黃瓜品種或品系刺瘤密度的選擇效率和質(zhì)量，將大大縮短稀刺或密刺高品質(zhì)黃瓜的育種 年限，具有很高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及鑒定方法能夠在DNA水平 上對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，有助于建立稀/密刺瘤黃瓜的分子標(biāo)記輔助育種體系，便于快速、 高通量地應(yīng)用于黃瓜育種實(shí)踐中。
【附圖說明】
[0012] 圖1是分子標(biāo)記MMl對親本及F2代交換個(gè)體的分析結(jié)果圖。
[0013] 圖2是分子標(biāo)記MM2對親本及F2代交換個(gè)體部分隨機(jī)植株的分析結(jié)果圖。
[0014] 圖3是分子標(biāo)記麗3對親本及F2代交換個(gè)體的分析結(jié)果圖。
[0015] 圖4是用分子標(biāo)記麗3對現(xiàn)有24種不同地域代表性黃瓜稀、密刺瘤品系檢測的 PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0016] 圖5是與稀刺瘤基因 fsl連鎖的分子標(biāo)記示意圖。其中數(shù)字代表交換個(gè)體的個(gè)數(shù)， 其中麗1和麗2是兩個(gè)與稀刺基因 fsl連鎖非常緊密的標(biāo)記，區(qū)間為110 kb ;麗3是與稀刺 瘤基因 fsl完全連鎖的分子標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均 可從商業(yè)途徑得到。
[0018] 實(shí)施例1遺傳分離群體的構(gòu)建 以華北型黃瓜自交系9930為母本，以華北型黃瓜自交系山農(nóng)CNS5為父本。其母本黃 瓜自交系9930果實(shí)表型為密刺瘤；其父本黃瓜自交系山農(nóng)CNS5,是從華北型黃瓜農(nóng)城2號(hào) 自交系山農(nóng)CNS2中分離出來的自然突變體，其果實(shí)表型表現(xiàn)為稀刺瘤。
[0019] 利用這兩個(gè)親本配制了雜交組合，得到F1果實(shí)的刺瘤密度介于兩親本之間，F(xiàn) 1R 自交產(chǎn)生F2代群體，隨機(jī)選了 78株用于進(jìn)行遺傳分離規(guī)律分析。
[0020] 在78株F2的個(gè)體中，統(tǒng)計(jì)每個(gè)植株果實(shí)刺瘤密度，卡方分析法分析密刺/稀刺性 狀的分離比，最后確定了在這個(gè)群體中黃瓜果實(shí)稀刺瘤性狀是單基因控制的隱性性狀，且 命名黃瓜刺瘤密度基因中控制稀刺瘤性狀的基因?yàn)橄〈袒?fsl，控制密刺瘤性狀的基因 為密刺基因 FSl。
[0021] 實(shí)施例2黃瓜全基因組重測序 米用群體分尚分析法（BSA)從？2分尚群體中分別隨機(jī)選取稀刺瘤和密刺瘤個(gè)體各20 株，建立稀刺瘤黃瓜（fsl fsl)和密刺瘤黃瓜（FS1_)的基因池。
[0022] 將構(gòu)建好的稀刺瘤黃瓜（fsl fsl)和密刺瘤黃瓜（FS1_)基因池送至上海美吉生 物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行黃瓜全基因組重測序。
[0023] 將測序獲得的SNP標(biāo)記與刺瘤密度表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將控制黃瓜稀刺表型 的稀刺基因 fsl定位到了 6號(hào)染色體的長臂末端。
[0024] 實(shí)施例3分子標(biāo)記的開發(fā) 分析黃瓜全基因組重測序得到的SNP標(biāo)記結(jié)果，根據(jù)稀刺基因 fsl的位置，設(shè)計(jì)標(biāo)記引 物，用設(shè)計(jì)的CAPS標(biāo)記引物和SNP標(biāo)記引物，對兩個(gè)親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用1. 2%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(所述1. 2%瓊脂糖凝膠是指100 ml的TBE緩沖液中含有I. 2 g瓊脂糖粉)。
[0025] 從設(shè)計(jì)的CAPS標(biāo)記和SNP標(biāo)記中篩選出以下6種標(biāo)記對兩個(gè)親本間進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，其擴(kuò)增引物、限制性內(nèi)切酶以及擴(kuò)增片段的結(jié)果見表1。
[0026] 表1 6種分子標(biāo)記的標(biāo)記引物序列及擴(kuò)增片段結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記，其特征在于，該分子標(biāo)記為分子標(biāo)記 麗1、分子標(biāo)記麗2或分子標(biāo)記麗3中的一種； 所述分子標(biāo)記麗3由SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 10所示的核苷 酸序列組成，其中SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列與黃瓜密刺基因FSl完全連鎖，SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列與黃瓜稀刺基因fsl完全連鎖； 所述分子標(biāo)記麗2由SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6所示的核苷 酸序列組成；其中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列與黃瓜密刺基因FSl緊密連鎖，SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列與黃瓜稀刺基因fsl緊密連鎖； 所述分子標(biāo)記麗1由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 2所示的核苷 酸序列組成；其中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列與黃瓜密刺基因FSl緊密連鎖，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列與黃瓜稀刺基因fsl緊密連鎖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記，其特征在于，所述 分子標(biāo)記麗1是由SEQ ID NO: 3所示的上游引物和SEQ ID NO: 4所示的下游引物擴(kuò)增得 到。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記，其特征在于，所述 分子標(biāo)記麗2是由SEQ ID NO: 7所示的上游引物和SEQ ID NO: 8所示的下游引物擴(kuò)增得 到。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記，其特征在于，所述 分子標(biāo)記麗3是由SEQ ID NO: 11所示的上游引物和SEQ ID NO: 12所示的下游引物擴(kuò)增 得到。
5. -種權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記用于定位或檢測黃瓜刺瘤密度基因在黃瓜育種中 的用途。
6. -種快速鑒定黃瓜刺瘤稀密品種或品系的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 用分子標(biāo)記麗3的標(biāo)記引物對待測黃瓜品種或品系的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其 PCR擴(kuò)增體系為：基因組DNA 50 ng，上、下游引物均為10 ymol/L，200 ymol/L dNTPs， IXEasyTaq Buffer緩沖液，I. 5 U EasyTaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10 y L ;PCR擴(kuò)增程序 為：94°C預(yù)變性 2 min ;94°C變性 30 s ;58°C退火 30 s ;72°C延伸 2. 5 min ;35 個(gè)循環(huán)，72°C 后延伸10 min，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (2) 將所述擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離后，如獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)分子量為1475 bp的條帶， 則說明該品種為密刺瘤黃瓜的品種或品系，如獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)了分子量為2277 bp的一種條帶，則說明該品種為稀刺瘤黃瓜的品種或品系。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速鑒定黃瓜刺瘤稀密品種或品系的方法，其特征在于，步 驟（1)所述分子標(biāo)記麗3的標(biāo)記引物的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 11所示、下 游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 12所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速鑒定黃瓜刺瘤稀密品種或品系的方法，步驟（2)中所述 的電泳分離是指在1. 2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，所述1. 2%瓊脂糖凝膠是指100 ml的TBE 緩沖液中含有I. 2 g瓊脂糖粉。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記為分子標(biāo)記MM3、分子標(biāo)記MM1或分子標(biāo)記MM2；所述分子標(biāo)記MM3由SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列組成，其中SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列與黃瓜密刺基因FS1完全連鎖，SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列與黃瓜稀刺基因fs1完全連鎖；同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種利用分子標(biāo)記MM3快速鑒定黃瓜品種或品系刺瘤稀密的方法。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及鑒定方法有助于建立稀/密刺瘤黃瓜的分子標(biāo)記輔助育種體系；并將其應(yīng)用于黃瓜育種實(shí)踐中，不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約生產(chǎn)成本，大大提高目標(biāo)黃瓜品種或品系刺瘤類型的選擇效率和質(zhì)量，具有很高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104805216
【申請?zhí)枴緾N201510261703
【發(fā)明人】任仲海, 張海洋, 曹辰興, 王麗娜, 李強(qiáng)
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月21日