制備的基因工程DNA。這樣的DNA變成宿主的基因構(gòu) 成的一部分并且被復(fù)制。
[0033] "微生物"目前表明和包括任何微小有機(jī)體，該微小有機(jī)體包括單細(xì)胞、細(xì)胞簇、或 多細(xì)胞的相對(duì)復(fù)雜的有機(jī)體，其適合用于根據(jù)本發(fā)明的方法，并且特別包括細(xì)菌和酵母?？?以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)如根據(jù)本發(fā)明使用的微生物，并且一般需要在培養(yǎng)基中的碳源以生 長(zhǎng)和復(fù)制。
[0034] 因此，"重組宿主微生物"用來(lái)指任何微生物，其包含編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶、或 編碼糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的核酸序列，其中編碼這些酶的核酸序列是這樣的核酸序列，其 非重組（宿主）細(xì)胞原有（foreign to)/非天然存在于重組（宿主）細(xì)胞中以及其中非原 有的/非天然地在所述微生物中存在的序列被整合在宿主微生物細(xì)胞的基因組中。從而， "非天然存在"是指，核酸序列是非所述宿主微生物細(xì)胞原有的，即，相對(duì)于微生物宿主細(xì) 胞，核酸序列是異源的?？梢?，例如通過(guò)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、或轉(zhuǎn)導(dǎo)將異源序列穩(wěn)定引入宿主微生物 細(xì)胞的基因組，其中可以應(yīng)用的技術(shù)將取決于序列待引入的宿主細(xì)胞。各種技術(shù)是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的，并且，例如，公開(kāi)于Sambrook et al.，1989,同上。因此，其中已引入異源 序列的宿主細(xì)胞將產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的核酸序列編碼的異源蛋白。
[0035] 為了重組生產(chǎn)，可以基因設(shè)計(jì)宿主細(xì)胞以引入表達(dá)系統(tǒng)或其部分和本發(fā)明的核酸 序列?？梢酝ㄟ^(guò)在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，如Davis et al·，Basic Methods in Molecular Biology, (1986)，and Sambrook et al.，1989,同上，中描述的方法來(lái)將核酸序列引入宿主 微生物細(xì)胞。
[0036] 因此，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可以例如被包含在載體中，其中上述載體將被穩(wěn)定 地轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染或以其他方式引入宿主微生物細(xì)胞。
[0037] 各種各樣的表達(dá)系統(tǒng)可以用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這樣的載體包括（除了別的以 外）染色體載體、附加型載體和病毒源性載體，例如，源自細(xì)菌質(zhì)粒的載體、源自噬菌體的 載體、源自轉(zhuǎn)座子的載體、源自酵母附加體的載體、源自插入元件的載體、源自酵母染色體 元件的載體、源自病毒的載體，以及源自它們的組合的載體，如那些源自質(zhì)粒和噬菌體基因 元件（如粘粒和噬菌粒）的載體。表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建體可以包含控制區(qū)，其調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)。 在這方面，通常，在宿主中適合于維持、增殖或表達(dá)多核苷酸以及適合于合成多肽的任何系 統(tǒng)或載體可以用于表達(dá)。可以通過(guò)任何的各種各樣的眾所周知的和常規(guī)的技術(shù)，如，例如， 在Sambrook et al.，同上中闡述的那些技術(shù)將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入表達(dá)系統(tǒng)。
[0038] 如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)〃回收〃是指從微生物培養(yǎng)物分離、收獲、純化、收集或 以其他方式分離通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的單糖。
[0039] 在整個(gè)本發(fā)明中，特別優(yōu)選的是，待產(chǎn)生的游離單糖是L-巖藻糖或神經(jīng)氨酸。
[0040] L-巖藻糖是己糖脫氧糖，并且除其他巖藻糖基化的寡糖之外，發(fā)現(xiàn)它是主要是化 工、醫(yī)藥、化妝品和營(yíng)養(yǎng)應(yīng)用感興趣的。除它用于生產(chǎn)巖藻糖基化衍生物（其因它們的抗過(guò) 敏和乳化性能而眾所周知）之外，L-巖藻糖還是人乳寡糖（HMO)的常見(jiàn)成分，如2' -巖藻 糖基-乳糖。
[0041] 根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，受體-底物是所述微生物的內(nèi)源的或被加入在其中培 養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中。內(nèi)源性受體-底物可以是，例如，存在于微生物中的任何二糖或單 糖、糖基化蛋白或脂多糖。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，將受體-底物外部加入所述微生物或加入在培養(yǎng)基中培 養(yǎng)的微生物，以及優(yōu)選地添加乳糖或乳果糖。
[0043] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，上述碳源選自甘 油、蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜、乳糖、木糖、纖維素、合成氣或一氧化碳。在這種情況下，應(yīng)當(dāng) 理解的是，任何其他（優(yōu)選低成本的）發(fā)酵底物可以用作碳源，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易 地能夠使用適用于本發(fā)明的碳源以生長(zhǎng)微生物，從而以大規(guī)模地產(chǎn)生所期望的單糖。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，上述方法是分批或連續(xù)發(fā)酵方法。
[0045] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，即在連續(xù)過(guò)程中，在微生物（例如重組微生物）的 培養(yǎng)步驟期間將碳源持續(xù)加入培養(yǎng)基。
[0046] 通過(guò)在培養(yǎng)步驟期間不斷添加碳源，完成單糖的持續(xù)和有效生產(chǎn)。
[0047] 根據(jù)另一方面，即在分批過(guò)程中，上述方法并不包括在發(fā)酵過(guò)程中外部添加物質(zhì) 的步驟。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，單糖回收自培養(yǎng)的重組宿主微生物的上清，通過(guò)離心培 養(yǎng)的宿主微生物以獲得上清和宿主微生物沉淀物從而獲得上清。
[0049] 借助于新提供的方法，可以從在其中培養(yǎng)宿主微生物的培養(yǎng)基回收產(chǎn)生的單糖， 這是因?yàn)樵谖⑸锛?xì)胞中產(chǎn)生的單糖被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入培養(yǎng)基，因而，在已經(jīng)由培養(yǎng)基分開(kāi)微生 物的細(xì)胞以后，可以毫不費(fèi)力地從上清回收單糖。
[0050] 根據(jù)根據(jù)本發(fā)明的方法的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟c)中分離單糖以前，將 β-半乳糖苷酶加入在其中培養(yǎng)宿主微生物的培養(yǎng)基和/或在微生物中誘導(dǎo)β-半乳糖苷 酶的內(nèi)源性生產(chǎn)。
[0051] 借助于此特點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)的是除所期望的單糖之外其他單糖可以被代謝掉，其中， 其他單糖是在所期望的單糖的合成期間在微生物中所產(chǎn)生的，并且其他單糖干擾所期望的 單糖的純化步驟，使得進(jìn)一步改善和促進(jìn)所期望的單糖的回收步驟。根據(jù)本發(fā)明，這可以通 過(guò)向著過(guò)程的結(jié)束誘導(dǎo)否則下調(diào)（去調(diào)節(jié)，deregulated) β-半乳糖苷酶來(lái)實(shí)現(xiàn)；這意味 著，在所期望單糖的合成期間，例如通過(guò)溫度或添加誘導(dǎo)劑，例如四環(huán)素（在發(fā)酵過(guò)程結(jié)束 時(shí)），下調(diào)β-半乳糖苷酶并且可以被誘導(dǎo)?？商鎿Q地或另外，在根據(jù)本發(fā)明的方法結(jié)束時(shí)， 可以將酶β -半乳糖苷酶（或任何其他寡糖或單糖代謝酶）外部加入培養(yǎng)基，當(dāng)編碼β -半 乳糖苷酶的內(nèi)源性基因已被滅活或刪除時(shí)，其是特別優(yōu)選的。在這樣做時(shí)，不需要的寡糖和 或單糖不能積累并且不干擾所期望的單糖的回收。在這種情況下，應(yīng)當(dāng)理解的是，除β-半 乳糖苷酶之外，在微生物中還可以以所提到的方式來(lái)調(diào)節(jié)其他代謝酶以代謝否則干擾性的 不需要的寡糖和單糖，并且在閱讀本發(fā)明以后本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到用來(lái)調(diào)節(jié)/激 活或供給的其他合適的途徑或酶，其將取決于待降解的受體。
[0052] 如在本文中使用的以及如在本發(fā)明的領(lǐng)域中通常理解的，"β-半乳糖苷酶"是催 化β-半乳糖苷酶到單糖的水解的水解酶。
[0053] 在關(guān)于基因的本上下文中，"調(diào)節(jié)的"通常被理解為基因可以以受控方式，例如下 調(diào)或上調(diào)方式來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)，即由調(diào)節(jié)的基因編碼的合成蛋白的量是不同（例如下調(diào)/下 調(diào)或上調(diào)）于未調(diào)節(jié)的基因。
[0054] 通過(guò)將酶β -半乳糖苷酶加入培養(yǎng)基和/或上清，可以切割仍然存在于培養(yǎng)基中 的受體-底物；在使用乳果糖的情況下，切割乳果糖糖苷鍵并釋放半乳糖和果糖；以及通過(guò) 使用的大腸桿菌菌株可以有效地代謝產(chǎn)生的單糖。因此，可以從培養(yǎng)基有效地除去提供的 二糖，優(yōu)選乳果糖或乳糖。在這種情況下，通過(guò)基因敲除或類似的基因失活，可以滅活最終 天然存在于微生物例如如大腸桿菌中的β -半乳糖苷酶。
[0055] 此外，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在從上清回收單糖以前，用半乳糖苷酶來(lái)處理 上清，然后與培養(yǎng)的宿主微生物接觸。