多重y-str分析的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)根據(jù)35 U. S. C. § 119(e)要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)：2012年9月6日提交的 名稱為"多重Y-STR分析（Multiplex Y-STR Analysis)"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/697, 742 號(hào)、2012年10月31日提交的名稱為"多重Y-STR分析"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/720, 949號(hào)、 2013年2月5日提交的名稱為"多重Y-STR分析"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/761，152號(hào)、以及 2013年2月15日提交的名稱為"多重Y-STR分析"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/765, 323號(hào)，所述 公開(kāi)內(nèi)容中的每一個(gè)以全文引用的方式并入本文中。
[0002] 本文中所用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的并且不應(yīng)理解為以任何方式限制本文中 所述的主題。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] -般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及使用多重分析方法測(cè)定人類Y染色體上的短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)等位基因的身份。包括數(shù)量增加的可以提供增加的辨別和靈敏度的基因座的多重分 析可以對(duì)更寬范圍的個(gè)體準(zhǔn)確地進(jìn)行基因分型。
【背景技術(shù)】
[0004] 法醫(yī)學(xué)、親子鑒定、細(xì)胞系ID以及個(gè)體化用藥領(lǐng)域常規(guī)地使用基于DNA的技術(shù)進(jìn) 行身份測(cè)定、基因分型、表現(xiàn)型預(yù)測(cè)以及預(yù)測(cè)和/或預(yù)防疾病。DNA分型涉及分析基因組DNA 的選擇區(qū)域，通常被稱為"標(biāo)志物"。現(xiàn)今所使用的大多數(shù)分型方法專門被設(shè)計(jì)成用于檢測(cè) 并分析已知在人群中以至少兩種不同形式出現(xiàn)的DNA標(biāo)志物的一或多個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度和/或 序列方面的差異。所述長(zhǎng)度和/或序列變異被稱為"多態(tài)性"。DNA中存在這種變異的任何 區(qū)域（即，"基因座"）都被稱作"多態(tài)基因座"。
[0005] 近年來(lái)，多態(tài)短串聯(lián)重復(fù)序列（STR)作為遺傳標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展在DNA分型中 起到了重要作用。STR已經(jīng)變成了人類身份和法醫(yī)DNA測(cè)試的主要手段。
[0006] 具體來(lái)說(shuō)，Y-STR分析在許多應(yīng)用中是一種有價(jià)值的工具。法醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括在性 侵案的調(diào)查中的用途，其中男性DNA可以存在于還含有過(guò)量女性DNA的樣品中。Y-STR分析 在把個(gè)體排除在進(jìn)一步調(diào)查之外的過(guò)程中可能是至關(guān)重要的。在另一種法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，樣 品可以包括來(lái)自多個(gè)男性貢獻(xiàn)者的DNA。Y-STR分析可以用于在法醫(yī)學(xué)分析或其它遺傳分 析中跟蹤男性之間的家庭關(guān)系，并且可以用于失蹤人員調(diào)查中。另外，Y-STR分析可以用于 親子鑒定中，包括假設(shè)父親不可用于直接比較的情況。
[0007] 用于幫助研宄者的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)是美國(guó)Y-STR數(shù)據(jù)庫(kù)，這是11到23個(gè)基因座Y-STR 單體型的可搜索清單，并且可見(jiàn)于：（http://www. usystrdatabase. org/newdefault. aspx)。所述數(shù)據(jù)庫(kù)由國(guó)家司法研宄所（National Institute of Justice)資助并且由國(guó) 家法醫(yī)科學(xué)中心（National Center for Forensic Science ;NCFS)以及中佛羅里達(dá)大學(xué) (University of Central Florida)管理。美國(guó)Y-STR數(shù)據(jù)庫(kù)只是人口數(shù)據(jù)庫(kù)并且出于法 醫(yī)案件工作的目的，打算用于評(píng)估Y-STR單體型人口頻率。
[0008]當(dāng)前可獲得的Y-STR分析試劑盒存在若干局限性。雖然使用單體型數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定 特定群體中的單體型頻率，但是試劑盒的單體型分辨率（HR)可以在群體中變化（韋爾默朗 (Vermeulen)等人，（2009) FSIG 3:205-213)。其次，使用當(dāng)前試劑盒，不可以排除懷疑個(gè)體 的男性親屬。根據(jù)當(dāng)前分析，相隔多達(dá)20代的親屬的Y-STR概況可能彼此不可區(qū)別（巴蘭 坦（Ballantyne)等人（2010):美國(guó)人類遺傳學(xué)雜志（Am J Hum Genet)87:341_353)。第 三，隨著更多男性概況添加到Y(jié)-STR頻率數(shù)據(jù)庫(kù)，偶然匹配增加。因此，在本領(lǐng)域中存在改 善Y-STR多重分析系統(tǒng)、分析、試劑盒以及方法的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] -方面，本發(fā)明提供一種擴(kuò)增引物集，包括用于擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的引 物，其中所述引物被配置成用于提供至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的具有小于約220個(gè)堿基對(duì)的 堿基對(duì)大小的每個(gè)擴(kuò)增子集。在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增子堿基對(duì)大小的檢測(cè)可以通過(guò)熒光檢 測(cè)技術(shù)執(zhí)行。在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增子堿基對(duì)大小的檢測(cè)可以通過(guò)依賴于迀移率的分析技 術(shù)執(zhí)行。依賴于迀移率的分析技術(shù)可以是毛細(xì)管電泳。在一些其它實(shí)施例中，擴(kuò)增子堿基對(duì) 大小的檢測(cè)可以通過(guò)測(cè)序技術(shù)執(zhí)行，不使用熒光染料標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增引物集可 以進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增至少5個(gè)附加Y-STR標(biāo)志物的引物，其中所述引物被配置成用于提 供至少5個(gè)附加Y-STR標(biāo)志物的具有大于約220個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大小的每個(gè)擴(kuò)增子集。 在不同實(shí)施例中，當(dāng)擴(kuò)增引物集擴(kuò)增超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物時(shí)，那么擴(kuò)增引物集可以被配 置成用于提供超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的具有小于約410個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大小的所有擴(kuò) 增子集。在不同實(shí)施例中，當(dāng)擴(kuò)增引物集擴(kuò)增超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物時(shí)，那么擴(kuò)增引物集 可以被配置成用于提供超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的具有小于約420個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大小 的所有擴(kuò)增子集。在一些實(shí)施例中，當(dāng)擴(kuò)增引物集擴(kuò)增超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物時(shí)，那么擴(kuò) 增引物集可以包括25個(gè)Y-STR標(biāo)志物的引物。在一些實(shí)施例中，當(dāng)擴(kuò)增引物集包括25個(gè) Y-STR標(biāo)志物的引物時(shí)，擴(kuò)增引物集可以包括至少兩個(gè)雙重拷貝標(biāo)志物的引物。在一些實(shí) 施例中，擴(kuò)增引物集可以用至少5種熒光染料中的一種標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增引物集 可以被配置成用于提供至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的用至少5種熒光染料中的一種標(biāo)記的每 個(gè)擴(kuò)增子集。用于標(biāo)記引物和/或擴(kuò)增子的至少5種熒光染料可以被配置成在光譜上截然 不同的。擴(kuò)增引物集可以進(jìn)一步包括至少一個(gè)包括迀移率調(diào)節(jié)劑的擴(kuò)增引物。用于擴(kuò)增至 少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的擴(kuò)增引物集可以被配置成用于提供至少一個(gè)包括迀移率調(diào)節(jié)劑的 Y-STR標(biāo)志物的擴(kuò)增子集。在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的擴(kuò)增引物集可 以擴(kuò)增 DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393 和DYS439。在其它實(shí)施例中，擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的被配置成用于提供至少11個(gè) Y-STR標(biāo)志物的具有小于約220個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大小的每個(gè)擴(kuò)增子集的擴(kuò)增引物集可 以擴(kuò)增至少5個(gè)作為快速突變基因座的Y-STR標(biāo)志物。在一些實(shí)施例中，至少5個(gè)快速突 變Y-STR標(biāo)志物可以包括DYF387Slab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它實(shí)施例 中，至少5個(gè)快速突變Y-STR標(biāo)志物可以進(jìn)一步包括DYS518。在一些實(shí)施例中，用于擴(kuò)增 至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的引物集可以是用于擴(kuò)增以下各者的引物集：DYF387Slab、DYS19、 DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、 DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、 DYS635和Y-GATA-H4。在其它實(shí)施例中，用于擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的引物集可以是 用于擴(kuò)增以下各者的引物集：DYF387Slab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、 DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、 DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643 和 Y-GATA-H4。
[0010] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種用于共擴(kuò)增至少一個(gè)DNA樣品的基因座集的試 劑盒，包括用于擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少 11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的具有小于約220個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大小的每個(gè)擴(kuò)增子集；以及任選 地，大小標(biāo)準(zhǔn)。在一些實(shí)施例中，所述試劑盒可以進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增至少5個(gè)Y-STR標(biāo)志 物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少5個(gè)Y-STR標(biāo)志物的具有大于約220個(gè)堿 基對(duì)的堿基對(duì)大小的每個(gè)擴(kuò)增子集。所述試劑盒可以包括25個(gè)Y-STR標(biāo)志物的擴(kuò)增引物 集。在不同實(shí)施例中，當(dāng)擴(kuò)增引物集擴(kuò)增超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物時(shí)，那么擴(kuò)增引物集可以 被配置成用于提供超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的具有小于約410個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大小的所 有擴(kuò)增子集。在不同實(shí)施例中，當(dāng)擴(kuò)增引物集擴(kuò)增超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物時(shí)，那么擴(kuò)增引 物集可以被配置成用于提供超過(guò)11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的具有小于約420個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì) 大小的所有擴(kuò)增子集。在一些實(shí)施例中，所述試劑盒可以包括用至少5種熒光染料中的一 種標(biāo)記的擴(kuò)增引物集。用于標(biāo)記所述試劑盒的引物的至少5種熒光染料可以被配置成在光 譜上截然不同的。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括至少一個(gè)包括迀移率調(diào)節(jié)劑的擴(kuò)增引物。在 一些實(shí)施例中，包括擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的擴(kuò)增引物集的試劑盒可以擴(kuò)增DYS576、 DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393 和 DYS439。在 其它實(shí)施例中，包括擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的擴(kuò)增引物集的試劑盒可以擴(kuò)增至少5個(gè) 作為快速突變基因座的Y-STR標(biāo)志物，其中所述引物被配置成用于提供至少11個(gè)Y-STR標(biāo) 志物的具有小于約220個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大小的每個(gè)擴(kuò)增子集。在一些實(shí)施例中，至少5 個(gè)快速突變Y-STR標(biāo)志物可以包括DYF387Slab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其 它實(shí)施例中，至少5個(gè)快速突變Y-STR標(biāo)志物可以進(jìn)一步包括DYS518。在一些實(shí)施例中， 包括用于擴(kuò)增至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志物的引物集的試劑盒可以是用于擴(kuò)增以下各者的引物 集：DYF387Slab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、 DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、 DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它實(shí)施例中，包括用于擴(kuò)增至少11個(gè) Y-STR標(biāo)志物的引物集的試劑盒可以是用于擴(kuò)增以下各者的引物集：DYF387Slab、DYS19、 DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、 DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、 DYS643和Y-GATA-H4。在一些實(shí)施例中，當(dāng)所述試劑盒包括大小標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，所述試劑盒進(jìn)一步 包括等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
[0011] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種用于擴(kuò)增人類男性的Y-STR標(biāo)志物的等位基因 的方法，包括以下步驟：使疑似含有人類男性的DNA樣品的樣品與包括用于擴(kuò)增至少11個(gè) Y-STR標(biāo)志物的等位基因的引物的擴(kuò)增引物集接觸；并且擴(kuò)增所述樣品，由此形成至少11 個(gè)Y-STR標(biāo)志物的多個(gè)擴(kuò)增子集，其中每個(gè)擴(kuò)增子集具有小于約220個(gè)堿基對(duì)的堿基對(duì)大 小。所述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：檢測(cè)每個(gè)擴(kuò)增子集，借此鑒別至少11個(gè)Y-STR標(biāo)志 物的等位基因。在一些實(shí)施例中，檢測(cè)步驟通過(guò)使用依賴于迀移率的分析分離多個(gè)擴(kuò)增子 集來(lái)執(zhí)行，其中多個(gè)擴(kuò)增子集經(jīng)熒光標(biāo)記。在其它實(shí)