一種蛋白肽的制備方法、蛋白肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種蛋白肽的制備方法、蛋白肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)發(fā)病率逐年上升，社會關(guān)注度 明顯提高。無論是發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，近年來都呈現(xiàn)發(fā)病率顯著增高的趨勢，嚴(yán)重地 區(qū)患病率甚至達(dá)到20%。治療痛風(fēng)的藥物普遍存在較嚴(yán)重的不適應(yīng)癥及副作用，故2009 年，部分內(nèi)分泌、代謝、心腦血管專家及腎臟病的學(xué)者形成共識，認(rèn)為通過保健食品調(diào)理，將 是比較合理的方法。目前，全世界健康食品產(chǎn)業(yè)進(jìn)入一個迅速擴(kuò)張期。近二十年來，由于國 人膳食結(jié)構(gòu)不盡合理，致使我國亞健康人群擴(kuò)大，也導(dǎo)致近年來我國醫(yī)療費(fèi)用呈節(jié)節(jié)上升 趨勢。
[0003] 黃嘌呤氧化酶是參與痛風(fēng)發(fā)生與發(fā)展過程中的關(guān)鍵酶，，也是開發(fā)抗痛風(fēng)藥物 的重要靶標(biāo)。研宄表明，通過抑制黃嘌呤氧化酶，能夠有效降低血漿尿酸水平，可用于 預(yù)防和治療痛風(fēng)及高尿酸血癥。肽是來源于蛋白質(zhì)分子的功能性片段，其輔助治療痛 風(fēng)的功效已于近年有少量報道，如膠原及其酶解物對于控制尿酸有顯著療效（專利號 W02008066070-A1、JP2008547008-X)。從理論上，生物活性肽潛在具有改善高尿酸血癥的重 要作用機(jī)制一一調(diào)控嘌呤代謝關(guān)鍵酶系。生物活性肽對嘌呤代謝酶的調(diào)控作用可通過以下 途徑實現(xiàn)：蛋白活性肽具有螯合金屬離子的能力，而金屬離子是嘌呤代謝關(guān)鍵酶催化反應(yīng) 的激活劑，肽螯合相關(guān)金屬離子可抑制某些嘌呤代謝酶活性，減少尿酸生成。
[0004] 目前市售降尿酸食品和保健品，大多為植物提取物，且降尿酸成分不明確，降低尿 酸功效不顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種蛋白肽的制備方法及使用該制備方法制備出的肽粉，以及所述肽 粉在降低尿酸的食品或保健品中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明原料來自金槍魚，原料更易得，所制備出的肽粉經(jīng)動物實驗，降低尿酸的功 效明顯，黃嘌呤氧化酶抑制率高，能有效改善痛風(fēng)綜合癥。
[0007] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種蛋白肽的制備方法，可包括：
[0008] (1)將金槍魚絞碎，水蒸汽或水加熱至熟，得到預(yù)處理后的金槍魚；
[0009] (2)將所述預(yù)處理后的金槍魚酶解，滅酶，離心分離得到上清液；
[0010] (3)將所述上清液濃縮、干燥得到目標(biāo)肽粉。
[0011] 優(yōu)選地，所述水蒸汽或水加熱的過程包括：使用水蒸汽或水在80-100°C下加熱 5_30min〇
[0012] 優(yōu)選地，所述酶解和所述滅酶包括：將所述預(yù)處理后的金槍魚與蛋白酶混合，反 應(yīng)溫度50-60 °C，反應(yīng)時間3. 0-9. Oh ;反應(yīng)結(jié)束后滅酶，滅酶溫度90°C -100 °C，滅酶時間 10-20min〇
[0013] 優(yōu)選地，所述酶解所用蛋白酶為酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋 白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和Alcalase蛋白酶中的一種或多種，所述蛋白酶的使用量 為所述預(yù)處理后的金槍魚重量的〇. 5% -3. 0%。
[0014] 優(yōu)選地，所述上清液濃縮之前還包括除去所述上清液中的雜質(zhì)，得到處理后的上 清液。
[0015] 優(yōu)選地，除去所述上清液中的雜質(zhì)包括：
[0016] (1)向所述上清液中加入活性炭，加入量為所述上清液重量的1. 0-2. 5% ;
[0017] (2)在 70-90 °C 溫度下攪拌 0? 5-2. Oh ;
[0018] (3)過濾，除去活性炭；
[0019] 優(yōu)選地，所述濃縮過程采用三效濃縮機(jī)，操作條件為0. 03-0. 08MPa，60-80°C的真 空條件下濃縮至固形物含量30-45%。
[0020] 本發(fā)明所述金槍魚為鰹魚、藍(lán)鰭金槍魚、長鰭金槍魚和黃鰭金槍魚中的一種或多 種。
[0021] 本發(fā)明還提供一種蛋白肽，所述蛋白肽使用前述制備方法制備，所述蛋白肽的特 征為重量比不小于70%的蛋白肽的分子量小于5000Da。
[0022] 本發(fā)明還提供一種蛋白肽的應(yīng)用，所述蛋白肽使用前述制備方法制備，應(yīng)用于降 尿酸的食品或保健品中。
[0023] 本發(fā)明實施例中，金槍魚經(jīng)粉碎處理后，加入脫腥劑處理后，加入金槍魚rio倍 重量的食用級水或者使用水蒸氣，于8(T100°C下加熱flOmin，冷卻；按照金槍魚的重量 加入酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和 Alcalase蛋白酶（加酶量0. 5% -3. 0% )，于55°C水浴振蕩反應(yīng)3. 0-8. Oh ;反應(yīng)結(jié)束后將 水解液置于沸水中保溫10_20min滅酶，離心分離，取上清液；用活性炭除雜及離子交換樹 脂分離蛋白肽：向所述上清液中按1. 0-2. 5%重量比加入活性炭進(jìn)行粗濾，在70-90°C溫度 下攪拌0. 5-2. Oh。用微濾裝置過濾料液，除去活性炭；利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱層 析進(jìn)行分離，以〇. lmol/L的氯化鈉溶液為洗脫劑，收集洗脫液；用三效濃縮機(jī)濃縮所述洗 脫液，在0. 03-0. 08MPa，60-80°C的真空條件下，將所述洗脫液濃縮至固含量30-45%，噴霧 干燥，得到目標(biāo)肽粉；經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜監(jiān)測主要肽功效組分的分子量均小于5000Da。
[0024] 將金槍魚預(yù)處理后，使用蛋白酶降解為蛋白肽，得到的活性蛋白肽具有螯合金屬 離子的能力，而金屬離子是嘌呤代謝關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶催化反應(yīng)的激活劑，肽螯合金屬 離子可抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少尿酸生成，降低血漿尿酸水平，從而有效預(yù)防和治療 痛風(fēng)及高尿酸血癥。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明實施例提供了一種蛋白肽的制備方法及使用該制備方法制備出的肽粉，用 于改善痛風(fēng)綜合癥。
[0026] 本發(fā)明一種蛋白肽的制備方法，將金槍魚絞碎，水蒸汽或水在8(T100°C下加熱 5-30min，得到預(yù)處理后的金槍魚；將所述預(yù)處理后的金槍魚將所述預(yù)處理后的金槍魚與蛋 白酶混合，反應(yīng)溫度50-60°C，反應(yīng)時間3. 0-9. Oh ;反應(yīng)結(jié)束后滅酶，滅酶溫度9(T100°C，滅 酶時間10-20min，酶解所用蛋白酶為酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、水解蛋白 酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和Alcalase蛋白酶中的一種或多種，所述蛋白酶的使用量為 所述預(yù)處理后的金槍魚重量的〇. 5% -3. 0%。
[0027] 滅酶后離心，得到上清液，向上清液中加入活性炭，加入量為所述上清液重量的 1. 0-2. 5% ;在70-90°C溫度下攪拌0. 5-2. Oh ;過濾，，除去活性炭；采用三效濃縮機(jī)濃縮，操 作條件為〇. 03-0. 08MPa，60-80°C的真空條件下濃縮至固形物含量為30-45% ;干燥得到目 標(biāo)肽粉。
[0028] 實際應(yīng)用中，可以將目標(biāo)肽粉與土茯苓、菊苣、車前、薏苡仁等中草藥配伍，制備出 具有降尿酸功能的保健食品或保健品。
[0029] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過具體實施例對 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0030] 實施例1
[0031] 將藍(lán)鰭金槍魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機(jī)絞碎，得到500kg藍(lán)鰭金槍魚碎 肉，加入1000kg水，在90°C下攪拌加熱25min，，得到藍(lán)鰭金槍魚肉漿，然后溫度降至55°C ; 向藍(lán)鰭金槍魚肉漿內(nèi)加入其量13kg中性蛋白酶，在55°C下保溫水解6小時，然后在90°C下 加熱20min進(jìn)行滅酶，最后使用離心機(jī)離心，取上清液，得到金槍魚酶解粗液；向金槍魚酶 解粗液加入5kg活性炭，在50°C下保溫攪拌0. 8小時，然后通過0. 5 y m濾紙過濾，所得濾液 為金槍魚酶解精制液，采用真空濃縮法將金槍魚酶解精制液濃縮至固形物30%，進(jìn)行噴霧 干燥，得金槍魚提取物1。
[0032] 金槍魚提取物1對氧嗪酸鉀誘致大鼠高尿酸血癥的治療作用如表1、表2和表3。
[0033] 本發(fā)明實施例制備的活性蛋白肽具有螯合金屬離子的能力，而金屬離子是嘌呤代 謝關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶催化反應(yīng)的激活劑，肽螯合金屬離子可抑制黃嘌呤氧化酶的活性， 減少尿酸生成，降低血漿尿酸水平，，從而有效預(yù)防和治療痛風(fēng)及高尿酸血癥。
[0034] 實施例2
[0035] (1)將黃鰭金槍魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機(jī)絞碎，得到500kg黃鰭金槍魚 碎肉，加入500kg水，在80°C下攪拌加熱30min，得到黃鰭金槍魚肉漿，然后溫度降至50°C。
[0036] (2)往黃鰭金槍魚肉漿內(nèi)加入3kg的中性蛋白酶、5kg的風(fēng)味蛋白酶和3kg的水解 蛋白酶，在50°C下保溫水解8小時，然后在90°C下加熱30min進(jìn)行滅酶，最后離心，取上清 液，得到金槍魚酶解粗液。
[0037] (3)往金槍魚酶解粗液中加入5kg的活性炭，在50°C下保溫攪拌0. 5小時，然后通 過0. 5 y m濾紙過濾，所得濾液為金槍魚酶解精制液。
[0038] (4)將金槍魚酶解精制液真空濃縮至固形物30%以上，，進(jìn)行噴霧干燥，得金槍魚 提取物2。
[0039] 金槍魚提取物2對氧嗪酸鉀誘致大鼠高尿酸血癥的治療作用如表1、表2和表3。
[0040] 本發(fā)明實施例制備的活性蛋白肽具有螯合金屬離子的能力，而金屬離子是嘌呤代 謝關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶催化反應(yīng)的激活劑，肽螯合金屬離子可抑制黃嘌呤氧化酶的活性， 減少尿酸生成，降低血漿尿酸水平，，從而有效預(yù)防和治療痛風(fēng)及高尿酸血癥。
[0041] 實施例3
[0042] (1)將鰹魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機(jī)絞碎，，得到250kg鰹魚碎肉，將長鰭 金槍魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機(jī)