物培養(yǎng)物在包含第一半胱氨酸濃度的半胱氨酸的第一發(fā)酵區(qū)中在厭氧條件 下生長(zhǎng)以在第一發(fā)酵區(qū)中產(chǎn)生半胱氨酸生長(zhǎng)微生物培養(yǎng)物。將一些或所有半胱氨酸生長(zhǎng)微 生物培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至包含硫添加劑的第二發(fā)酵區(qū)中，所述硫添加劑包含具有+2至+4氧化態(tài) (S (II)-S (IV))的無(wú)機(jī)硫化合物，其在第二發(fā)酵區(qū)中產(chǎn)生由硫原子與氧和/或氫原子組合 組成的陰離子。將包含（i) 一氧化碳、（ii)二氧化碳和氫氣或者（iii) (i)和（ii)的混合 物的基質(zhì)加入第二發(fā)酵區(qū)中以將基質(zhì)轉(zhuǎn)化成C2氧合物。從第二發(fā)酵區(qū)中回收一種或多種 合物。
[0028] 附圖簡(jiǎn)沐
[0029] 圖1-22為發(fā)酵數(shù)據(jù)的圖，其顯示來(lái)自使用本發(fā)明硫添加劑的一系列連續(xù)發(fā)酵的 氣體吸收和產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0030] 定義
[0031] "生物反應(yīng)器"意指具有至少一個(gè)用于在發(fā)酵介質(zhì)的存在下保持微生物的容器的 任何發(fā)酵設(shè)備，其中術(shù)語(yǔ)容器指任何容納裝置，包括管道、塔、膜、篩和其它類(lèi)似裝置，其可 排列成連續(xù)或分批反應(yīng)器，可包括泡罩塔生物反應(yīng)器（BCBR)、連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器（CSTR)、 固定化細(xì)胞反應(yīng)器（ICR)如膜支撐生物反應(yīng)器（MSBR)、噴射環(huán)流反應(yīng)器、滴流床反應(yīng)器、管 道反應(yīng)器或提供微生物與基質(zhì)的氣體液體接觸的任何其它裝置。本發(fā)明中所用發(fā)酵反應(yīng)器 可具有任何合適的設(shè)計(jì)；然而，優(yōu)選設(shè)計(jì)和操作提供一氧化碳和氫氣轉(zhuǎn)化成含氧有機(jī)化合 物的高轉(zhuǎn)化率。
[0032] "C2氧合物"意指包含2個(gè)碳原子、氫原子和至少一個(gè)氧原子的任何分子。優(yōu)選，C 2 氧合物包括乙醇、乙酸和乙酸鹽陰離子。
[0033] "微生物培養(yǎng)物"意指微生物與液體發(fā)酵介質(zhì)一起的混合物，其中微生物以淤漿、 懸浮液或固定群體（fixed colony)的形式存在。微生物培養(yǎng)物包含懸浮于移動(dòng)載體介質(zhì) 如管環(huán)或生物片上或者固定在載體介質(zhì)如膜或者其它多孔或半多孔介質(zhì)上的微生物。術(shù)語(yǔ) 微生物培養(yǎng)物包括由單一微生物菌株或者多個(gè)微生物菌株構(gòu)成的培養(yǎng)物。
[0034] "發(fā)酵介質(zhì)"意指接觸微生物且包含微生物保持其生物功能所需的營(yíng)養(yǎng)素如維生 素、礦物質(zhì)、氨基酸等和由微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的含水液體，其中將代謝產(chǎn)物從發(fā)酵介質(zhì) 中回收。發(fā)酵介質(zhì)可保持微生物以浮游狀態(tài)懸浮，可作為懸浮液介質(zhì)用于保持微生物生長(zhǎng) 或者可灌注于其中的載體材料，以及以防微生物培養(yǎng)物通過(guò)載體如膜。發(fā)酵介質(zhì)可直接接 收氣體基質(zhì)并用作將基質(zhì)供入微生物中的手段。
[0035] "發(fā)酵"意指通過(guò)微生物的任何基質(zhì)轉(zhuǎn)化，無(wú)論微生物是在有機(jī)體的初級(jí)生長(zhǎng)階段 還是在主要產(chǎn)生代謝物作為產(chǎn)物的階段。
[0036] "平均細(xì)胞停留時(shí)間"對(duì)連續(xù)發(fā)酵操作而言，意指發(fā)酵罐中細(xì)胞的總質(zhì)量除以生物 質(zhì)離開(kāi)發(fā)酵罐時(shí)的速率。
[0037] "營(yíng)養(yǎng)液"意指包含微生物支持或改進(jìn)其生物功能所需的一種或多種營(yíng)養(yǎng)素如維 生素、礦物質(zhì)或氨基酸，并加入發(fā)酵介質(zhì)中或者直接接觸微生物培養(yǎng)物的含水液體。
[0038] "有機(jī)硫"意指定義為具有至少一個(gè)燒基或芳基的任何硫衍生物的任何有機(jī)硫化 合物。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"氧化還原電位"或"0RP"的值在本文中量化時(shí)認(rèn)為是使用3. 8MKC1電解質(zhì) 鹽橋相對(duì)于Ag/Ag - Cl型電極測(cè)量的關(guān)于水溶液的該值測(cè)量。
[0040] "S(II) "、"S(III) "和"S(IV) "分別意指硫化合物中硫原子的2、3和4的正氧化 ??τ O
[0041] "基質(zhì)"意指提供主要碳和能量來(lái)源給微生物且包含一氧化碳或者二氧化碳和氫 氣的組合中的至少一種的氣體。
[0042] 發(fā)明詳沐
[0043] 本發(fā)明使用一類(lèi)獨(dú)特的無(wú)機(jī)硫化合物為發(fā)酵方法提供所需硫，所述發(fā)酵方法用于 由包含一氧化碳和/或二氧化碳與氫氣的組合中的一種或多種的氣體基質(zhì)制備(3 2氧合物。 在多數(shù)情況下，該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是消除了發(fā)酵區(qū)關(guān)于半胱氨酸的需求。在某些實(shí)施方案 中，它可在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)除去半胱氨酸或者可在發(fā)酵進(jìn)行時(shí)減少半胱氨酸和/或完全逐步消 除。這意指可將半胱氨酸減少至比如果半胱氨酸是生物可用硫的主要來(lái)源的話需要的低得 多的水平，或者如果不僅作為硫來(lái)源，而且作為氨基酸的直接來(lái)源的話，可從正在進(jìn)行的發(fā) 酵操作中消除。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明無(wú)機(jī)硫添加劑在發(fā)酵區(qū)內(nèi)提供非常持久形式的硫并且還能使微 生物在生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段中生存使得可由發(fā)酵段實(shí)現(xiàn)高滴定量的乙醇。
[0044] 本發(fā)明的必要組分是一類(lèi)具體硫添加劑的提供?？捎糜诒景l(fā)明中的硫添加劑包含 具有以+2至+4氧化態(tài)存在的硫原子（S(II)-S(IV))的硫化合物。這些添加劑可以為會(huì)提 供硫含氧陰離子和/或氫硫含氧陰離子的任何類(lèi)型的硫化合物。具體陰離子形式的添加劑 包括亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、偏亞硫酸氫鹽、二氧化硫、連二亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽。添加劑 可通過(guò)加入各種硫化合物如亞硫酸、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鉀、連二亞硫 酸、連二亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉得到。
[0045] 硫添加劑在分散到發(fā)酵介質(zhì)的含水液體中時(shí)會(huì)以其活性陰離子形式存在。在本發(fā) 明中有效的硫的含氧陰離子和氫硫含氧陰離子包括亞硫酸根形式SO廣和亞硫酸氫根（亞 硫酸氫根）形式HSO 3'盡管不愿受任何理論束縛，本發(fā)明依賴于微生物在其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜 上傳送這些硫含氧陰離子的能力。當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)部時(shí)，微生物將含氧陰離子還原成HS'。可 能進(jìn)行反應(yīng)序列：借助亞硫酸鹽還原酶的SO廣=>H 2S。然后借助0-乙酰絲氨酸硫化氫解 酶（〇-acetylserine sulfhydrolase)的HSO-乙酰絲氨酸=> 半胱氨酸。當(dāng)暴露于水下 時(shí)，硫化合物離解成亞硫酸根陰離子和其它正電性物種或中性分子的平衡混合物。例如，使 用亞硫酸水溶液作為添加劑會(huì)根據(jù)下式產(chǎn)生二氧化硫和亞硫酸根離子的平衡：
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 通過(guò)用產(chǎn)生乙醇或丁醇中的至少一種的嗜一氧化碳微生物厭氧發(fā)酵而制備C 2和C 4 氧合物的方法，所述方法包括：(a)提供包含S(II)-s(IV)無(wú)機(jī)硫化合物的硫添加劑，其在 含水發(fā)酵介質(zhì)中產(chǎn)生硫的含氧陰離子，（b)使微生物的微生物培養(yǎng)物與包含一氧化碳的基 質(zhì)接觸并將微生物培養(yǎng)物保持在包含硫添加劑且具有小于5. 3的pH的發(fā)酵介質(zhì)中，和（c) 從發(fā)酵介質(zhì)中回收CjPC4氧合物中的一種或多種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中它如下在乙醇或乙酸鹽制備中減少半胱氨酸：(a)使嗜 一氧化碳微生物的微生物培養(yǎng)物與包含一氧化碳的基質(zhì)接觸，并使微生物培養(yǎng)物在包含第 一半胱氨酸濃度的半胱氨酸的第一發(fā)酵區(qū)中在厭氧條件下生長(zhǎng)以在第一發(fā)酵區(qū)中產(chǎn)生半 胱氨酸生長(zhǎng)微生物培養(yǎng)物；(b)將半胱氨酸生長(zhǎng)微生物培養(yǎng)物加入包含硫添加劑且具有比 第一發(fā)酵區(qū)更低的半胱氨酸濃度的第二發(fā)酵區(qū)中，所述硫添加劑包含具有+2至+4氧化態(tài) 的無(wú)機(jī)硫化合物，其在第二發(fā)酵區(qū)中產(chǎn)生由硫原子與氧和/或氫原子組合組成的陰離子； (c)將基質(zhì)加入第二發(fā)酵區(qū)中以將基質(zhì)轉(zhuǎn)化成至少一種(： 2氧合物；和（d)從第二發(fā)酵區(qū)中 回收一種或多種(：2氧合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫的含氧陰離子包括氫硫含氧陰離子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫添加劑為S(III)-S(IV)無(wú)機(jī)硫化合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中硫添加劑選自由亞硫酸、亞硫酸氫鹽、偏亞硫酸氫 鹽、連二亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸氫鈉及其組合組成的組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟（b)的接觸在有機(jī)硫來(lái)源的存在下進(jìn)行，且有機(jī)硫 的濃度經(jīng)預(yù)定的時(shí)間降低。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或4的方法，其中加入發(fā)酵介質(zhì)中的有機(jī)硫的濃度為小于0. 3毫 摩爾有機(jī)硫每克微生物干細(xì)胞重量。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中硫添加劑以0. 1-10毫摩爾的濃度，更優(yōu)選.5-2毫 摩爾硫每克微生物干細(xì)胞重量的濃度存在于發(fā)酵介質(zhì)中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中發(fā)酵介質(zhì)的pH為4. 3-5. 1，優(yōu)選4. 3-4. 9。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中產(chǎn)生氧合物的發(fā)酵介質(zhì)包含0. 1-1. 0的螯合物： 總過(guò)渡金屬摩爾比范圍的螯合劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中螯合劑選自由乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、 硝基三乙酸、檸檬酸鈉及其混合物組成的組。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中它產(chǎn)生包含乙醇的(：2氧合物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述方法產(chǎn)生乙酸鹽，且步驟（c)的發(fā)酵介質(zhì)中的乙 醇：乙酸鹽比為至少5:1。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中微生物包含以下中的至少一種：Clostridium Coskatii、楊氏梭菌（Clostridium Ljungdahlii)、Clostridium autoethanogenum、拉氏 梭菌(Clostridium ragsdalei)、Clostridum carboxidivorrans 或 Butyribacterium methlyotrophicim〇
15. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中第二發(fā)酵區(qū)具有0.5-2毫摩爾硫每克微生物干細(xì)胞重 量的硫添加劑濃度。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中將細(xì)胞培養(yǎng)物從第二發(fā)酵區(qū)中取出并轉(zhuǎn)移至第三發(fā) 酵區(qū)中，第三發(fā)酵區(qū)包含硫添加劑和相對(duì)于第二發(fā)酵區(qū)降低的半胱氨酸濃度。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及在通過(guò)微生物發(fā)酵制備乙醇和乙酸鹽中的改進(jìn)，特別是通過(guò)包含CO的基質(zhì)微生物發(fā)酵和加入無(wú)機(jī)硫添加劑而制備醇。它更特別地涉及將無(wú)機(jī)有機(jī)硫來(lái)源供入發(fā)酵系統(tǒng)中使得一種或多種微生物將包含CO的基質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙醇。一方面，本發(fā)明使用包含具有+2至+4硫氧化態(tài)的無(wú)機(jī)硫化合物的硫添加劑，所述添加劑在含水發(fā)酵介質(zhì)中產(chǎn)生硫含氧陰離子和氫硫含氧陰離子。
【IPC分類(lèi)】C12P9-00, C12P7-00, C12P7-16, C12P7-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104619849
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380036403
【發(fā)明人】R·E·托比, T·D·艾倫, P·M·洛肯, A·J·海寧, G·陳
【申請(qǐng)人】科斯卡塔公司
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2013年7月11日
【公告號(hào)】CA2877566A1, EP2872638A1, US20140017747, WO2014011867A1