用于生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌抗原的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌抗原的方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌（Hib)的莢膜多糖的方法， 根據(jù)所述方法，將Hib的菌株在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基的組成是在化學(xué)上進(jìn)行定 義的，且因此不包含任何復(fù)雜的氮源或碳源。
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)，具體而言申請(qǐng)W2009007641，描述了用于b型流感嗜血桿菌的改進(jìn)培養(yǎng) 基，其不包含任何來(lái)自動(dòng)物源的要素，如當(dāng)培養(yǎng)b型流感嗜血桿菌的目的在于產(chǎn)生將隨后 作為抗原引入疫苗組合物的莢膜多糖時(shí)所推薦。在該現(xiàn)有技術(shù)中描述的培養(yǎng)基中，用植物 蛋白胨代替通常由動(dòng)物蛋白胨組成的氮源。
[0003] 此類(lèi)培養(yǎng)基在藥物產(chǎn)品的安全性方面而言代表了很大進(jìn)展，特別是關(guān)于消除了疾 病諸如牛海綿狀腦炎傳播的風(fēng)險(xiǎn)；因此，它們?cè)试S符合衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)的推薦。
[0004] 然而，蛋白胨的組成可以根據(jù)所提供的批次而變化，這可以導(dǎo)致產(chǎn)生的細(xì)菌量和 還有有用抗原的產(chǎn)量的變化，這是疫苗生產(chǎn)者試圖通過(guò)改變?cè)诜椒ǖ膶?shí)施過(guò)程中的某些參 數(shù)來(lái)限制或校正的。然而，在藥物產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)的背景下，期望能夠具有可用的穩(wěn)健方 法，其需要在每次實(shí)施時(shí)盡可能少的改變，并且其在每個(gè)步驟的結(jié)果在批次間是可再現(xiàn)的。
[0005] 此類(lèi)方法還必須允許產(chǎn)率與工業(yè)盈利相容，在從細(xì)菌產(chǎn)生抗原的情況下，標(biāo)準(zhǔn)不 僅僅是僅獲得最大可能量的細(xì)菌，而且獲得抗原滴度和產(chǎn)生的細(xì)菌量之間的最佳比率；其 因此對(duì)于在向著產(chǎn)生莢膜多糖引導(dǎo)細(xì)菌的代謝的條件下培養(yǎng)的細(xì)菌是期望的。
[0006] 為此，本發(fā)明的主題是用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血 桿菌type b)的莢膜多糖（PRP)的方法，根據(jù)所述方法，將b型 流感嗜血桿菌（Hib)的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲該培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便 從其提取莢膜多糖，所述培養(yǎng)基包含至少： -一種碳源， -原卟啉， -鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， -PH調(diào)節(jié)手段， 其特征在于所述培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的。
[0007] 憑借本發(fā)明，通過(guò)能夠具有穩(wěn)健的工業(yè)方法，提高莢膜多糖的產(chǎn)率，而不必相應(yīng)地 增加生物量，由此使得可能相對(duì)于所生產(chǎn)的PRP量降低產(chǎn)生的脂多糖（LPS)的量。
[0008] 此外，培養(yǎng)基組成中不存在蛋白降低了所需的消泡劑產(chǎn)品方面的需求，且簡(jiǎn)化了 純化步驟，這使得可能從培養(yǎng)上清液獲得由莢膜多糖組成的抗原。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基包含pH調(diào)節(jié)手段。這些pH調(diào)節(jié)手段可以由緩沖鹽和/ 或與用于將酸或堿添加至培養(yǎng)基的裝置組合的PH測(cè)量裝置組成。借助于pH的調(diào)節(jié)，產(chǎn)率 可以進(jìn)行優(yōu)化。
[0010] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的方法還在于將產(chǎn)生的PRP綴合至載體蛋白，諸 如破傷風(fēng)蛋白。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)主題還是用于制備疫苗組合物的方法，根據(jù)所述方法： -通過(guò)于在化學(xué)上確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hib的菌株在工業(yè)規(guī)模上制備由莢膜多糖 (PRP)組成的針對(duì)b型流感嗜血桿菌（Hib)的抗原，所述培養(yǎng)基的每種成分的性質(zhì)和量是完 全確定的，且包含至少： -一種碳源， -原卟啉， -鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， -以及PH調(diào)節(jié)手段， -收獲培養(yǎng)上清液，和處理該培養(yǎng)上清液以便由其提取純化的莢膜多糖， -將莢膜多糖綴合至載體蛋白。
[0012] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，還將獲得的綴合物與意欲用于針對(duì)以下感染中的一種或多 種的接種的至少一種或多種抗原組合：白喉、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎、乙型肝炎、水痘、腮腺 炎、風(fēng)疫、由腦膜炎奈瑟氏菌（Afci1S1Seria iit/is)或肺炎鏈球菌（Sire/?iOcoccw1S 引起的感染、由輪狀病毒引起的感染，以便獲得允許針對(duì)數(shù)種疾病同時(shí)免疫的 疫苗組合。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的，即每種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和還有量是已知 的。此類(lèi)培養(yǎng)基不含復(fù)雜的氮源或碳源，諸如蛋白胨、酪蛋白、血清等，并且可以因此，如果 需要，保證不含任何直接源自動(dòng)物的要素。
[0014] 本發(fā)明涉及用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌的莢膜多糖的方法。此類(lèi)方 法使得可能獲得與工業(yè)約束相容的生物量和莢膜多糖或PRP的產(chǎn)率。此類(lèi)方法使得特別 可能從在其遺傳密碼中具有至少2個(gè)拷貝的基因座（編碼實(shí)現(xiàn)莢膜合成的功能）的b 型流感嗜血桿菌的菌株，在培養(yǎng)12小時(shí)后獲得對(duì)應(yīng)于至少2. 4的694 nm的D. 0.的生物 量和至少240 mg/升培養(yǎng)基的PRP的相關(guān)量的PRP，而不用特定調(diào)節(jié)培養(yǎng)基（諸如pH或 P〇2)。產(chǎn)生的PRP的量的確定通過(guò)高效陰離子交換色譜法與脈沖安培檢測(cè)器（HPAEC-PAD) (Dionex)聯(lián)用的技術(shù)，或給出等同結(jié)果的方法來(lái)測(cè)量。有利地，根據(jù)本發(fā)明的方法使得獲得 至少270 mg/升培養(yǎng)基的PRP的量，甚至更有利地至少300 mg/升的量。
[0015] 在可能的碳源中，可以提到所有可以由b型流感嗜血桿菌的菌株代謝的碳源，特 別是：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、巖藻糖、唾液酸和乳酸。還可以使用2種或更 多種不同的源，特別是乳酸和葡萄糖。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，在起始培養(yǎng)基中存在的葡萄糖的量為5和25 g/Ι之間，更特別是10 至20 g/Ι，且更特別是12至16 g/1。
[0017] 起始培養(yǎng)基中存在的乳酸的量可以是0和15 g/1之間，更特別是0. 5至10 g/1。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，培養(yǎng)基的原Π 卜啉是合成的原Π 卜啉，例如由 Sigma-Aldrich公司以編號(hào)258385 (原卟啉二鈉鹽）提供的原卟啉。因此，可以使用可保證 是完全不含動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)的培養(yǎng)基。或者，使用合成的原卟啉IX，其式如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血桿菌（ 的莢膜多糖（PRP)的方法，根據(jù)所述方法，將b型流感嗜血桿菌（Hib)的菌株 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便從其提取莢膜多糖，所述培養(yǎng)基 包含至少： -一種碳源， -原卟啉， _鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， _ pH調(diào)節(jié)手段， 其特征在于所述培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的。
2. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基至少包含鋅。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述pH調(diào)節(jié)手段由緩沖鹽組成。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述碳源可以是多重的且選自：葡 萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、巖藻糖、唾液酸和乳酸。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述原卟啉是合成的原卟啉IX。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述鹽選自鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、鈣鹽、 鐵鹽、鋅鹽、鈷鹽和錳鹽。
7. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述鹽選自：K 2HP04;KH 2P04;MgS0 4. 7 H20 ; Na2HP04. 12H20 ；NaH2P04. 2H20 ；CaCl2. 2H20 ；FeS04. 7H20 ；ZnS04. 7H20 ；CoCl2. 6 H20 ；MnS04. H20〇
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述氨基酸選自： 籲精氨酸， 籲丙氨酸， ?以下中的至少一種：天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸， 籲賴(lài)氨酸， ?組氨酸， ?色氨酸， 籲纈氨酸， 籲異亮氨酸， 籲亮氨酸， ?酪氨酸， 籲苯丙氨酸， ?胱氨酸或等效物。
9. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基至少包含精氨酸、丙氨酸、組氨 酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用谷胱甘肽或半胱氨酸替代胱氨 酸。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述維生素選自：硫胺素、泛酸 鹽、尿嘧啶、次黃嘌呤、生物素、核黃素和吡哆醇。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用瓜氨酸替代精氨酸和尿嘧啶。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于其還包括將獲得的莢膜多糖綴合 至載體蛋白的步驟。
14. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述載體蛋白是破傷風(fēng)類(lèi)毒素。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的獲得的莢膜多糖用于制備疫苗組合物的用途。
16. 用于制備疫苗組合物的方法，根據(jù)所述方法： -a)通過(guò)于在化學(xué)上確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hib的菌株在工業(yè)規(guī)模上制備由莢膜多糖 (PRP)組成的針對(duì)b型流感嗜血桿菌（Hib)的抗原，所述培養(yǎng)基的每種成分的性質(zhì)和量是完 全確定的，且包含至少： -一種碳源， -原卟啉， -鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， -以及pH調(diào)節(jié)手段， _ b)收獲該培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便由其提取純化的莢膜多糖， -c)將步驟b)中獲得的莢膜多糖綴合至載體蛋白， -d)將步驟c)中獲得的綴合物與用于針對(duì)以下感染中的一種或多種的接種的至少一 種或多種抗原組合：白喉、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎、乙型肝炎、水痘、腮腺炎、風(fēng)疹、由腦膜炎奈 瑟氏菌（Afcisseria )或肺炎鏈球菌引起的感 染、由輪狀病毒引起的感染，以便獲得允許針對(duì)數(shù)種疾病同時(shí)免疫的疫苗組合。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)用于疫苗目的b型流感嗜血桿菌的莢膜多糖(PRP)的方法，根據(jù)所述方法，將b型流感嗜血桿菌(Hib)的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲該培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便從其提取莢膜多糖，所述培養(yǎng)基包含至少：–一種碳源，–原卟啉，–鹽，–氨基酸，–NAD或NADH，–維生素，–pH調(diào)節(jié)手段，其特征在于所述培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的。
【IPC分類(lèi)】A61K39-102, C12N1-20, A61K47-26
【公開(kāi)號(hào)】CN104583390
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380035582
【發(fā)明人】勒希爾 J., 盧比埃 P., 巴比拉托 F., 林德利 N.
【申請(qǐng)人】賽諾菲巴斯德有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年7月2日
【公告號(hào)】CA2878053A1, EP2885397A1, US20150167036, WO2014006318A1