r>[0056] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0057] a)在適合生長(zhǎng)微生物的培養(yǎng)基中提供重組宿主微生物，其已被轉(zhuǎn)化以包含a)編 碼并不天然存在于微生物中的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列，和/或b)編碼并不天然存在于所述 微生物中的糖苷酶的核酸序列，其中微生物不能代謝待產(chǎn)生的單糖，
[0058] b)將受體-底物加入在其中培養(yǎng)宿主微生物的培養(yǎng)基，其中受體-底物是二糖，優(yōu) 選乳糖或乳果糖，
[0059] c)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主微生物，借此以游離形式產(chǎn)生單糖，
[0060] d)從培養(yǎng)基回收游離單糖。
[0061] 如上所述，以及如已經(jīng)連同根據(jù)本發(fā)明的方法一起描述的，本發(fā)明還涉及重組宿 主微生物，其被轉(zhuǎn)化以能夠生長(zhǎng)于唯一碳源以及包含a)編碼并不天然存在于所述宿主微 生物中的糖基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸序列，和b)編碼并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶 多肽的核酸序列。
[0062] 上文針對(duì)連同上述方法一起的特定術(shù)語(yǔ)所使用和闡述的定義也適用于本文介紹 的重組微生物。
[0063] 根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的以及本文要求保護(hù)的微 生物選自細(xì)菌或酵母，并且更優(yōu)選地，宿主微生物是大腸桿菌（Escherichia coli)菌株或 酵母屬（Saccharomyces sp.)菌株。
[0064] 細(xì)菌大腸桿菌和酵母酵母屬具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下容易且廉價(jià)地生 長(zhǎng)這些微生物，以及已深入研宄細(xì)菌和酵母超過(guò)60年。
[0065] 因此，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的以及本文中另外 要求保護(hù)的宿主微生物選自由細(xì)菌和酵母組成的組，并且優(yōu)選是大腸桿菌菌株。
[0066] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選的是，重組宿主微生物被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化 以缺乏編碼β-半乳糖苷酶的基因或包含下調(diào)的β-半乳糖苷酶編碼基因，以及L-巖 藻糖異構(gòu)酶、L-墨角藻糖激酶和UDP-葡萄糖：十一異戊烯磷酸葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶 (UDP-glucose:undecaprenyl phosphate glucose-1-phosphate transferase)。
[0067] 此實(shí)施方式具有以下優(yōu)點(diǎn)：防止產(chǎn)生的單糖L-巖藻糖的細(xì)胞內(nèi)降解和莢膜異多 糖酸（結(jié)腸酸，colonic acid)的生產(chǎn)，并且在β-半乳糖苷酶的情況下受體分子不被降解。 [0068] 在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，重組宿主微生物被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化以包含基因，其使得重 組宿主微生物能夠生長(zhǎng)于蔗糖或甘油（作為唯一碳源），以及特別優(yōu)選的是，大腸桿菌W的 esc-基因簇（登錄號(hào)CP0021851)被整合進(jìn)入宿主微生物的基因組，上述基因簇包含基因蔗 糖通透酶、果糖激酶、鹿糖水解酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子（分別為基因 cscB、cscK、cscA和cscR)， 其使得轉(zhuǎn)化的微生物能夠生長(zhǎng)于蔗糖（作為唯一碳源）。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的方法或微生物的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，以及如上所述，編碼糖基轉(zhuǎn) 移酶多肽的核酸是2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和1，2-a-L-巖藻糖苷酶。對(duì)于此酶的定義，見(jiàn)上文。
[0070] 在這方面，應(yīng)該注意的是，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的方法列為優(yōu)選的實(shí)施方式均適用于 要求保護(hù)的微生物（在適用情況下）。
[0071] 因此，本發(fā)明還涉及具有以下酶活性的微生物用于合成單糖的應(yīng)用：i)糖基轉(zhuǎn)移 酶，其特異性地能夠?qū)翁菑幕罨暮塑账釂翁堑孜镛D(zhuǎn)移到受體以形成受體-單糖底物， 以及ii)糖苷酶，其能夠從受體釋放單糖；其中微生物不能代謝單糖，以及本發(fā)明進(jìn)一步涉 及根據(jù)本發(fā)明的重組微生物用于生產(chǎn)單糖，尤其是L-巖藻糖的應(yīng)用。
[0072] 應(yīng)該注意的是，上文為描述根據(jù)本發(fā)明的方法的某些術(shù)語(yǔ)所闡述的定義將適用于 微生物（重組的或未修飾的），如在本文中要求保護(hù)的和描述的。
[0073] 可替換地，用于產(chǎn)生單糖的方法可以適用于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，借此，通過(guò)在含水反應(yīng)介 質(zhì)中的混合，來(lái)組合根據(jù)本發(fā)明的酶、一種或多種受體底物和（根據(jù)具體情況而定）其他反 應(yīng)混合物成分，包括其他糖基轉(zhuǎn)移酶和輔助酶?？梢砸栽谌芤褐械挠坞x形式來(lái)使用酶，或可 以將它們結(jié)合或固定于載體如聚合物，并且可以將底物加入載體?？梢詫⑤d體，例如，填充 在柱中。
[0074] 尤其是，本發(fā)明涉及其中重組大腸桿菌菌株用作重組宿主微生物的方法，其中在 重組大腸桿菌菌株中L-巖藻糖異構(gòu)酶基因和L-墨角藻糖激酶基因已被刪除，以及其中 重組大腸桿菌菌株已被轉(zhuǎn)化以包含a)使得大腸桿菌菌株能夠生長(zhǎng)于蔗糖或甘油（作為唯 一碳源），上述基因分別編碼蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子，b)編碼 2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，以及c)編碼1，2- α -巖藻糖苷酶的基因。
[0075] 依據(jù)實(shí)施方式的描述和附圖，可以得出另外的優(yōu)點(diǎn)。
[0076] 不用說(shuō)，上述特點(diǎn)以及有待下文解釋的特點(diǎn)可以不僅用于分別指定的組合，而且 用于其他組合或它們本身，而沒(méi)有偏離本發(fā)明的范圍。
[0077] 在圖中說(shuō)明并在以下描述中更詳細(xì)地解釋本發(fā)明的若干實(shí)施方式。在圖中：
[0078] 圖1示出在本發(fā)明中使用的途徑/方法的示意圖（A)以及根據(jù)本發(fā)明用于示例性 生產(chǎn)L-巖藻糖的途徑的必不可少的示意性部分（B);
[0079] 圖2列出寡核苷酸引物的表，該寡核苷酸引物用來(lái)產(chǎn)生用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的微 生物的DNA片段；
[0080] 圖3色譜圖（薄層色譜），示出在根據(jù)本發(fā)明的微生物的上清中存在示例性實(shí)施方 式L-巖藻糖，所述微生物生長(zhǎng)于蔗糖（A)或甘油（B);
[0081] 圖4HPLC色譜圖，示出由生長(zhǎng)于甘油（A)或蔗糖（B)的根據(jù)本發(fā)明的重組微生物 生產(chǎn)L-巖藻糖。保留時(shí)間為2. 2分鐘、4. 6分鐘和9. 8分鐘的峰分別對(duì)應(yīng)于L-巖藻糖、乳 果糖和麥芽三糖（內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)）。
[0082] 圖5HPLC色譜圖，示出將β-半乳糖苷酶加入發(fā)酵培養(yǎng)基的影響，其中圖5Α示出 在β-半乳糖苷酶添加以前發(fā)酵培養(yǎng)基的HPLC色譜圖，并且其中圖5Β示出在β-半乳糖 苷酶添加以后的HPLC色譜圖；以及
[0083] 圖6是獲自細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)純化的L-巖藻糖的IH-NMR譜。 實(shí)施例
[0084] 如在圖IA在示意性地所示的，根據(jù)本發(fā)明的方法，以及在上述方法中使用的微生 物，利用存在于微生物中的核苷酸激活的單糖，并經(jīng)由糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活性，將單糖部分轉(zhuǎn) 移到受體，其可以是內(nèi)源性地存在于微生物中和/或外部提供的，以形成受體-單糖-底物 或復(fù)合物。通過(guò)糖苷酶（水解酶）的酶活性，單糖釋放自受體-單糖-底物并可以以游離 形式獲?。ㄒ?jiàn)圖1Α)。
[0085] 作為示例性單糖，在重組大腸桿菌菌株中L-巖藻糖產(chǎn)生自的蔗糖或甘油。圖IB示 出用于生產(chǎn)L-巖藻糖的示意性途徑的一部分。在微生物中，經(jīng)由從頭途徑來(lái)合成⑶P-巖藻 糖以及在2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)中乳果糖用作示例性受體底物。通過(guò)1，2-a-L-巖 藻糖苷酶水解糖苷鍵釋放L-巖藻糖（見(jiàn)圖1Β)。
[0086] 開(kāi)發(fā)大腸桿菌L_巖藻糖牛產(chǎn)菌株
[0087] 通過(guò)利用如由Ellis et al.，2001描述的錯(cuò)配-寡核苷酸的誘變，首先在大腸 桿菌BL21 (DE3) (Novagen)中將IacZ失活（見(jiàn)圖2A表1)。利用引物605和606 (使用 的所有引物列于圖2B的表2)，自大腸桿菌K12TG1擴(kuò)增gal-操縱子（galETKM)，然后 借助于通過(guò)利用紅色重組酶輔助質(zhì)粒PKD46促進(jìn)的同源重組插入大腸桿菌BL21 (DE3) IacZ 的 galM ybhj 基因座（Datsenko and Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products"，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000))。接著，通過(guò)寡核苷酸誘變來(lái)將araA失活。在菌株 大腸桿菌 BL21 (DE3) IacZ Gal+ araA 中刪除基因 wcaj。根據(jù) Datsenko 和 Warner ((2000)， 見(jiàn)上文）的方法來(lái)進(jìn)行基因組缺失。WcaJ可能編碼UDP-葡萄糖：十一異戊烯磷酸 葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶，其催化在莢膜異多糖酸（colanic acid)合成中的第一步驟 (Stevenson et al. , "Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid", J. Bacteriol. 178:4885-4893 ; (1996));莢膜異多糖酸的生產(chǎn)將與巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng) ⑶P-巖藻糖。為了防止L-巖藻糖的細(xì)胞內(nèi)降解，已從大腸桿菌菌株BL21(DE3)lacZ Gal+ araA AwcaJ的基因組刪除編碼L-巖藻糖異構(gòu)酶（fuel)和L-墨角藻糖激酶（fucK)的基 因。
[0088] 利用質(zhì)粒pINT2-lacY_aadA(附錄序列1)作為模板，借助于引物1119和 1120來(lái)擴(kuò)增乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因 lacY，其最初來(lái)自大腸桿菌K12 TGl (登錄號(hào)ABN72583)， 以及前面的啟動(dòng)子Ptrt和FRT-位點(diǎn)側(cè)接的鏈霉素抗性基因。得到的PCR產(chǎn)物在 兩個(gè)位點(diǎn)上攜帶用于EZ-Tn5轉(zhuǎn)座酶的19-bp Mosaic End (嵌合末端）識(shí)別位點(diǎn)。 EZ-Tn5〈Ptet-lacY-FRT-aadA-FRT> 轉(zhuǎn)座子用來(lái)產(chǎn)生具有 EZ-Tn5?轉(zhuǎn)座酶（Epicentre, USA) 的 EZ_Tn5 轉(zhuǎn)座體，借此，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3) IacZ Gal+ araA AwcaJ AfucI AfucK 的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)編碼在質(zhì)粒pCP20上的FLP重組酶（Datsenko和Warner，見(jiàn)上 文）來(lái)從耐鏈霉素