氧合物的方法
【專利說明】通過使用高氧化態(tài)硫發(fā)酵而制備C2氧合物的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通過使用嗜一氧化碳微生物厭氧發(fā)酵而由一氧化碳和/或二氧化碳 和氫氣的基質(zhì)制備乙醇和/或乙酸鹽的方法。更特別地，本發(fā)明涉及以更劃算且對(duì)該乙醇 和乙酸鹽的制備有利的方式使用具體無機(jī)硫來源提供微生物的生物硫需求。
[0002] 置量
[0003] 用作液體發(fā)動(dòng)機(jī)燃料或者用于與常規(guī)汽油或柴油發(fā)動(dòng)機(jī)燃料混合的生物燃料生 產(chǎn)在世界范圍內(nèi)日益提高。這類生物燃料包括例如乙醇和正丁醇。關(guān)于生物燃料的主要驅(qū) 動(dòng)之一是它們通過發(fā)酵和生物加工技術(shù)由可再生資源得到。慣例地，生物燃料由容易發(fā)酵 的碳水化合物如糖和淀粉制備。由于這些進(jìn)料來源與人類食品供應(yīng)競爭，許多近期的工作 關(guān)注生物燃料和其它化學(xué)品的替代進(jìn)料來源。
[0004] -個(gè)替代進(jìn)料來源為木素纖維素原料，例如林業(yè)廢物、種植園樹木、稻草、禾草和 其它農(nóng)業(yè)廢物。然而，木素纖維素材料的能使它們提供植物和樹木的機(jī)械支撐結(jié)構(gòu)的非常 不均勻性質(zhì)使得它們固有地對(duì)抗生物轉(zhuǎn)化。另外，這些材料主要包含三個(gè)分開類別的組分 作為結(jié)構(gòu)單元：纖維素（Cjg聚合物）、半纖維素（各種C 5和C 6糖聚合物）和木質(zhì)素（芳 族和醚連接的雜聚合物）。然后其它已知的技術(shù)可將木素纖維素生物質(zhì)進(jìn)料轉(zhuǎn)化成合成氣 (也稱為合成氣體，主要是〇)、4和CO 2與其它組分如CH4、N2、NH3、H 2S和其它痕量氣體的混 合料）。然后將該合成氣用厭氧微生物發(fā)酵以產(chǎn)生生物燃料如乙醇、正丁醇或化學(xué)品如乙 酸、丁酸等。美國專利7, 285, 402公開了通過使用厭氧細(xì)菌發(fā)酵而將一氧化碳、二氧化碳和 氫氣轉(zhuǎn)化成乙酸和乙醇的方法，通過引用將其教導(dǎo)并入本文中。
[0005] 用于生產(chǎn)生物燃料和其它化學(xué)品的厭氧發(fā)酵可使用由多種來源提供一氧化碳和/ 或二氧化碳和氫氣的任何氣體基質(zhì)。例如，美國專利公開2011/0300593公開了來源如鋼廠 廢氣作為一氧化碳的來源并通過引用將其教導(dǎo)并入本文中。許多其它基質(zhì)來源是可得到 的。例如，合成氣可由許多其它含碳原料如天然氣、重整氣體、泥煤、石油焦、煤、固體廢物和 填埋氣體制備。
[0006] 乙醇可使用多種厭氧細(xì)菌，特別是例如來自梭菌的那些由C0、0)2和H2制備。例 如，描述了由氣體制備乙醇的多種細(xì)菌菌株，包括楊氏梭菌（Clostridium Ljungdahlii)、 Clostridium autoethanogenum 和 Clostridium coskatii，這些都描述于本文中。
[0007] 通過厭氧微生物制備乙醇和其它產(chǎn)物受發(fā)酵區(qū)內(nèi)的許多操作條件影響（參見美 國專利 Nos. 5, 173, 429、5, 593, 886 和 6, 368, 819、WO 98/00558 和 WO 02/08438)。影響微 生物性能的兩個(gè)主要條件是發(fā)酵區(qū)的pH和氧化還原電位（ORP)。W02009/022925公開了 pH 和ORP在氣體基質(zhì)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物中的影響。
[0008] 用于代謝方法中的微生物需要營養(yǎng)素和微量營養(yǎng)素，且特定營養(yǎng)素供應(yīng)可對(duì)微生 物的生長和持續(xù)性具有深遠(yuǎn)影響。事實(shí)上，可能需要這些營養(yǎng)素以使微生物使用一氧化碳 作為其能量來源。例如，微生物可能需要金屬輔因子的存在以用于一氧化碳脫氫酶（CODH) 和乙酰-CoA合酶（ACS)的代謝作用。重要的是所有所要求的營養(yǎng)素以合適的量和生物可 用形式提供。
[0009] 另一所要求的營養(yǎng)素是還原硫來源，其通常為有機(jī)硫化物如半胱氨酸的形式。半 胱氨酸提供支持微生物培養(yǎng)物中發(fā)生的酶方法所需的硫來源。熟知微生物在其酶方法中需 要硫。事實(shí)上，電子傳遞介質(zhì)，鐵氧化還原蛋白以及Wood-Ljungdahl途徑酶乙酰-CoA合酶 和一氧化碳脫氫酶包含硫。因此，重要的是以生物可用形式并以足夠的供應(yīng)加入硫以避免 微生物抑制產(chǎn)物的生長和制備。
[0010] 作為半胱氨酸的替代物，發(fā)現(xiàn)硫化氫在許多情況下是微生物代謝方法中所需的還 原硫來源。硫來源如硫化物與典型發(fā)酵介質(zhì)中的硫化氫平衡存在。盡管硫化氫比半胱氨 酸更便宜，它是有毒的，因此需要特殊處理，并且以純形式是特別危險(xiǎn)的。提供硫化物鹽形 式的硫如硫化鈉仍產(chǎn)生發(fā)酵罐中可能由于蒸發(fā)而隨時(shí)間而降低的硫化氫濃度。此外，硫化 氫在介質(zhì)中具有有限的溶解度。硫化氫可在發(fā)酵區(qū)中可能需要的某些條件下變成高揮發(fā)性 的，由此惡化它作為硫來源的用途。由于硫化氫在水中的有限溶解度，溶液中的硫濃度可能 由于發(fā)酵介質(zhì)內(nèi)的條件而明顯降低。因此，確定使用一氧化碳或氫氣和二氧化碳?xì)怏w作為 原料的發(fā)酵系統(tǒng)中所需醇生產(chǎn)中的微生物的改進(jìn)或可選硫來源會(huì)幫助實(shí)現(xiàn)高醇生產(chǎn)率和 低方法操作成本。
[0011] 因此，由厭氧發(fā)酵制備乙醇或乙酸鹽的方法獲益于硫化物的發(fā)現(xiàn)，所述硫化合物 可便宜地提供在有利發(fā)酵條件下的微生物的生物硫需求，同時(shí)還消除了硫化氫作為硫來源 的缺點(diǎn)。
[0012] 美國專利公開20110300593公開了可選硫來源的使用。該文件僅明確地描述了聚 硫化物、多種聚硫化物、元素硫和膠態(tài)硫作為無機(jī)硫化合物以用作可選硫來源。更重要的 是，該文件描述了這些具體硫化合物作為提供硫化氫作為發(fā)酵介質(zhì)中的活性物種的用途。 因此，該參考文獻(xiàn)沒有確定除硫化氫外，會(huì)提供生物可用形式的硫的硫添加劑，因此沒有克 服硫化氫的高揮發(fā)性問題。
[0013] 尋求增強(qiáng)合成氣發(fā)酵制備C2含氧有機(jī)化合物的經(jīng)濟(jì)性的方法，其中硫營養(yǎng)素可通 過該方法以"按需"速率有效且便宜地提供。
[0014] 發(fā)明概沐
[0015] 本發(fā)明提供將合成氣生物轉(zhuǎn)化成C2含氧有機(jī)化合物如乙醇和乙酸鹽的方法，其中 硫營養(yǎng)素的供應(yīng)由硫添加劑提供，所述硫添加劑以滿足微生物的代謝需求的形式為液體營 養(yǎng)介質(zhì)貢獻(xiàn)硫含氧陰離子或氫硫含氧陰離子，同時(shí)促進(jìn)發(fā)酵區(qū)在會(huì)抑制污染微生物生長的 PH下操作。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)這類化合物可提供由COXOdPH2基質(zhì)制備乙醇和乙酸鹽中嗜 一氧化碳微生物的營養(yǎng)硫需求。這類化合物包括在各種食品中例行地用作抗微生物劑的亞 硫酸氫鹽。技術(shù)人員預(yù)期這類化合物干擾微生物的生長和生存能力。因此，驚訝地發(fā)現(xiàn)這 類化合物可有利地用于提供硫物種，所述硫物種會(huì)滿足微生物的代謝要求，同時(shí)避免硫化 氫在發(fā)酵區(qū)中的較低pH條件下的揮發(fā)性問題。
[0016] 以寬方面，本發(fā)明提供使用產(chǎn)乙醇嗜一氧化碳微生物，同時(shí)將硫以生物可用且非 ?？扇艿男问焦┤氚l(fā)酵介質(zhì)中而制備C 2氧合物的方法。保持5. 3以下，更優(yōu)選5. 1以下的 PH在抑制發(fā)酵區(qū)中的污染微生物生長中是非常有利的?？筛淖兓蚱茐陌l(fā)酵方法的常見污染 物是產(chǎn)生丁酸酯并可降低該方法對(duì)于更想要的乙醇產(chǎn)物的選擇性的微生物。
[0017] 在提供較高氧化態(tài)硫中，本發(fā)明使用微生物作為將硫的氧化態(tài)降至可用形式的手 段。提出以該方式，微生物產(chǎn)生氫硫化物（HS-)，如果使用它的話，它在細(xì)胞內(nèi)同化。這減 少了液體營養(yǎng)介質(zhì)中HS -的存在，并幫助使會(huì)貢獻(xiàn)于來自發(fā)酵的硫化氫排放的任何硫化 氫平衡濃度最小化。
[0018] 在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明為通過用產(chǎn)乙醇嗜一氧化碳微生物厭氧發(fā)酵而制備 C2氧合物的方法。該方法包括：提供包含S(II)-S(IV)無機(jī)硫化合物的硫添加劑，其在含 水發(fā)酵介質(zhì)中產(chǎn)生包含氧和/或氧和氫原子的硫陰離子，使微生物的微生物培養(yǎng)物與包 含一氧化碳的基質(zhì)接觸，將微生物培養(yǎng)物保持在包含硫添加劑且具有小于5. 3的pH的發(fā) 酵介質(zhì)中，和從發(fā)酵介質(zhì)中回收一種或多種C2氧合物。在另一實(shí)施方案中，硫添加劑包含 S(III)-S(IV)無機(jī)硫化合物。
[0019] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，硫添加劑為亞硫酸、亞硫酸氫鹽、偏亞硫酸氫鹽、連二亞 硫酸鹽、硫代硫酸鹽或其組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，硫添加劑為亞硫酸、亞硫酸氫鹽、偏 亞硫酸氫鹽或其組合。在其它實(shí)施方案中，硫添加劑可包含亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉。
[0020] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，硫添加劑以至少0. 1，通常0. 1-10,優(yōu)選0. 5-2毫摩爾硫 每克微生物干細(xì)胞重量的濃度存在于發(fā)酵介質(zhì)中。
[0021] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，微生物與硫添加劑的接觸在加入的有機(jī)硫來源的存在下 進(jìn)行，且發(fā)酵介質(zhì)中有機(jī)硫的濃度隨著時(shí)間而降低。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵介質(zhì)中有 機(jī)硫的濃度小于〇. 3毫摩爾有機(jī)硫每克微生物干細(xì)胞重量，更優(yōu)選小于0. 1毫摩爾有機(jī)硫 每克微生物干細(xì)胞重量。
[0022] 另一方面，本發(fā)明提供消除半胱氨酸作為氨基酸和硫來源加入發(fā)酵的液體營養(yǎng)介 質(zhì)中的方法。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，發(fā)酵介質(zhì)中的半胱氨酸濃度可明顯降低，優(yōu) 選降至小于0. 3毫摩爾每克微生物干細(xì)胞重量的濃度。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可完全消 除向發(fā)酵介質(zhì)中的半胱氨酸添加。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，將發(fā)酵介質(zhì)的pH保持為4. 3-5. 1，優(yōu)選4. 9以下。
[0024] 在本發(fā)明另一方面，該方法包括在發(fā)酵介質(zhì)中的螯合劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中， 本發(fā)明使用乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、氨三乙酸、檸檬酸鈉及其混合物作為螯合 劑。
[0025] -般而言，乙醇是通過微生物制備的優(yōu)選代謝物。在多數(shù)情況下，其它代謝物會(huì)與 乙酸鹽一起在基質(zhì)的發(fā)酵中產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法可改進(jìn)醇：酸產(chǎn)物比。發(fā)現(xiàn)大于5:1和 大于10:1的乙醇：乙酸鹽產(chǎn)物比以及20:1或者與乙酸鹽相比更有利于醇的較高比。
[0026] 本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是其中有機(jī)硫來源如半胱氨酸用于第一容器中以使微生物培 養(yǎng)物生長，然后將微生物培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至第二容器中的情況。如果需要的話，第一容器還可包 含硫添加劑。來自第一容器的微生物培養(yǎng)物與基質(zhì)的接觸然后可在分開的第二容器中進(jìn) 行。第二容器可以用很少或者不用半胱氨酸保持發(fā)酵。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，第二發(fā) 酵容器是更大體積的發(fā)酵容器，如在種子培養(yǎng)操作中所實(shí)踐的，以使微生物培養(yǎng)物傳代至 商業(yè)規(guī)模體積。微生物培養(yǎng)物的這一轉(zhuǎn)移可繼續(xù)至第三發(fā)酵區(qū)以及具有更高體積的其它發(fā) 酵區(qū)中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)發(fā)酵區(qū)體積提高時(shí)，有機(jī)硫如半胱氨酸的濃度會(huì)降低。 在另一實(shí)施方案中，將半胱氨酸加入發(fā)酵區(qū)中僅在具有小于40, 000升，更優(yōu)選小于4, 000 升的體積的發(fā)酵區(qū)中繼續(xù)。
[0027] 因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明為在通過厭氧發(fā)酵制備乙醇或乙酸鹽中減少半 胱氨酸的方法。該方法包括：使嗜一氧化碳微生物的微生物培養(yǎng)物與包含一氧化碳的基質(zhì) 接觸并使微生