一種波棱瓜子多糖提取方法,該提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及波棱瓜子多糖提取方法，該提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物，屬 于藥物領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0002] 免疫性肝損傷通常由生物性和化學(xué)性刺激引起肝內(nèi)細(xì)胞的激活，它是通過一系列 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)分泌大量炎癥免疫相關(guān)細(xì)胞因子，經(jīng)過各種不同細(xì)胞與細(xì)胞因子相互之間的 復(fù)雜作用，產(chǎn)生免疫/炎癥應(yīng)答，導(dǎo)致免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的肝損傷。免疫性肝損傷決定了疾病 的轉(zhuǎn)歸或發(fā)生發(fā)展。長期迀延不愈會(huì)導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化乃至肝臟腫瘤等終末病變。免 疫性肝損傷常見的原因?yàn)椴《靖腥?，其模型?dòng)物的肝損傷病理病程類似于病毒性肝炎病理 病程。
[0003] 目前，病毒性肝炎仍然是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題和最常見的肝病病因。 我國亦是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，尤以乙型肝炎病毒（HBV)感染最為常見，嚴(yán)重威脅著人們 的健康。目前，尚無治療乙型肝炎的特效藥物和方法，治療乙型肝炎的藥物主要為西醫(yī)常用 的干擾素、胸腺素、核苷類、疫苗等以及中醫(yī)常用的黃芪粗制劑和以黃芪為主的復(fù)方、肝康 沖劑及苦參等藥物，但療效欠佳。因此，開發(fā)能有效治療乙型病毒性肝炎的新藥在臨床上變 得尤為迫切。
[0004] 據(jù)報(bào)道，藏醫(yī)藥在防治病毒性肝炎的過程中取得了良好的成果，其對(duì)肝病的治療 得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。
[0005] 波棱瓜子是藏藥中治療肝病的首選藥物之一，在治療肝病的過程中得到了廣泛的 應(yīng)用?，F(xiàn)代藥理研宄亦表明波棱瓜子總木脂素及脂肪油具有抗肝炎、抗乙肝病毒、抗肝損 傷、調(diào)節(jié)免疫等作用。據(jù)報(bào)道，植物多糖亦具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等多種生理功能， 但目前尚未見波棱瓜子多糖護(hù)肝作用的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種波棱瓜子多糖提取方法，該提取方法得到的波棱 瓜子多糖提取物。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了該提取物的用途。
[0008] 本發(fā)明一種波棱瓜子多糖提取方法，它包括如下步驟：
[0009] a、脫脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入石油醚，在60 - 90°C下水浴回流4 一 6h，冷 卻，離心；
[0010] b、水浴加熱回流提?。荷鲜鰵?jiān)鼡]干后，加入蒸餾水，KKTC水浴加熱回流，冷卻， 收集提取液，離心，取上層清液，再次抽濾后將濾液減壓濃縮；
[0011] c、Sevag法除蛋白：上述濃縮液中加入Sevag試劑（三氯甲燒：正丁醇=5:1)，樣 液比1:4 一 4 :1，劇烈震蕩，離心，收集上清液；
[0012] d、沉淀：上述上清液中加入無水乙醇，靜置過夜，抽濾，沉淀真空干燥得到波棱瓜 子多糖。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選地，它包括如下步驟：
[0014] a、脫脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80°C下水浴回流2h，冷卻， 離心，重復(fù)兩次；
[0015] b、水浴加熱回流提?。荷鲜鰵?jiān)鼡]干后，依次加入10、8、6倍量蒸餾水，KKTC水浴 加熱回流各提取2h、I. 5h、I. 5h，冷卻，收集合并3次提取液，4000r/min離心5min，取上層清 液，再次抽濾后將濾液減壓濃縮至每1ml藥液相當(dāng)于Ig原料藥；
[0016] c、Sevag法除蛋白：上述濃縮液中加入Sevag試劑（三氯甲燒：正丁醇=5:1)，樣 液比3 :1，劇烈震蕩25min，4000r/min離心5min，收集上清液，重復(fù)操作6次，最后所得上清 液；
[0017] d、沉淀：上述液體中加入6倍體積的無水乙醇，靜置過夜，抽濾，沉淀真空干燥得 到波棱瓜子多糖提取物。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述的提取方法制備得到的波棱瓜子多糖提取物。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述的波棱瓜子多糖提取物在制備保肝護(hù)肝的藥物中的用途。
[0020] 其中，所述的藥物是治療免疫性肝損傷的藥物。
[0021] 其中，所述的藥物是保肝降酶的藥物。
[0022] 其中，所述的藥物是具有清除自由基、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫的藥物。
[0023] 文獻(xiàn)報(bào)道，波棱瓜子中具有保肝作用的大類成分為木脂素以及脂肪油，脂肪油在 提取的第一步（石油醚脫脂）中已幾乎除盡，且脂肪油不溶于水；木脂素在植物中多以游離 狀態(tài)存在，為脂溶性物質(zhì)，難溶于水，且制備的最后一步即多糖沉淀乙醇體積分?jǐn)?shù)已達(dá)80% 以上，進(jìn)一步使殘余的木脂素溶于上層清液乙醇中。因此，本發(fā)明波棱瓜子多糖提取物中不 含有木脂素類成分。
[0024] 本發(fā)明波棱瓜子多糖提取物遵循中醫(yī)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，符合臨床用藥特點(diǎn)，提取方 法為水浴加熱回流提取，工藝和提取設(shè)備簡單，成本低廉，且相對(duì)安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0025] 圖1各組小鼠肝組織HE染色病理切片（A :空白組B :模型組C :陽性對(duì)照組D :多 糖低劑量組E :多糖中劑量組F :多糖高劑量組）
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1本發(fā)明波棱瓜子多糖提取物制備方法
[0027] 1)脫脂：波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80°C下水浴回流2h，冷卻， 離心，重復(fù)兩次。
[0028] 2)水浴加熱回流提?。荷鲜鰵?jiān)鼡]干后，依次加入10、8、6倍量蒸餾水，100°C水浴 加熱回流各提取2h、I. 5h、I. 5h，冷卻，收集合并3次提取液，4000r/min離心5min，取上層清 液，再次抽濾后將濾液減壓濃縮至每1ml藥液相當(dāng)于Ig原料藥。
[0029] 3) Sevag法除蛋白：上述濃縮液中加入Sevag試劑（三氯甲燒：正丁醇=5:1)，樣 液比3 :1，劇烈震蕩25min，4000r/min離心5min，收集上清液，重復(fù)操作6次，最后所得上清 液。
[0030] 4)沉淀：上述液體中加入6倍體積的無水乙醇，靜置過夜，抽濾，沉淀真空干燥得 到波棱瓜子多糖。計(jì)算得提取率為3. 54%。
[0031] 以下通過具體藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。
[0032] 試驗(yàn)例1本發(fā)明波棱瓜子多糖對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用的藥 效學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0033] 1.實(shí)驗(yàn)藥品及試劑
[0034] 波棱瓜子多糖：由實(shí)施例1制備，多糖給藥組劑量（按小鼠體重給藥）分別為 0· 71g/kg、0. 99g/kg、l. 44g/kg，相當(dāng)于生藥量的 20g/kg、28g/kg、40. 8g/kg ;
[0035] 上述劑量多糖用蒸餾水溶解配制備用；
[0036] 聯(lián)苯雙酯滴丸，由浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠提供；
[0037] 刀豆球蛋白A(ConA)，購自美國Sigma公司；
[0038] 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST)、乳酸脫氫酶（LDH，批 號(hào)）、超氧化物歧化酶（T-SOD)、丙二醛（MDA)、總蛋白（TP)、一氧化氮（NO)試劑盒，均購自 南京建成生物工程研宄所提供；
[0039] 白細(xì)胞介素6 (IL-6) ELASA試劑盒，由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供；
[0040] 無菌磷酸緩沖液（PBS)，由Bioroc公司提供。
[0041] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0042] 60只健康雄性昆明種小鼠，18_22g，隨機(jī)分為空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯（陽性對(duì) 照）組及波棱瓜子多糖低、中、高劑量組，每組10只。
[0043] 波棱瓜子多糖低、中、高劑量給藥組小鼠每天分別按體重igO. 71、0. 99、1. 44g/kg 多糖；
[0044] 陽性對(duì)照組小鼠 igO. 2g/kg聯(lián)苯雙酯；
[0045] 聯(lián)苯雙酯及多糖均用蒸餾水混懸和溶解；
[0046] 正常組與模型組小鼠 ig20mL/kg的蒸餾水；
[0047] 連續(xù) ig8d ;
[0048] 采用一次性尾靜脈注射ConA建立免疫性肝損傷小鼠模型：末次給藥（已禁食 9h) Ih后，除正常組外，其余小鼠尾靜脈注射30mg/kg ConA。
[0049] 8h后，稱量小鼠體重，摘眼球取血，分離血清，檢測ALT、AST、NO、LDH、IL-6各項(xiàng)指 標(biāo)；
[0050] 眼球取血后立即處死小鼠并剖取肝臟、脾臟，濾紙擦試，稱重，計(jì)算肝臟、脾臟臟器 指數(shù)（臟器重量/體重X 100%);
[0051] 剪取部分肝臟組織，冰浴中用冷生理鹽水制成10%的肝勻漿，離心，取上清液，檢 測TP、SOD、MDA各項(xiàng)指標(biāo)；
[0052] 剪取各組小鼠的肝臟相同部位肝組織（肝左葉），10%甲醛（PBS配制）固定，HE 染色，光鏡下觀察肝組織損傷程度。
[0053] 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所得數(shù)據(jù)均采用I ± s表示，用SPSS17. 0軟件進(jìn)行方差分析及獨(dú)立 樣本T檢驗(yàn)，肝臟組織的炎性壞死程度根據(jù)等級(jí)分組評(píng)分后，采用Riditu檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué) 處理。P < 0. 05或P〈0. 01認(rèn)為有顯著性差異。
[0054] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055] 1)波棱瓜子多糖對(duì)臟器指數(shù)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0050] 表1波棱瓜子多糖對(duì)免疫性肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響? ±s，η = 10)
[0057]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于：它包括如下步驟： a、 脫脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入石油醚，在60-90°C下水浴回流4-6h，離心； b、 水浴加熱回流提?。荷鲜鰵?jiān)鼡]干后，加入蒸餾水，KKTC水浴加熱回流，冷卻，收集 提取液，離心，取上層清液，再次抽濾后將濾液減壓濃縮； c、 Sevag法除蛋白：上述濃縮液中加入Sevag試劑（三氯甲燒：正丁醇=5:1)，樣液比 I :4_4 :1，劇烈震蕩，離心，收集上清液； d、 沉淀：上述上清液中加入無水乙醇，靜置過夜，抽濾，沉淀真空干燥得到波棱瓜子多 糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于：它包括如下步驟： a、 脫脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80°C下水浴回流2h，冷卻，離 心，重復(fù)兩次； b、 水浴加熱回流提?。荷鲜鰵?jiān)鼡]干后，依次加入10、8、6倍量蒸餾水，KKTC水浴加熱 回流各提取2h、l. 5h、l. 5h，冷卻，收集合并3次提取液，4000r/min離心5min，取上層清液， 再次抽濾后將濾液減壓濃縮至每1ml藥液相當(dāng)于Ig原料藥； c、 Sevag法除蛋白：上述濃縮液中加入Sevag試劑（三氯甲燒：正丁醇=5:1)，樣液比 3 :1，劇烈震蕩25min，4000r/min離心5min，收集上清液，重復(fù)操作6次，最后所得上清液； d、 沉淀：上述液體中加入6倍體積的無水乙醇，靜置過夜，抽濾，沉淀真空干燥得到波 棱瓜子多糖提取物。
3. 權(quán)利要求1或2所述的提取方法制備得到的波棱瓜子多糖提取物。
4. 權(quán)利要求3所述的波棱瓜子多糖提取物在制備保肝護(hù)肝的藥物中的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于：所述的藥物是治療免疫性肝損傷的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于：所述的藥物是保肝降酶的藥物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于：所述的藥物是具有清除自由基、抗氧化、 抗炎、調(diào)節(jié)免疫的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種波棱瓜子多糖提取方法，它包括如下步驟：a、脫脂；b、水浴加熱回流提??；c、Sevag法除蛋白；d、沉淀。本發(fā)明還提供了提取方法制備得到的波棱瓜子多糖提取物及其用途。本發(fā)明波棱瓜子多糖提取物遵循中醫(yī)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，符合臨床用藥特點(diǎn)，提取方法為水浴加熱回流提取，工藝和提取設(shè)備簡單，成本低廉，且相對(duì)安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
【IPC分類】A61P29-00, A61P37-02, A61K31-715, A61P1-16, A61P39-06, C08B37-00
【公開號(hào)】CN104804107
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510201883
【發(fā)明人】張梅, 李春沁, 劉美琳, 雷有成, 王紫燕
【申請(qǐng)人】成都中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年4月24日