用于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的酶的生產(chǎn)的制作方法
【專利說明】用于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的酶的生產(chǎn) 技術(shù)背景
[0001] 酶是催化生化反應(yīng)的蛋白質(zhì)。酶由幾乎所有的活的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。由真菌類微生 物產(chǎn)生的一些酶在木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為化學(xué)品的過程中是有用的。在這些轉(zhuǎn)化過程中， 酶用作復(fù)合糖，如纖維素或半纖維素，水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為低分子量糖類的催化劑。
[0002] 已知來自木質(zhì)纖維素原料的纖維素和半纖維素的水解要求均衡的酶的混合物，所 述酶的混合物由內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、3 -葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和作 用于木聚糖和甘露聚糖的側(cè)鏈的各種酶組成。酶的生產(chǎn)是在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇過程中的一 個(gè)重要步驟，因?yàn)槊负兔傅幕旌衔锏纳a(chǎn)和應(yīng)用是目前用于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)利用的生 物基礎(chǔ)的路線中較昂貴的工藝步驟之一。
[0003] 植物降解真菌里氏木霉的酶系統(tǒng)是最廣泛研究的并被認(rèn)為是最廣泛的用于獲得 商業(yè)酶混合物的有機(jī)體。里氏木霉產(chǎn)生大量的纖維素和半纖維素降解酶，即使細(xì)胞外的 葡糖苷酶分泌物較低。眾所周知，為得到高的纖維素轉(zhuǎn)化，葡糖苷酶的活性含量是 關(guān)鍵的，里氏木霉酶溶液通常用葡糖苷酶增補(bǔ)以得到均衡的酶溶液并進(jìn)一步推進(jìn)纖維 素的水解。在其它情況下，使用由其它良好的產(chǎn)生葡糖苷酶的真菌產(chǎn)生的酶也可得到 商業(yè)的酶或酶混合物溶液。
[0004] 通過在含純纖維素和/或甚至更昂貴的碳源的復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)宿主細(xì)胞產(chǎn)生 用于木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化過程的酶。
[0005] 為減少酶產(chǎn)生的最終成本，已進(jìn)行多種嘗試使用比純纖維素便宜的基質(zhì)。經(jīng)預(yù)處 理的木質(zhì)纖維素原料已被用于基質(zhì)。許多研究組曾嘗試使用在某些方式中用于生物乙醇生 產(chǎn)的相同的原料產(chǎn)生酶或酶混合物以降低最終酶混合物成本。
[0006] 然而，對于里氏木霉RutC30或巴西青霉（Penicilliumbrasilianum)的先前的 研究中沒有報(bào)道用于培養(yǎng)的基質(zhì)和所產(chǎn)生的酶在特定的基質(zhì)上的水解性能之間的明確關(guān) 系。在不同碳源的酶的培養(yǎng)中得到的結(jié)果的綜述可發(fā)現(xiàn)于Juhasz,T.，Szengyel,Z.，Rec zey,K. ,Siika-Aho,M. ,Viikari,L.^Characterizationofenzymeorenzymemixtures andhemienzymeorenzymemixturesproducedbyTrichodermareeseionvarious carbonsources"，（ProcessBiochem, 40, 3519-3525)和Jorgensen,H. ,Olsson,L. ,〃Produ ctionofenzymeorenzymemixturesbyPenicilliumbrasilianumIBT20888:Effect ofsubstrateonhydrolyticperformance"（EnzymeMicrobTechnol, 38, 381-390).W0 2007005918中描述了一種這樣的工藝。該工藝增加了經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素基質(zhì)作為酶 生長的誘導(dǎo)物，同時(shí)使用恒定添加量的葡萄糖作為有機(jī)體生長的養(yǎng)料（feed)的描述。該技 術(shù)所陳述的目的是用可作為主要碳源或酶生產(chǎn)誘導(dǎo)物的材料代替葡萄糖養(yǎng)料和目前用于 在宿主細(xì)胞中酶或酶混合物生產(chǎn)的純纖維素。該技術(shù)的優(yōu)勢是由于使用容易得到的并因 此比純的纖維素便宜的誘導(dǎo)物（木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)）而降低生產(chǎn)成本。作為誘導(dǎo)物，W0 2007005918使用少量的生物質(zhì)并連續(xù)加入葡萄糖以供養(yǎng)所述有機(jī)體。
[0007]US7, 494, 792公開了一種用于生產(chǎn)水解纖維素和/或水解半纖維素的酶的工藝， 所述工藝使用來自纖維素或木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的酶水解產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵的殘留物。所述 工藝可集成為從纖維素或木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的過程，其中所述殘留物用于產(chǎn)生 在預(yù)處理的基質(zhì)的酶水解中使用的酶。將由來自水解作用的乙醇生產(chǎn)得到的糖溶液從未水 解的基本上由木質(zhì)素組成的固體部分中分離，并用于乙醇發(fā)酵。葡萄糖是在該步驟中提取 的主要的糖。在分離所述乙醇后，來自乙醇發(fā)酵的殘留物用作用于酶產(chǎn)生的誘導(dǎo)碳的源或 主要的碳源。
[0008] 作為一般考慮，有將經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料的全部或最相關(guān)部分轉(zhuǎn)化為有價(jià) 值的產(chǎn)品的興趣。使用部分經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料作為用于酶生產(chǎn)的基質(zhì)可降低用于 將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為有用產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化過程的設(shè)備的產(chǎn)率。
[0009] 因此，需要開發(fā)更好使用木質(zhì)纖維素預(yù)處理原料的用于生產(chǎn)酶的工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本說明書中公開的是從宿主細(xì)胞生產(chǎn)用于水解第一經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生 物質(zhì)的至少一種酶的工藝，所述工藝包含在糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)能產(chǎn)生所述至少一種 酶的宿主細(xì)胞的步驟，所述糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境包含所述宿主細(xì)胞、水和固體組合物，所述固 體組合物進(jìn)一步包含所述固體組合物的復(fù)合糖（complexsugar)和所述固體組合物的木質(zhì) 素。所述固體組合物從第二經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中得到，所述第二經(jīng)預(yù)處理的 木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)包含第二經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的復(fù)合糖和第二經(jīng)預(yù)處理 的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的木質(zhì)素，且所述固體組合物中所述復(fù)合糖的總量和所述木質(zhì)素的 總量的比值小于所述第二經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中所述復(fù)合糖的總量和所述木 質(zhì)素的總量的比值。培養(yǎng)后，所述固體組合物轉(zhuǎn)化為固體殘留物。
[0011] 也公開了可在單糖（simplesugar)耗盡的條件下實(shí)施所述培養(yǎng)以部分培養(yǎng)時(shí)間， 所述單糖耗盡的條件具有以干態(tài)計(jì)所述糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境的O-lOwt%的量的添加的單糖 或糖類，所述部分培養(yǎng)時(shí)間為至少50%的培養(yǎng)時(shí)間。
[0012] 進(jìn)一步公開了所述固體組合物可通過包含以下步驟的過程從第二經(jīng)預(yù)處理的木 質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中得到：在水解催化劑存在下水解至少部分第二經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素 類生物質(zhì)，以產(chǎn)生含所述固體組合物和水及水溶性糖的溶液的經(jīng)水解的組合物；并從所述 經(jīng)水解的組合物中去除至少50%的水及水溶性糖的溶液。
[0013] 也公開了可通過至少一種包含在傾析、沉降、離心、過濾、壓濾和洗滌的組中的方 法實(shí)施部分所述經(jīng)水解的組合物的去除。
[0014] 進(jìn)一步公開了所述固體組合物可通過包含以下步驟的過程由第二經(jīng)預(yù)處理的木 質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中得到：在水解催化劑存在下水解至少部分第二經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素 類生物質(zhì)，以產(chǎn)生含復(fù)合糖和木質(zhì)素的水溶性糖類的經(jīng)水解的組合物；轉(zhuǎn)化所述經(jīng)水解的 組合物中的至少部分水溶性糖以產(chǎn)生含至少一種糖衍生產(chǎn)物的經(jīng)轉(zhuǎn)化的組合物，和所述固 體組合物；并去除部分所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的組合物，該部分包含至少部分所述至少一種糖衍生產(chǎn) 物。
[0015] 也公開了可通過包含在傾析、沉降、離心、過濾、壓濾、洗滌、蒸發(fā)和蒸餾的組中的 至少一種方法實(shí)施去除部分所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的組合物。
[0016] 進(jìn)一步公開了所述水解催化劑可包含第二酶或酶混合物，且其可選自由氫離子、 有機(jī)酸和無機(jī)酸組成的組。
[0017] 也公開了所述經(jīng)水解的組合物的轉(zhuǎn)化可包括發(fā)酵。
[0018] 進(jìn)一步公開了所述至少一種糖衍生產(chǎn)物可包括乙醇。
[0019] 進(jìn)一步公開了在單糖耗盡的條件下所述部分培養(yǎng)時(shí)間可選自由至少75%的培養(yǎng) 時(shí)間、至少85 %的培養(yǎng)時(shí)間、至少90 %的培養(yǎng)時(shí)間、至少95 %的培養(yǎng)時(shí)間、至少98 %的培養(yǎng) 時(shí)間組成的組。
[0020] 進(jìn)一步公開了在單糖耗盡的條件下所述部分培養(yǎng)時(shí)間可與所述培養(yǎng)時(shí)間相同。
[0021] 進(jìn)一步公開了添加的單糖或糖類的量以干態(tài)計(jì)在培養(yǎng)環(huán)境的0-5wt%、 0-2. 5wt%、0-2. 0wt%、0 - 1.Owt%的范圍內(nèi)。也公開了可在糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境中不添加單 糖。
[0022] 進(jìn)一步公開了至少第一酶可通過將所述糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境分離為含至少部分量 的第一酶的至少一種收獲的組合物和含至少部分量的所述固體組合物的固體殘留物的耗 盡的組合物而得到。
[0023] 也公開了所述酶或酶混合物可進(jìn)一步用于水解所述第一木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)，且 所述第一木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)和所述第二經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)均包含來源于 由相同禾本植物屬（grassgenus)或更優(yōu)選地相同禾本植物物種（grassspecies)組成的 組的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)。
[0024] 也公開了根據(jù)公開的工藝產(chǎn)生的酶或酶混合物和已被所述酶混合物水解的經(jīng)水 解的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)。
[0025] 進(jìn)一步公開了在耗盡的組合物中復(fù)合糖的總量以干態(tài)計(jì)可以選自由0_30wt%、 0_20wt%、0_15wt%、0_10wt%、0_7. 5wt%、0_5wt%、0_2. 5wt%組成的組的范圍存在。
【附圖說明】
[0026] 圖la是示出根據(jù)對比實(shí)施例和操作實(shí)施例的葡萄糖水解產(chǎn)率的圖。
[0027] 圖lb是示出根據(jù)對比實(shí)施例和操作實(shí)施例的木糖水解產(chǎn)率的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 已發(fā)現(xiàn)用于生產(chǎn)酶的工藝，特征在于，產(chǎn)生所述酶的宿主細(xì)胞在糖耗盡的培養(yǎng)環(huán) 境中培養(yǎng)的事實(shí)。所述糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境包含所述宿主細(xì)胞、水和由經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維 素類生物質(zhì)制得的固體組合物；所述固體組合物包含復(fù)合糖和木質(zhì)素，且其特征在于，所述 復(fù)合糖的總量和所述木質(zhì)素的總量的比值小于其來源的第二預(yù)處理木質(zhì)纖維素類生物質(zhì) 中的所述復(fù)合糖的總量和所述木質(zhì)素的總量的比值。換句話說，通過去除部分但不是全部 的含在所述經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中的所述復(fù)合糖，從經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素中 得到所述糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境中的所述固體組合物。所述糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境中的所述固體組 合物以干態(tài)計(jì)具有相對于所述經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)較低量的復(fù)合糖，但仍然包 含復(fù)合糖。
[0029] 已從所述經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中去除的糖可轉(zhuǎn)化為有用的化學(xué)品，例 如乙醇。
[0030] 然后由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的酶可用于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)和經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素 類生物質(zhì)的水解。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是三種主要的構(gòu)成木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的聚 合物。纖維素和半纖維素為聚合糖。
[0031] 在本發(fā)明的語境中，單糖為單體糖，且可選自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、 半乳糖和果糖組成的組。應(yīng)該注意的是，可有其它的單糖不在前述的列表中。單糖屬于水 溶性糖的組?？扇苄蕴菫楫?dāng)存在特定溶劑時(shí)，例如水，在所述溶劑中形成均相溶液的糖。
[0032] 單糖可直接供養(yǎng)宿主細(xì)胞，即所述宿主細(xì)胞不需要使用酶以代謝單糖。
[0033] 低聚糖是水溶性的聚合糖。低聚糖由不止一個(gè)單體糖組成。低聚糖可僅在一種或 多種通常由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的酶存在時(shí)由宿主細(xì)胞代謝。
[0034] 復(fù)合糖為不溶于水的聚合糖，例如水不溶性的葡聚糖和木聚糖。葡聚糖為一類包 含具有不同聚合度的葡萄糖聚合物分子的復(fù)合糖。木聚糖為一類包含具有不同聚合度的木 糖聚合物分子的復(fù)合糖。
[0035] 許多木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)至化學(xué)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化過程僅轉(zhuǎn)化部分復(fù)合糖，并產(chǎn)生主要 含木質(zhì)素和作為副產(chǎn)物的未轉(zhuǎn)化的復(fù)合糖的剩余部分的組合物。在一些情況下，即使能夠 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化所述經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中的復(fù)合糖，仍停止所述轉(zhuǎn)化過程，因?yàn)?這在經(jīng)濟(jì)上是不適當(dāng)?shù)?。仍然含剩余部分的?fù)合糖的所述組合物經(jīng)常被燃燒以產(chǎn)生熱量， 這是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中包含的糖的低價(jià)值的應(yīng)用。
[0036] 本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞可在糖耗盡的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，所述糖耗盡的培 養(yǎng)環(huán)境包含通過從經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中去除至少部分復(fù)合糖得到的固體組 合物，且所述宿主細(xì)胞可利用剩余部分的復(fù)合糖作為碳源。本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)，相對于使 用更昂貴的基質(zhì)作為碳源獲得的酶生產(chǎn)，從所述宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的酶可與之相當(dāng)或比之增 加。
[0037] 用于傳統(tǒng)地供養(yǎng)宿主細(xì)胞的單糖如葡萄糖和木糖可被比較便宜的所述固體組