遺傳性視神經(jīng)病變基因檢測(cè)方法、基因芯片和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及遺傳性視神經(jīng)病變基因 SNP檢測(cè) 固相芯片、探針以及相關(guān)的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明主要提供了 ：（1)提供遺傳性視神經(jīng)疾病基 因 SNP檢測(cè)芯片，該芯片包括針對(duì)13個(gè)線粒體基因的46個(gè)SNP位點(diǎn)的的117條探針系列； (2)提供檢測(cè)SNP位點(diǎn)的探針的制備引物；（3)提供一種用于眼科疾病相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的 試劑盒；(4)提供了更全面檢測(cè)遺傳性視神經(jīng)病變基因的SNP位點(diǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Leber 遺傳性視神經(jīng)病變（Leber，s Hereditary Optic Neuropathy，LHON，簡(jiǎn)稱 Leber氏?。┦且环N母系遺傳性視神經(jīng)病變，主要累及視網(wǎng)膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束 纖維，導(dǎo)致視神經(jīng)退行性變的母系遺傳病，嚴(yán)重的影響著人們正常的生產(chǎn)、生活。根據(jù)國(guó)家 衛(wèi)生部（http://www. moh. gov. cn/)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)現(xiàn)有的低視力人口約有710萬(wàn)，盲人 約有500萬(wàn)，占總?cè)藬?shù)的0. 4%，成為世界上視力損傷最嚴(yán)重的國(guó)家之一。其中，由視神經(jīng)病 變引起的約為55萬(wàn)。目前已報(bào)道40多種線粒體DNA突變位點(diǎn)與LHON致病相關(guān)（http:// WWW. mitomap. org/)，其中90%以上的LHON的家系是由氧化磷酸化復(fù)合物I亞基上的ND4 G11778A、ND1 G3460A和ND6 T14484C這3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)所致。除上述3個(gè)原發(fā)性突變 位點(diǎn)外，還有近50個(gè)線粒體DNA突變與LHON相關(guān)，與線粒體相關(guān)的原發(fā)性Leber氏病在早 期臨床癥狀不明顯，早期的檢查常常會(huì)因此被耽誤，尤其在我國(guó)偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)，這種情況普 遍存在。因此，在高危人群和易感人群中開(kāi)展mtDNA突變篩查，對(duì)于預(yù)防和控制與線粒體相 關(guān)的原發(fā)性Leber氏病的發(fā)生有著極其重要的作用。
[0003] 自發(fā)現(xiàn)與mtDNA突變相關(guān)的疾病以來(lái)，檢測(cè)線粒體突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法主要還是 序列測(cè)定。直接測(cè)序法是鑒定突變的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但該操作繁瑣，費(fèi)用昂貴限制了它的廣泛應(yīng) 用。
[0004] 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)相繼報(bào)道了 Leber遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒及其檢測(cè) 方法，以滿足對(duì)線粒體突變突變進(jìn)行廣泛篩查的需要，如福建醫(yī)科大學(xué)于2005年申請(qǐng)了 的基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法專利（專利號(hào)：200510006097. 8)，該發(fā)明是根據(jù)90%以 上的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者的線粒體DNA突變屬于3個(gè)原發(fā)性致病位點(diǎn)突變 (G11778A、G3460A和T14484C)，設(shè)計(jì)和合成位點(diǎn)特異性PCR引物，直接以全血樣作PCR的 DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術(shù)，單管一次性PCR反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)LHON患者的 線粒體DNA的3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)，具有簡(jiǎn)便快速、高效、費(fèi)用低、特異性好、只需微量 血液樣本等優(yōu)點(diǎn)，為L(zhǎng)HON患者的快速臨床基因診斷提供一種簡(jiǎn)易、可靠的方法和試劑盒， 具有巨大的普及推廣應(yīng)用價(jià)值。但是該方法存在血液中直接PCR擴(kuò)增的難度加大，實(shí)驗(yàn)中 采取的多重PCR的條件要求將會(huì)增加，檢測(cè)方法跟普通的方法沒(méi)有本質(zhì)的區(qū)別。2006年 杭州優(yōu)思達(dá)生物科技有限公司建立一種以單核苷酸多態(tài)性核酸試紙快速檢測(cè)LHON線粒體 DNA中G11778A位點(diǎn)突變的新方法（專利號(hào)：200610003429. 1)。在應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性核 酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)，需要設(shè)計(jì)一條特異性延伸引物，這條引 物的3'端堿基緊臨多態(tài)性堿基或突變堿基，其在DNA聚合酶的作用下開(kāi)始延伸，帶有抗 原標(biāo)記與模板對(duì)應(yīng)的雙脫氧單核苷酸（ddNTP)被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠?qū)崿F(xiàn) 短時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)，但PCR擴(kuò)增條件嚴(yán)格，存在假陰性的幾率大大增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前檢測(cè)線粒體DNA突變位點(diǎn)的方法所存在的缺點(diǎn)，提供一 種具有快速、高通量特點(diǎn)的試劑盒，能更好的有利于該疾病的早期診斷與治療的遺傳性視 神經(jīng)病變基因 SNP檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明提供的試劑盒，由視神經(jīng)病變基因 SNP檢測(cè)的固相基因芯片、多重PCR所 需要的探針組分、多重PCR反應(yīng)液、該試劑盒雜交液與洗脫液成分構(gòu)成。其中，視神經(jīng)病變 基因 SNP檢測(cè)的固相基因芯片包括固相載體以及固定于固相載體上的檢測(cè)探針（21個(gè)堿 基，表1)，檢測(cè)探針具有如SEQ ID No :1_117所不的序列，固相載體可以娃片或玻片等材質(zhì) (但不限定于上述材質(zhì)），表面用氨基或者醛基修飾；多重PCR所需要的探針包括多重PCR 引物，具有如SEQ ID No :118-133所示的序列：樣本前向引物I :ACAGGGTTTGTTAAGATGGC AGA(ID:SEQ118),反向引物 1:GACTAGTTCGGACTCCCC TTC G(ID:SEQ119);前向引物 2:CC CCTTCGCCCTATTCTTCAT(ID:SEQ120)，反向引物 2 :GGTGCCTTGGGTAACCTCTG G(ID:SEQ121); 前向引物 3 :CTACTCAACTTAAACTCCAGCACCA(ID:SEQ122)，反向引物 3 :AGGGGAGATAGGTAGGA GTAGCGT (ID: SEQ123);前向引物 4 :ACCTACTCATGCACCTAATTGGA AG (ID: SEQ124)，反向引物 4 :TATTAGTTGGCGGATGAAGCAGA(ID:SEQ125);前向引物 5 :GATACTGGCAITTTGTAGATGTGGT(I D: SEQ126)，反向引物 5 :TTTTTGGAAAGTCATGTCAGTGG (ID: SEQ127);前向引物 6 :TTATCCAGT GAACCACTATCACGAA(ID:SEQ128)，反向引物 6 :ACGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC(ID:SEQ129); 前向引物 7 :CTTACGACCCCTTATTTACCGAGA(ID:SEQ130)，反向引物 7 :GTGAGGCTTGGATTAGCG TTTAGA(ID:SEQ131);前向引物 8 :TCCTAGCAGCAGCAGGCAAAT(ID:SEQ132)，反向引物 8 :CT CGGGGGAATAGGTTATGTGA(ID:SEQ133)。多重 PCR 反應(yīng)液，包括 Phusion 等高保證酶 2U/uL、 Phusion 反應(yīng) buffer、dATP 100mM，dTTP IOOmM, dGTP IOOmM, dCTPlOOmM、Cy3-dCTP 10mM、 Primer Mix、10 μ M、PCR純化磁珠和無(wú)水乙醇；該試劑盒雜交液與洗脫液成分包括雜交液： 6XSSPE，25%甲酰胺，PH6·6to6·8、洗脫液 ：3XSSPE，12·5%甲酰胺，10%SDS，PH6·6to 6. 8、封閉液：6XSSPE，25%甲酰胺，BSA(0. lmg/ml)，PH 6. 6to 6. 8。所采用的該試劑盒的陽(yáng) 性對(duì)照為人的GADPH基因和β-globin基因，其擴(kuò)增引物序列以及對(duì)應(yīng)探針如下所示，其中 此兩對(duì)引物與待檢測(cè)的遺傳性視神經(jīng)病變基因：GADPH前向引物GAAGGTCGGAGTCAACGGATT， GADPH 反向引物 CCTGGAAGATGGTGATGGGAT，GADPH 探針序列 GCCATCAATGACCCCTTCATT、 GCCATCAATCACCCCTTCATT ; β -globin 前向引物 GTGGATGAAGTT GGTGG TGAGG，β -globin 反向引物 CCAGITTAGTAGTTGGACTTAGGGA，β-globin 探針序列 CTGGACAAC CTCAAGGGCACC、 CTGGACAAGCTCAAGGGCACC 〇
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)遺傳性視神經(jīng)病變基因 SNP的固相基因芯 片，該芯片具有針對(duì)13個(gè)線粒體基因46個(gè)SNP位點(diǎn)的如SEQ ID No :1-117所示的序列。該 芯片包括針對(duì)13個(gè)線粒體基因的46個(gè)SNP位點(diǎn)的，可以彌補(bǔ)檢測(cè)位點(diǎn)較少，所帶來(lái)的漏診 現(xiàn)象，更好的有利于視神經(jīng)病變的篩查，具有快速高通量的特點(diǎn)。視神經(jīng)病變基因 SNP檢測(cè) 的固相芯片，所述的遺傳性病變基因具有多個(gè)突變SNP位點(diǎn)，每個(gè)突變SNP位點(diǎn)根據(jù)其SNP 突變位點(diǎn)以及相鄰?fù)蛔兊膲A基位點(diǎn)情況