基于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的黔北麻羊fshr基因組織表達(dá)譜的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的黔北麻羊FSHR基 因組織表達(dá)譜的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 促卵泡素 （Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)是腦腺垂體分泌的對(duì)卵巢卵泡 生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和成熟起重要作用的生殖類激素。其為生物大分子，不能透過細(xì)胞膜，必須 與促卵泡素受體（follicile stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)結(jié)合才能發(fā)揮其生物 學(xué)功能。FSHR是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員之一，其受體蛋白肽鏈在功能和結(jié)構(gòu)上可以 分為三個(gè)部分：胞內(nèi)域、跨膜域和胞外域，即4個(gè)包質(zhì)區(qū)、7個(gè)跨膜疏水區(qū)和N端的3個(gè)環(huán)狀 區(qū)組成的細(xì)胞外區(qū)。促卵泡素對(duì)雌性動(dòng)物的繁殖性能具有重要的作用。然而，促卵泡素必 須與促卵泡素受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。所以，促卵泡素受體的質(zhì)量和數(shù)量決定促卵泡素生 物學(xué)功能是否充分發(fā)揮。或者說，F(xiàn)SHR含量的多少可能與雌性動(dòng)物的繁殖性能有一定的作 用。
[0003] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它 具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、敏感性高、特異性強(qiáng)、有效解決了 PCR污染的問題、自動(dòng)化程度高 等特點(diǎn)。山羊FSHR基因已有研宄表明對(duì)山羊的繁殖性能有一定的影響，但其生物學(xué)機(jī)理扔 不清楚。我們應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立山羊FSHR基因在不同組織中的表達(dá)譜，對(duì) 于闡明FSHR基因表達(dá)的作用機(jī)理具有一定的指導(dǎo)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是：提供一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因組織表達(dá) 譜的建立方法，它具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、敏感性高、特異性強(qiáng)、有效解決了 PCR污染的問 題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，比采用其它方法來建立組織表達(dá)譜適應(yīng)性更強(qiáng)。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因組織表達(dá) 譜的建立方法，采用Trizol法分別提取已屠宰的發(fā)情期產(chǎn)單羔和產(chǎn)雙羔母羊的5種組織 的總RNA，所述的5種組織包括下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮；并對(duì)提取的總RNA進(jìn) 行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成；以上述cDNA為模板，分別對(duì)FSHR和GAPDH進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增； FSHR上游引物的序列為5 ' - CGAGTCATCCCAGAAGGAG-3 '，F(xiàn)SHR下游引物的序列為5 ' -GGCAGGTTGGAGAACACATT- 3'； GAPDH上游引物的序列為5' -CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA -3'， GAPDH:下游引物的序列為5' -GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT- 3'；回收相應(yīng)條帶并與T-載 體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并將獲得的重組質(zhì)粒 進(jìn)行10倍比稀釋后，將其作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線；焚光定量 PCR每個(gè)樣品，并用CldH2O做陰性對(duì)照；采用2^λλ et定量分析方法對(duì)山羊FSHR基因在發(fā)情 期不同組織進(jìn)行差異表達(dá)量分析，構(gòu)建組織表達(dá)譜。
[0006] 所述的對(duì)對(duì)FSHR和GAPDH進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)條件為：95 °C預(yù)變性3 min;95 °C變性 30 s，58 °C 退火 30 s，72 °C延伸 30 min，34 個(gè)循環(huán)；最后 72 °C延伸 5 min， 4 °C 保存；反應(yīng)體系為 20 yL:2XTaqPCRMasterMix 10 yL，DNA 模板 2 yL，上、下游 引物各1.5 μ L，加水至20 μ L。
[0007] 所述的回收相應(yīng)條帶并與T-載體連接，具體反應(yīng)體系如下：膠回收的PCR產(chǎn)物 3 yL ;pUCm-T 載體 I yL ;10XLigation Buffer I yL ;5〇%PEG 4000 μ I ;Sterilized ddH20 3 μL ;Τ4 DNA Ligation I yL;混勻，16 °C連接過夜。
[0008] 所述的轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化步驟如下：取100 μ L感受態(tài)細(xì)胞，置于冰 上，完全解凍后將細(xì)胞均勻懸浮；將上述的連接液全部加入感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰上放置30 min ;42°C水浴熱激90 s，冰上放置15~20 min;加 400 μ L SOC培養(yǎng)基，37 °C 200~250 rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；室溫下4000rpm離心5 min，用槍頭吸掉400 μ 1上清液，用剩余的培 養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮；將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20 μ L IOOMm IPTG和100 μ L 20mg/ml X-gal涂 布的氨芐青霉素平板上；平板在37°C下正向放置1小時(shí)以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng) 過夜。
[0009] 所述的構(gòu)建組織表達(dá)譜，具體是：首先計(jì)算各組織樣品的目的基因與內(nèi)參基因的 Ct差值(Λ Ct= Λ Ctgwaffl - Λ Ct_SH )，然后計(jì)算每個(gè)組織樣品Λ Ct平均值，選取垂體組 織為對(duì)照，用其它組織樣Λ Ct減去垂體組織的Λ Ct，即ΛΛ Ct= (ΛΛ Ct目的基Η - ΛΛ Ct內(nèi) 參基因）試驗(yàn)組_ (AA Ct目醜因_ ΔΔ Ctpi3參基因）對(duì)照組。
[0010] 由于采用了以上技術(shù)方案，本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立山羊FSHR基 因在不同組織中的表達(dá)譜，對(duì)于闡明FSHR基因表達(dá)的作用機(jī)理具有一定的指導(dǎo)作用。而且 它具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、敏感性高、特異性強(qiáng)及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，還有效解決了 PCR 污染的問題，因此比采用其它方法來建立組織表達(dá)譜適應(yīng)性更強(qiáng)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于實(shí) 施，成本低廉，使用效果好。
【附圖說明】
[0011] 圖1為FSHR熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖2為GAPDH熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖3為FSHR和GAPDH的溶解曲線，如圖所示兩對(duì)引物特異性較高； 圖4為FSHR和GAPDH的擴(kuò)增曲線； 圖5為發(fā)情期產(chǎn)單羔和雙羔黔北麻羊各組織的相對(duì)表達(dá)譜。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明的實(shí)施例：基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因組織表達(dá)譜的建立 方法， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物合成和質(zhì)粒測(cè)序送英維捷基(上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序；大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a購(gòu)自大連Takara公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、T-載體PCR產(chǎn)物克隆試 劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑 盒、SYBR GreenI熒光定量試劑盒購(gòu)于北京康為試劑生物科技有限公司；采用美國(guó)伯樂公司 CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
[0013] (I)山羊各組織RNA提取 (J)分別提取3頭發(fā)情期產(chǎn)單羔和產(chǎn)雙羔母羊5種組織(下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和 子宮）樣品50-100 mg，迅速置于液氮遇冷的玻璃勻漿器中，迅速研磨成粉末狀。吸取1000 μ I Trizol于勻衆(zhòng)管中，吹打均勻后吸出于離心管中。多個(gè)樣品如此重復(fù)，然后加入200 μ L氯仿。
[0014] (g|震蕩混勻30s，室溫靜置5 min以上；12000 rpm 4°C離心15 min，吸取上清液 轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入500 μ 1異丙醇，震蕩30 S，室溫靜置10 min，12000 rpm 4 °C 離心10 min〇
[0015] (|)棄除上清液，加入1ml預(yù)冷75%乙醇，震蕩混勻沉淀。12000rpm室溫離心2 min 后，再吸棄上清液，加入1ml預(yù)冷75%乙醇；震蕩后12000rpm室溫離心2 min。
[0016] 丨棄除上清液，倒置于濾紙后常溫10 min晾干；用30 μ L DEPC處理水溶解。
[0017] (2) cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成 按照HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA第一鏈，體系為20 yL ：dNTP Mix(2. 5mMEach) 4 μ L, Primer Mix 2 μ L, 5 X RT Buffer 4 yL,DTT(0. 1M) 2 yL,HiFiScript (200U/μ L) I yL,RNA Template 2 μ L, RNase-Free Water 5 yL〇42〇C 孵育45 min后，85孵育5 min，置于冰上冷卻，-20°C長(zhǎng)期保存。
[0018] (3)引物設(shè)計(jì) 參照 GenBank 收錄的 /??? mRNA 基因序列（NM_001009289. 1)，運(yùn)用 Primier 5. 0 和 Oligo軟件設(shè)計(jì)跨外顯子2、3的熒光定量引物和GAPDH。引物由生工生物工程(上海）股份 有限公司合成。
[0019] FSHR:上游引物 5' CGAGTCATCCCAGAAGGAG3' FSHR:下游引物 5' GGCAGGTTGGAGAACACATT 3' GAPDH:上游引物 5' CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA 3' GAPDH:下游引物 5' GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT 3' (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 2:丨以某一頭山羊垂體組織cDNA為模板，分別對(duì)FSHR和GAPDH進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性3 min;95 °C變性30 s，58 °C退火30 s，72 °C延伸30 min，34個(gè) 循環(huán)；最后72 °C延伸5 min，4 °C保存。反應(yīng)體系為