一種快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密 的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的園藝作物之一，在世界范圍內(nèi)廣泛地栽培。由于黃瓜 品質(zhì)的高低直接關(guān)系著黃瓜種植的效益，因此，高品質(zhì)育種一直是黃瓜育種工作中的重中 之重。我國(guó)黃瓜品種的類(lèi)型主要分為華北型和華南型，這兩種類(lèi)型的黃瓜各有優(yōu)缺點(diǎn)，主要 表現(xiàn)在華南型大多數(shù)為稀刺瘤品種，但黃瓜風(fēng)味清淡；華北型黃瓜風(fēng)味濃郁，但多為密刺瘤 品種。對(duì)于密刺的華北型黃瓜來(lái)說(shuō)，黃瓜在生產(chǎn)過(guò)程中，農(nóng)藥大量使用，與光滑型黃瓜相比， 密刺瘤黃瓜不易清洗，造成農(nóng)藥殘留較多，并且不利于包裝和運(yùn)輸。因此，在黃瓜育種過(guò)程 中，有目的地選育稀刺品種是提高黃瓜外觀品質(zhì)的一個(gè)重要研宄方向。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，已有一些科研人員對(duì)黃瓜的外觀品質(zhì)做了相關(guān)研宄。如曹辰興等研 宄了黃瓜果刺基因與果瘤基因相互作用，且證明果刺基因?qū)龌虼嬖陔[性上位作用， 使黃瓜果實(shí)表現(xiàn)為有瘤有刺、無(wú)瘤有刺、無(wú)瘤無(wú)刺三種表型(黃瓜莖葉無(wú)毛性狀與果實(shí)瘤 刺性狀的遺傳關(guān)系·園藝學(xué)報(bào)，2001,28(6): 565-566)。又如Yang等在《Tuberculate fruit gene Tu encodes a C2H2 zinc finger protein that is required for the warty fruit phenotype in cucumber (Cucumis sativus L·)》中報(bào)道了在黃瓜中控制果瘤性狀 的基因，并且該基因已被定位并克隆，且獲知該基因位于5號(hào)染色體上，編碼了一個(gè)C2H 2鋅 指蛋白，控制著黃瓜果實(shí)表面果瘤的產(chǎn)生（《The Plant Journal》（植物學(xué)雜志）.2014年 第78 卷第3 期 1034 - 1046 頁(yè)）。此外，Li 等在《The identification of Cucumis sativus Glabrous I (CsGLl) required for the formation of trichomes uncovers a novel function for the homeodomain-leucine zipper I gene》報(bào)道了位于 3 號(hào)染色體上的無(wú) 果刺基因（CsGLl)也已被定位并克隆，編碼了一個(gè)HD-Zip I類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，控制著黃瓜地上 部分表皮毛以及果實(shí)表面賭粉的發(fā)育（《Journal of Experimental Botany》（實(shí)驗(yàn)植物學(xué) 雜志）2015年3月）。但是，迄今為止，還未見(jiàn)有與黃瓜刺瘤密度相關(guān)的基因被定位或克隆 的相關(guān)報(bào)道。
[0004] 圖位克隆技術(shù)是通過(guò)構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子 標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域，進(jìn)而定位并克隆該基因。DNA分子標(biāo)記是DNA水平上遺傳多態(tài)性 的直接反映。DNA水平的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異，包括單個(gè)核苷酸的變 異。CAPS標(biāo)記是特異引物PCR產(chǎn)物與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標(biāo)記，它實(shí)際上 是一些特異引物PCR標(biāo)記(如SCAR和STS)的一種延伸，它揭示的是特異PCR產(chǎn)物DNA序列 內(nèi)限制性酶切位點(diǎn)變異的信息，也表現(xiàn)為限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。SNP標(biāo)記是基于單個(gè)核 苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記，SNP數(shù)量豐富，可以進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。
[0005] 由于還未有黃瓜刺瘤密度基因被定位及克隆的報(bào)道，目前，與黃瓜刺瘤密度相關(guān) 的育種工作，仍靠育種者在黃瓜結(jié)實(shí)后對(duì)果實(shí)刺瘤性狀的觀察來(lái)進(jìn)行篩選，這樣育種研宄 人員不但無(wú)法在苗期進(jìn)行選擇，而且也很難對(duì)刺瘤密度基因進(jìn)行小片段的精確轉(zhuǎn)移。因此， 在黃瓜遺傳育種中，非常有必要開(kāi)發(fā)一種與刺瘤密度緊密連鎖或完全連鎖的分子標(biāo)記，以 便在苗期進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，以加快黃瓜稀刺或密刺高品質(zhì)類(lèi)型的選育進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng) 用，以利用該分子標(biāo)記對(duì)黃瓜刺瘤密度基因進(jìn)行定位和檢測(cè)，在黃瓜品種選育中對(duì)其親本 進(jìn)行有目的地選擇，為選育目標(biāo)刺瘤類(lèi)型的黃瓜新品種提供指導(dǎo)依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的：一種快速鑒定黃瓜品系刺瘤稀密的分子標(biāo)記，該 分子標(biāo)記為分子標(biāo)記MMl、分子標(biāo)記MM2或分子標(biāo)記MM3中的一種； 所述分子標(biāo)記MM3是與黃瓜刺瘤密度基因完全連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記MM3由 SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列組成，其中SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列與黃瓜密刺基因 FSl完全連鎖，SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列 與黃瓜稀刺基因 fsl完全連鎖；所述分子標(biāo)記麗3是由SEQ ID NO: 11所示的上游引物和 SEQ ID NO: 12所示的下游引物擴(kuò)增得到； 所述分子標(biāo)記MM2是與黃瓜刺瘤密度基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記MM2由 SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列組成；其中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列與黃瓜密刺基因 FSl緊密連鎖，SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列與黃 瓜稀刺基因 fsl緊密連鎖；所述分子標(biāo)記MM2是由SEQ ID NO: 7所示的上游引物和SEQ ID NO: 8所示的下游引物擴(kuò)增得到； 所述分子標(biāo)記MMl是與黃瓜刺瘤密度基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記MMl由 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列組成；其中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列與黃瓜密刺基因 FSl緊密連鎖，SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列與黃 瓜稀刺基因 fsl緊密連鎖；所述分子標(biāo)記MMl是由SEQ ID NO: 3所示的上游引物和SEQ ID NO: 4所示的下游引物擴(kuò)增得到。
[0008] 本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在黃瓜育種中的用途是定位或檢測(cè)待測(cè)黃瓜品種或品系 中刺瘤密度基因。
[0009] 一種快速鑒定黃瓜刺瘤稀密品種或品系的方法，包括以下步驟： (1) 用分子標(biāo)記麗3的標(biāo)記引物對(duì)待測(cè)黃瓜品種或品系的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其 ?〇?擴(kuò)增體系包括：基因組0嫩50叩，上、下游引物均為10以111〇1/1，200 4111〇1/1(1階1^， I XEasyTaq Buffer緩沖液，I. 5 U EasyTaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10 μ L，PCR擴(kuò)增程序 為：94°C預(yù)變性 2 min ;94°C變性 30 s ;58°C退火 30 s ;72°C延伸 2. 5 min ;35 個(gè)循環(huán)，72°C 后延伸10 min，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (2) 將所述擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離后，如獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)分子量為1475 bp的條帶， 則說(shuō)明該品種為密刺瘤黃瓜品種或品系，如獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)了分子量為2277 bp 的一種條帶，則說(shuō)明該品種為稀刺瘤黃瓜品種或品系。
[0010] 步驟（2)中所述的電泳分離是指在1. 2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，所述1. 2%瓊脂 糖凝膠是指100 ml的TBE緩沖液中含有I. 2 g瓊脂糖粉。
[0011] 本發(fā)明提供三個(gè)分子標(biāo)記：其中分子標(biāo)記MMl和分子標(biāo)記MM2與黃瓜刺瘤密度基 因緊密連鎖，MMl為SNP分子標(biāo)記，MM2為CAPS分子標(biāo)記，與黃瓜稀刺瘤基因 fsl物理距離 為110 Kb左右，其黃瓜的稀刺基因 fsl在所述的兩個(gè)分子標(biāo)記之間（如圖5所示);且本發(fā)明 還特別地在分子標(biāo)記MMl和分子標(biāo)記MM2區(qū)間找到了一個(gè)與黃瓜稀刺基因 fsl完全連鎖的 分子標(biāo)記MM3,并利用該分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)了快速鑒定黃瓜品種或品系刺瘤稀密的方法，即利用 開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記用于檢測(cè)和定位待測(cè)黃瓜品種或品系中是否含有稀刺基因 fsl和密刺瘤 基因 FSl的情況，進(jìn)而鑒定不同黃瓜品種或品系的刺瘤密度。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及鑒 定方法不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約生產(chǎn)成本，大大提高目 標(biāo)