用于篩選水稻耐旱品種的snoRNA基因分子標(biāo)記的引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種用于篩選水稻耐旱品種的snoRNA 基因分子標(biāo)記的引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 水資源短缺是目前制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問題，全球約有43%的耕地為干 旱、半干旱地區(qū)。干旱逆境嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，造成作物減產(chǎn)。我國(guó)屬貧水國(guó)家，水 資源供需矛盾十分尖銳，近年來，缺水將是我國(guó)面臨的最嚴(yán)重的問題之一。且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)頻繁的干旱，對(duì)糧食生產(chǎn)造成巨大的損失，全世界每年因干旱而造成的糧食 生產(chǎn)的損失幾乎等于其它所有環(huán)境因子造成損失的總和。
[0003] 核仁小分子RNA (snoRNA)是一類小分子非編碼RNA，其可能通過調(diào)整rRNA折疊以 及與核糖體蛋白的相互關(guān)系，對(duì)核糖體的生物合成和活性起到調(diào)節(jié)作用。
[0004] 雖然snoRNA基因在植物生命活動(dòng)中起著重要的作用，但目前對(duì)其在植物逆境中 的作用還知之甚少。我們發(fā)現(xiàn)耐旱品種Oryza sativa Z257snoRNA基因在干旱逆境中上調(diào) 表達(dá)，而在干旱敏感品種中該基因表達(dá)活性未發(fā)生變化。對(duì)該基因我們進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR研 宄，在干旱脅迫下不同品種的水稻根系檢測(cè)了該基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明該基因也僅在 耐旱性強(qiáng)的品種中上調(diào)表達(dá)，由此我們推斷該snoRNA基因在水稻干旱脅迫時(shí)發(fā)揮重要的 調(diào)控作用，可以成為抗旱選擇指標(biāo)。因此我們通過該基因設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，用于耐旱品種快速 篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于篩選水稻耐旱品種的snoRNA基因的分 子標(biāo)記的引物。
[0006] 本發(fā)明要解決的另外一個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述引物用于制備篩選水稻耐旱 品種的snoRNA基因的分子標(biāo)記的方法。
[0007] 本發(fā)明要解決的還有一個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述引物在篩選水稻耐旱品種方 面的應(yīng)用。
[0008] 對(duì)于用于篩選水稻耐旱品種的snoRNA基因的分子標(biāo)記的引物，本發(fā)明采用的技 術(shù)方案是：引物是具有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID NO :2 所示核苷酸序列的反向引物。
[0009] 對(duì)于上述引物用于制備篩選水稻耐旱品種的snoRNA基因的分子標(biāo)記的方法，本 發(fā)明采用的技術(shù)方案是包括以下步驟：
[0010] (I)DNA的提?。杭羧∷酒贩N的新鮮葉片，使用組織研磨機(jī)研磨好后，利用植物 DNA提取試劑盒提取DNA ;
[0011] (2)PCR擴(kuò)增：利用25μ1的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物為Ιμ?、模板為Ιμ?、 Tap 酶為 0· 3 μ 1、DNTP 為 2 μ 1、Buffer 為 2. 5 μ 1、Mg2+為 2 μ 1、雙蒸水為 15. 2 μ 1，總計(jì)為 25 μ I ;
[0012] 反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)變性5min，再按95°C變性30s、55°C復(fù)性50s、72°C延伸60s， 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min ;
[0013] (3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：使用3%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳電壓120V，電泳使用TBE緩 沖液，使用EB替代核酸染料檢測(cè)；
[0014] (4)電泳條帶分析：使用凝膠成像系統(tǒng)，分析不同品種擴(kuò)增條帶，耐旱品種會(huì)擴(kuò)增 出約400bp大小的條帶，而干旱敏感品種沒有該條帶；由此分辨品種耐旱性。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 通過本發(fā)明應(yīng)用在水稻耐旱品種篩選上，可以快速準(zhǔn)確的篩選出耐旱品種，減少 耐旱品種篩選工作量，避免環(huán)境因素和人為失誤造成的篩選偏差，在耐旱生廣和耐旱機(jī)理 研宄中有非常廣泛的實(shí)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下是一種使用水稻snoRNA基因的分子標(biāo)記篩選耐旱品種方法，其具體實(shí)施步 驟如下：
[0018] 1、引物設(shè)計(jì)
[0019] 依據(jù)Oryza sativa Z257snoRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列：
[0020] 正向引物：5 ' CACCCGTTTCAACTCCACGC3 '，
[0021] 反向引物 5' TCAGGGCGAAGACTGGATGG3 '
[0022] 2、PCR反應(yīng)體系
[0023] 25 μ 1的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物為1 μ 1、模板為1 μ l、Tap酶為0· 3 μ 1、DNTP 為 2 μ 1、Buffer 為 2· 5 μ 1、Mg2+為 2 μ 1、雙蒸水為 15. 2 μ 1，總計(jì)為 25 μ I。
[0024] 循環(huán)參數(shù)為95°0預(yù)變性51^11，再按95°0變性3〇8、55°0復(fù)性5〇8、72°0延伸6〇8,35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。
[0025] 3.檢測(cè)實(shí)例
[0026] (1)干旱處理
[0027] 取河沙和土壤烘干后（烘干溫度120 °C，烘4個(gè)小時(shí)）稱重，每個(gè)培養(yǎng)皿（直徑8. 5 厘米，高3厘米）按河沙：土壤=3 : 1的重量比裝120克沙土混合物；選擇籽粒飽滿，健 康的種子，每個(gè)培養(yǎng)皿播一個(gè)水稻品種的種子100粒。對(duì)播種后的培養(yǎng)皿稱重，加水，培養(yǎng) 于人工氣候箱，培養(yǎng)20天至3葉1心期開始使用PEG-6000處理模擬干旱，PEG濃度為20% (體積重量比，加入PEG的多少通過計(jì)算處理開始的預(yù)期時(shí)間時(shí)的每個(gè)培養(yǎng)皿含水量，調(diào)整 配制PEG溶液水的數(shù)量，從而保證每個(gè)培養(yǎng)皿中的PEG最終濃度為20 % );自加入PEG溶液 開始為干旱處理起始，記錄不同品種葉片出現(xiàn)卷葉時(shí)間，同時(shí)測(cè)量出現(xiàn)卷葉現(xiàn)象的品種根 系指標(biāo)（根體積、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、側(cè)根長(zhǎng)、根數(shù)量、根壓），利用根系指標(biāo)，結(jié)合卷葉出現(xiàn)時(shí)間判斷 品種耐旱性；每個(gè)品種重復(fù)3次。
[0028] (2)干旱處理效果
[0029] 土壤干旱-PEG干旱處理分析結(jié)果表明，不同基因型水稻耐旱性存在顯著差異，這 為使用DNA分子標(biāo)記選擇耐旱品種奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)利用這種干旱處理方法篩選出的不同 基因型水稻品種耐旱性的差異，可以驗(yàn)證使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記是否可靠。
[0030] ⑶DNA提取
[0031] 在不同水稻品種干旱處理的同時(shí)，剪取未干旱處理的水稻品種的葉片，使用組織 研磨機(jī)研磨好后，利用植物DNA提取試劑盒提取DNA。
[0032] (4) PCR 擴(kuò)增
[0033] 利用反應(yīng)體系為25微升的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物為1 μ 1、模板為1 μ 1、 Tap 酶為 0· 3 μ 1、DNTP 為 2 μ 1、Buffer 為 2. 5 μ 1、Mg2+為 2 μ 1、雙蒸水為 15. 2 μ 1，總計(jì)為 25 μ 1〇
[0034] 反應(yīng)參數(shù)為：
[0035] 95°〇預(yù)變性5!1^11，再按95°〇變性3〇8、55°〇復(fù)性5〇8、72°〇延伸6〇8,35個(gè)循環(huán)， 72°C 延伸 5min。
[0036] (5)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)
[0037] 使用3 %的瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳電壓120V，電泳使用TBE緩沖液，使用EB替代核 酸染料檢測(cè)。
[0038] (6)DNA分子標(biāo)記與干旱處理篩選耐旱品種比較
[0039] 試驗(yàn)結(jié)果表明，DNA分子標(biāo)記檢測(cè)的耐旱品種與土壤干旱處理篩選出的耐旱品種 一致，說明利用Oryza sativa Z257snoRNA基因的分子標(biāo)記來進(jìn)行耐旱性篩選是可行的。
[0040] 利用上述DNA分子標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確的篩選耐旱品種，具體表現(xiàn)為耐旱品種該標(biāo) 記進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)會(huì)擴(kuò)增出一條清晰的條帶，而干旱敏感品種使用該標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)未見該條 帶，由此分辨品種是否耐旱。
[0041] 以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明 的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于篩選水稻耐旱品種的snoRNA基因分子標(biāo)記的引物，其特征在于：所述引物是具 有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的反 向引物。
2. 如權(quán)利要求1所述引物制備用于篩選水稻耐旱品種的分子標(biāo)記的方法，其特征在于 包括以下步驟： (1) DNA的提?。杭羧∷酒贩N的新鮮葉片，使用組織研磨機(jī)研磨好后，利用植物DNA提 取試劑盒提取DNA ; (2) PCR擴(kuò)增：利用25 μ 1的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物為1 μ 1、模板為1 μ l、Tap酶 為 0· 3 μ 1、DNTP 為 2 μ l、Buffer 為 2. 5 μ l、Mg2+為 2 μ 1、雙蒸水為 15. 2 μ 1，總計(jì)為 25 μ 1 ; 反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)變性5min，再按95°C變性30s、55°C復(fù)性50s、72°C延伸60s，35個(gè) 循環(huán)，72°C延伸5min ; (3) 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：使用3%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳電壓120V，電泳使用TBE緩沖液， 使用EB替代核酸染料檢測(cè)； (4) 電泳條帶分析：使用凝膠成像系統(tǒng)，分析不同品種擴(kuò)增條帶，耐旱品種會(huì)擴(kuò)增出約 400bp大小的條帶，而干旱敏感品種沒有該條帶；由此分辨品種耐旱性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于篩選水稻耐旱品種的snoRNA基因分子標(biāo)記的引物，引物是具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的反向引物。本發(fā)明通過利用上述分子標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確的篩選耐旱品種，具體表現(xiàn)為耐旱品種該標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)會(huì)擴(kuò)增出一條清晰的條帶，而干旱敏感品種使用該標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)未見該條帶，由此分辨品種是否耐旱，該標(biāo)記篩選結(jié)果與干旱處理后篩選的耐旱品種是一致的，由此可知，該標(biāo)記篩選耐旱品種有效。利用該標(biāo)記篩選耐旱品種可以大大縮短篩選的時(shí)間，簡(jiǎn)化篩選的步驟，提高篩選效率。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104561363
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510058956
【發(fā)明人】馬廷臣, 李澤福, 夏加發(fā), 王元壘, 周坤能
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日