用于產(chǎn)生單糖的方法
【專利說明】用于產(chǎn)生單糖的方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生單糖、尤其是用于產(chǎn)生L-巖藻糖或其他稀有單糖例如N-乙 ?；窠?jīng)氨酸的方法，借此在該生產(chǎn)方法中使用微生物。
[0002] 通過在能量儲存、結(jié)構(gòu)功能、信號傳導(dǎo)、信息存儲等中承擔(dān)關(guān)鍵功能，糖類在所有 形式的生命中是必要的。對于此任務(wù)，自然界合成了幾種主要單糖如葡萄糖、甘露糖、果糖、 巖藻糖、核糖、唾液酸等，以及用于更加專門應(yīng)用的若干次要單糖，如例如D-阿洛糖。
[0003] 雖然一些單糖可以大量地并以合理的成本獲自自然界（例如葡萄糖和果糖）， 但大多數(shù)單糖是相當(dāng)稀有的并且僅可以少量存在于自然界中，如例如L-巖藻糖（6-脫 氧-L-半乳糖）。
[0004] 對于單糖的商業(yè)化生產(chǎn)，幾乎僅有獲自自然界的寡糖被用作來源。這些寡糖是酸 水解的并且從釋放的單糖來純化單種糖。由于單糖的高化學(xué)相似性（彼此之間的差異大部 分僅在于個別羥基的取向），所以以純形式分離單種單糖是相當(dāng)費力和昂貴的。
[0005] L-巖藻糖代表這樣的稀有糖，其目前是經(jīng)由復(fù)雜寡糖的水解而獲自藻類或細(xì)菌來 源。為了從復(fù)雜的水解產(chǎn)物來純化單種單糖，經(jīng)常必須使用有毒化學(xué)物質(zhì)，如例如乙酸鉛 和過量的有機溶劑。因此，從寡糖的復(fù)雜的水解產(chǎn)物來分離單種單糖具有挑戰(zhàn)性（由于釋 放的單種單糖的高化學(xué)相似性）并且是環(huán)境有害的（由于過度使用有毒化學(xué)物質(zhì)，如碳酸 鉛）。此外，在自然界中在某些糖中富含的寡糖的可用性可以是相當(dāng)受限制的并且也是高度 可變的（由于季節(jié)變化）。L-巖藻糖代表這樣的稀有單糖，其傳統(tǒng)上是通過含巖藻糖的多 糖的酸水解來獲得的。巖藻糖主要源自多糖巖藻多糖，一種巖藻聚糖單硫酸酯，存在于所有 常見的棕色海草中，其包括鹿角菜科（Fucaceae)和海帶科（Laminariaceae)。今天，L-巖 藻糖的大量獲得主要是通過采集屬于鹿角菜科的棕色海草，其可在全球范圍內(nèi)找到，但大 量存在于大西洋的歐洲海岸。從海岸大規(guī)模收獲棕色海草起環(huán)境關(guān)注并且受限于某些環(huán)保 法規(guī)。
[0006] 例如，JP 2000351790公開了用于提取巖藻多糖和用于從提取的巖藻多糖來獲得 和分離含巖藻糖的寡糖的方法。
[0007] 除從棕色海草水解巖藻多糖之外，最近，專利出版物表明，還可以經(jīng)由包含天然存 在的L-巖藻糖的細(xì)菌多糖的水解來獲得L-巖藻糖：W0 2012/034996 Al公開了屬于腸桿 菌科（Enterobacteriaceae)的菌株，該菌株能夠產(chǎn)生包含L-巖藻糖的胞外多糖。為了生 產(chǎn)L-巖藻糖，回收通過上述菌株產(chǎn)生的多糖并對其進(jìn)行水解，例如通過用硫酸或鹽酸加以 處理。
[0008] 除從多或寡糖水解產(chǎn)物提取L-巖藻糖之外，還已經(jīng)開發(fā)了開始于其他單糖如 L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和D-葡萄糖的用于L-巖藻糖的若干合成途 徑。通常，這些化學(xué)合成的產(chǎn)率往往相當(dāng)差并且涉及若干步驟。除涉及若干合成步驟之外， 大量的保護基團化學(xué)反應(yīng)還必須用于L-巖藻糖的化學(xué)合成。通常，相比于從自然界提取， 還沒有證明單糖的大規(guī)?；瘜W(xué)合成是經(jīng)濟上可行的。
[0009] 因此，目前，以純形式制備任何單糖在將其他單糖與目標(biāo)單糖純化分開方面需要 顯著努力，往往涉及大量的有機溶劑和其他有毒化學(xué)物質(zhì)。因此，單一的所期望的單糖如例 如L-巖藻糖的排他積累會是非常有用的。大多數(shù)微生物在它們能夠利用的單糖的種類方 面是受限的。此外，在同時可以獲得幾種單糖作為碳源時，它們對某些單糖經(jīng)常施加強的偏 好。
[0010] 鑒于上述，本發(fā)明的一個目的是提供用于生產(chǎn)游離形式的單一所期望的單糖的新 方法，借此，可以快速和有效地，即大規(guī)模和成本有效地獲得單糖而沒有負(fù)面的環(huán)境影響。
[0011] 通過用于產(chǎn)生單糖的方法，即大規(guī)模地、以游離形式、并利用微生物來實現(xiàn)上述和 其他目的，該方法包括以下步驟：
[0012] a)提供微生物，其具有用于合成單糖的以下酶活性：i)糖基轉(zhuǎn)移酶，其特異性地 能夠?qū)翁菑幕罨暮塑账釂翁寝D(zhuǎn)移到受體-底物以形成受體-單糖-底物，以及ii)糖 苷酶，其能夠從受體-底物釋放單糖；其中微生物不能代謝該單糖；
[0013] b)在適合生長微生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，借此產(chǎn)生游離形式的單糖，
[0014] c)從培養(yǎng)基回收游離單糖。
[0015] 此外，通過微生物、優(yōu)選重組宿主微生物解決該目標(biāo)，以及它在生產(chǎn)游離形式的單 糖中的應(yīng)用，該微生物包含i)糖基轉(zhuǎn)移酶，其特異性地能夠?qū)翁菑幕罨暮塑账釂翁寝D(zhuǎn) 移到受體-底物以形成受體-單糖-底物，以及ii)糖苷酶，其能夠從受體-底物釋放單糖； 其中微生物不能代謝單糖。
[0016] 以這種方式來完全實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0017] 先前從未描述過申請人的方法，并且使用微生物，該微生物具有兩種特定酶活性， 即糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶，其中糖基轉(zhuǎn)移酶特異性地能夠?qū)翁菑幕罨暮塑账釂翁牵ㄆ涫?內(nèi)源性存在的或外部提供的）轉(zhuǎn)移到受體-底物使得形成受體-單糖-底物。在隨后的步 驟中，糖苷酶從受體-底物釋放單糖使得提供游離單糖。
[0018] 雖然在本發(fā)明中可以采用具有上述酶促特點的未修飾的微生物，但根據(jù)本發(fā)明的 一個方面，微生物是重組微生物，其中重組微生物已被轉(zhuǎn)化以包含以下至少之一 ：i)編碼 并不天然存在于微生物中的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列，和/或ii)編碼并不天然存在于所述 微生物中的糖苷酶的核酸序列。換句話說，可以轉(zhuǎn)化重組微生物以包含編碼并不天然存在 于微生物中的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列，或編碼并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核 酸序列，或可以轉(zhuǎn)化重組微生物以包含兩者，即編碼并不天然存在于微生物中的糖基轉(zhuǎn)移 酶的核酸序列和編碼并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列。
[0019] 借助于新提供的方法和新提供的微生物（重組或未重組的），首次可以以游離形 式并大量地產(chǎn)生所期望的單糖，而不需要化學(xué)品或繁復(fù)的工藝步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法代 表微生物發(fā)酵方法，該方法適合用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)稀有或其他單糖，其可以容易地獲取 自在其中培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基。
[0020] 通過使用根據(jù)本發(fā)明的微生物，即表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物，可以進(jìn)行內(nèi)源的或 外部提供的受體-底物的有效的巖藻糖基化，并且通過同時表達(dá)糖苷酶，可以產(chǎn)生在培養(yǎng) 基中大量的游離單糖的前所未有的積累。在存在受體底物的情況下，在游離單糖的合成中， 糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶一起協(xié)同工作，從而僅需要催化量的適宜受體。因此，通過糖基轉(zhuǎn)移 酶，所提供的受體底物被巖藻糖基化，并且通過接受糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的糖基化產(chǎn)物的糖苷 酶的作用再循環(huán)（recycle)所產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物。
[0021] 如在本文中所使用的以及如在本發(fā)明的領(lǐng)域中通常理解的，表述"單糖"是指糖 類（碳水化合物，carbohydrates)的最基本單元。單糖是糖的最簡單形式并且通常是無色 的、水溶性的、結(jié)晶固體。單糖的實例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖和核糖。單糖是二糖 (disaccharides)如鹿糖以及多糖如纖維素和淀粉的結(jié)構(gòu)單元。如在本文中所使用的以及 如在現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)中通常理解的，"寡糖〃是指包含兩個或更多個單糖的糖聚合物。
[0022] 術(shù)語〃編碼…的核酸序列〃通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其 可以是未修飾的RNA或DNA或者修飾RNA或DNA，并且通常表示編碼某些多肽或蛋白的基 因。該術(shù)語包括但不限于單鏈和雙鏈DNA ;為單鏈和雙鏈區(qū)或單鏈、雙鏈和三鏈區(qū)的混合物 的DNA ;單鏈和雙鏈RNA ;以及為單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的RNA ;包含DNA和RNA的雜合分 子，其可以是單鏈的，或更通常地是雙鏈、或三鏈區(qū)，或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。該術(shù)語還包 括多核苷酸，上述多核苷酸包括單一連續(xù)區(qū)或不連續(xù)區(qū)，其編碼多肽（例如，由整合的噬菌 體或插入序列或剪切（editing)所中斷），連同另外的區(qū)，其還可以含有編碼和/或非編碼 序列。
[0023] 在這種情況下，術(shù)語〃多肽〃是指任何肽或蛋白，其包含通過肽鍵或修飾肽鍵彼此 連接的兩個或更多個氨基酸。"多肽"是指短鏈以及長鏈兩者，短鏈通常被稱為肽、寡肽和 寡聚物，長鏈一般被稱為蛋白質(zhì)。多肽可以包含這樣的氨基酸，其不同于20種基因編碼的 氨基酸。"多肽"包括通過天然過程如加工和其他翻譯后修飾以及通過化學(xué)修飾技術(shù)加以 修飾的那些。應(yīng)該理解的是，在給定多肽的若干位點處可以以相同或不同程度存在相同類 型的修飾而基本不改變多肽的活性。此外，給定多肽可以包含許多類型的修飾。修飾可發(fā) 生在多肽中的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。
[0024]目前，以及在整個本發(fā)明中，術(shù)語"糖基轉(zhuǎn)移酶"表明和包括這樣的酶，其負(fù)責(zé)二 糖、寡糖和多糖的生物合成，并且它們催化單糖部分從活化的核苷酸單糖/糖（〃糖基供 體"）到糖基受體分子的轉(zhuǎn)移。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，特別優(yōu)選的是，糖基轉(zhuǎn)移酶是細(xì)菌巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，并 且優(yōu)選是由大腸桿菌：0126的wbgL基因（基因庫（genebank)登錄號ADN43847)編碼的 α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0026] 因此，術(shù)語〃 α -1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶〃或〃巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶〃或編碼〃 α -1，2-巖 藻糖基轉(zhuǎn)移酶"或"巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶"的核酸/多核苷酸是指這樣的糖基轉(zhuǎn)移酶，其催化 巖藻糖從供體底物例如GDP-巖藻糖到受體分子（在α-1,2-鍵中）的轉(zhuǎn)移。受體分子可 以是糖類、寡糖、蛋白質(zhì)或糖蛋白、或者脂質(zhì)或糖脂，并且可以是，例如，N-乙?；咸前?、 N-乙?；樘前?、半乳糖、巖藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖或它們的任何組合。
[0027] 如在整個本發(fā)明中使用的以及如在相關(guān)領(lǐng)域中所理解的，"糖苷酶"或"能夠從受 體-底物釋放單糖的糖苷酶"包含任何糖苷（或糖基）水解酶，其催化糖苷鍵的水解以釋放 較小的糖，如單糖。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，特別優(yōu)選的是，如果糖苷酶是細(xì)菌糖苷酶，則優(yōu)選細(xì)菌 a -L-巖藻糖苷酶。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，使用來自兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bif