一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)廢棄物回收利用領(lǐng)域，及微生物領(lǐng)域。具體涉及一種利用干酪乳 桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘蔗糖蜜是制糖廠以甘蔗為原料，經(jīng)過壓榨，蔗汁澄清凈化，過濾處理后，蒸發(fā)濃 縮、結(jié)晶制糖后分離出來的深棕色、粘稠狀副產(chǎn)物，俗稱桔水。其產(chǎn)量為原料甘蔗的2. 5%? 3.0%。其總糖含量約為50%，錘度大于60°Bx。甘蔗糖蜜含有水分、糖分、非糖有機(jī)物、蛋 白質(zhì)、維生素及微量元素等多種可利用成分。其中糖分主要是蔗糖、葡萄糖、果糖。由于其 糖分所占比例很大，所以有充足的碳源可以供微生物利用，轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸及醇類等物質(zhì)。甘 蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的優(yōu)勢--首先可以降低生產(chǎn)成本；其次，可以充分利用自然資源，回 收利用工業(yè)廢棄物；再次，可有效提高糖廠的經(jīng)濟(jì)效益。因此合理利用制糖廠廢棄糖蜜有很 重要的意義。
[0003] 干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬（Lactobacillus)，是革蘭氏 陽性菌，不產(chǎn)芽孢。它是對(duì)營養(yǎng)非常挑剔，對(duì)發(fā)酵條件要求嚴(yán)格，以生產(chǎn)乳酸為主要代謝終 產(chǎn)物的細(xì)菌。干酪乳桿菌作為益生菌通常被用來生產(chǎn)發(fā)酵類食品。然而，近年來的研究發(fā) 現(xiàn)它具有一個(gè)巨大潛力--可以生產(chǎn)有廣泛用途的生物燃料及其副產(chǎn)物。通常其糖代謝終 產(chǎn)物傾向于轉(zhuǎn)化為乳酸；然而一些乳酸菌具有異型發(fā)酵的能力，在乳酸菌碳水化合物代謝 相關(guān)酶的作用下，可以使丙酮酸向乙醇轉(zhuǎn)化。另外，乳酸菌具有一定的耐酸性，可以在較低 pH值條件下生長，并且很多菌株能夠耐受乙醇。因此，乳酸菌是具有發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)乙醇的潛 力的。
[0004] 目前，發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)工業(yè)乙醇的方法是利用酵母菌，但常用釀酒酵母因其只能代 謝葡萄糖而不能直接代謝木糖，使糖蜜中糖類利用率較低。而乳酸菌在碳水化合物代謝上 具有一定的優(yōu)勢一許多乳酸菌能夠發(fā)酵從水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中釋放出來的葡萄糖 和木糖等糖類。糖蜜是植物來源工業(yè)廢料，含有一定的木質(zhì)纖維素，木質(zhì)纖維素中木糖占 總糖質(zhì)量的10%?40%，對(duì)其充分利用，可提高乙醇產(chǎn)量，提高糖蜜利用率，降低酒精發(fā)酵 廢液對(duì)環(huán)境的污染。但是目前沒有一種有效的方法能夠利用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)產(chǎn)乙醇，并大幅度提高乙醇產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法。 該方法能夠提高發(fā)酵速率，提高糖蜜中碳水化合物的利用率，降低糖蜜酒精發(fā)酵廢液的污 染。
[0006] 本發(fā)明的一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，它是按照以下 步驟進(jìn)行的：
[0007] -、從冷凍保存甘油管中挑取干酪乳桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h;其 中，MRS液體培養(yǎng)基pH= 6. 0 ;
[0008] 二、步驟一培養(yǎng)后的菌株，按濃度1X108CFU/mL接入滅菌的甘蔗糖蜜溶液，37°C培 養(yǎng)24?30h;
[0009] 三、將甘蔗糖蜜發(fā)酵液灌裝到發(fā)酵罐中，密封所有進(jìn)出口，滅菌冷卻，待用；
[0010] 四、步驟二培養(yǎng)后的菌株，按濃度IX108CFU/mL接入步驟三的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)， 設(shè)置自動(dòng)pH恒定系統(tǒng)，使pH值恒定在5. 95?6. 05,磁力攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)置為50?lOOrpm， 向發(fā)酵罐中通入惰性氣體，在發(fā)酵溫度為37°C下發(fā)酵時(shí)間45?50h，然后利用超臨界二氧 化碳技術(shù)從酒精發(fā)酵液中提取乙醇，即完成所述的利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè) 乙醇；
[0011] 其中，所述的甘蔗糖蜜發(fā)酵液配方為：1L的糖錘度為4?6°Bx的甘蔗糖蜜溶液 加入10.Og蛋白胨、10.Og牛肉膏和5.Og酵母膏，甘蔗糖蜜發(fā)酵液pH值為6. 0。
[0012] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0013] 本發(fā)明的糖蜜發(fā)酵液能夠使菌株提前適應(yīng)糖蜜發(fā)酵的環(huán)境，以達(dá)到發(fā)酵的最佳效 果。
[0014] 適應(yīng)性反應(yīng)是乳酸菌應(yīng)激保護(hù)作用的常見方式。當(dāng)細(xì)胞生長環(huán)境突然發(fā)生改變， 細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)時(shí)，生長狀態(tài)和功能會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。所以，在細(xì)胞活化增殖期，讓細(xì)胞提 前適應(yīng)糖蜜環(huán)境，有助于在生產(chǎn)中，維持細(xì)胞生長的穩(wěn)定性。在MRS中活化增殖后，直接接 入糖蜜中，細(xì)胞生長緩慢，約36h進(jìn)入穩(wěn)定期，而且細(xì)胞濃度低于101(lCFU/mL;而經(jīng)過MRS活 化，糖蜜增殖培養(yǎng)后，接入糖蜜中的細(xì)胞生長約在28?32h達(dá)到穩(wěn)定期，且細(xì)胞濃度高于 10nCFU/mL。
[0015] 本發(fā)明的糖蜜發(fā)酵液濃度，為最適干酪乳桿菌發(fā)酵生成高濃度乙醇的最低糖蜜濃 度。干酪乳桿菌在發(fā)酵46?52h后，進(jìn)入衰退期，且菌株將糖蜜發(fā)酵液中碳水化合物利用 完全。
[0016] 由于糖蜜濃度對(duì)應(yīng)溶液中碳水化合物的濃度，其對(duì)菌株的生長情況及其編碼碳源 代謝的相關(guān)基因的啟動(dòng)有很大影響，因此糖蜜濃度直接影響發(fā)酵產(chǎn)物的種類與濃度。過高 濃度的糖蜜溶液，會(huì)造成高滲透壓抑制菌株生長，且浪費(fèi)原料，提高成本，污染環(huán)境；而過低 濃度又會(huì)造成碳源不足，發(fā)酵產(chǎn)出率低等問題；不同濃度的糖蜜溶液發(fā)酵生成乙醇的產(chǎn)出 率也是不同的。當(dāng)糖錘度超過40°Bx的時(shí)候，干酪乳桿菌無法生長；在10°Bx及20°Bx 的糖蜜溶液中，干酪乳桿菌長勢良好，但糖蜜中蔗糖幾乎沒有利用，剩余溶液中糖濃度過 大；5°Bx的糖蜜溶液發(fā)酵50h，三種碳源幾乎完全被利用，且三種主產(chǎn)物中乙醇濃度最高。
[0017] 本發(fā)明的在無氧條件下，干酪乳桿菌利用糖蜜發(fā)酵生成乙醇的產(chǎn)出率最高。
[0018] 干酪乳桿菌的碳源代謝途徑比較豐富，有氧條件下，其代謝產(chǎn)物以乙酸為主；而無 氧條件下，其代謝產(chǎn)物更傾向于生成乙醇。
[0019] 本發(fā)明的干酪乳桿菌利用甘蔗糖蜜發(fā)酵中，pH值設(shè)置為恒定6. 0,乙醇產(chǎn)出率能 夠達(dá)到最商。
[0020] 干酪乳桿菌在pH值為6. 0的糖蜜溶液中，生長情況最優(yōu)，細(xì)胞濃度可以達(dá)到 1012CFU/mL以上。由于干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中生成甲酸、乙酸、琥珀酸等有機(jī)酸副產(chǎn)物， 會(huì)使pH值逐漸降低，從而影響干酪乳桿菌的細(xì)胞生長，因此利用自動(dòng)加樣泵加入堿液NaOH 溶液來中和酸類副產(chǎn)物，使發(fā)酵液pH值始終維持在6.0,可以避免由于酸度提高抑制菌株 生長。
[0021] 本發(fā)明利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)工業(yè)乙醇的方法，可以使乙醇產(chǎn)出濃度 大于1 %。
【附圖說明】
[0022] 圖1為采用實(shí)施例一的方法干酪乳桿菌利用甘蔗糖蜜合成乙醇的示意圖；其中，
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，其特征在于它是按照以下 步驟進(jìn)行的： 一、從冷凍保存甘油管中挑取干酪乳桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h;其中， MRS液體培養(yǎng)基pH = 6. 0 ; 二、 步驟一培養(yǎng)后的菌株，按濃度1 X 108CFU/mL接入滅菌的甘蔗糖蜜溶液，37°C培養(yǎng) 24 ?30h ; 三、 將甘蔗糖蜜發(fā)酵液灌裝到發(fā)酵罐中，密封所有進(jìn)出口，滅菌冷卻，待用； 四、 步驟二培養(yǎng)后的菌株，按濃度1 X 108CFU/mL接入步驟三的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，設(shè)置 自動(dòng)pH恒定系統(tǒng)，使pH值恒定在5. 95?6. 05,磁力攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)置為50?lOOrpm，向 發(fā)酵罐中通入惰性氣體，在發(fā)酵溫度為37°C下發(fā)酵時(shí)間45?50h，然后利用超臨界二氧化 碳技術(shù)從酒精發(fā)酵液中提取乙醇，即完成所述的利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙 醇； 其中，所述的甘蔗糖蜜發(fā)酵液配方為：1L的糖錘度為4?6° Bx的甘蔗糖蜜溶液加入 10. 〇g蛋白胨、10. 〇g牛肉膏和5. 0g酵母膏，甘蔗糖蜜發(fā)酵液pH值為6. 0。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，其特征在 于采用NaOH溶液和HC1溶液調(diào)節(jié)糖蜜發(fā)酵液pH值至6. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，其特征在 于使pH值恒定所用堿液為NaOH溶液，酸液為HC1溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，其特征 在于糖錘度為4?6° Bx的甘蔗糖蜜溶液是由冷藏貯存的應(yīng)季糖蜜稀釋至糖錘度為4? 6° Bx而成的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，其特征在 于1L的MRS液體培養(yǎng)基配方為：10. 0g的蛋白胨、10. 0g的牛肉膏、5. 0g的酵母膏、20. 0g的 葡萄糖、5. 0g的乙酸鈉、2. 0g的檸檬酸二胺、2. 0g的磷酸氫二鉀、0. 2g的七水硫酸鎂、0. 05g 的七水硫酸錳和1. 〇g的吐溫80, MRS液體培養(yǎng)基pH = 6. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，其特征在 于步驟二中滅菌的甘蔗糖蜜溶液的糖錘度為4?6° Bx。
【專利摘要】一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法，它涉及一種利用干酪乳桿菌發(fā)酵甘蔗糖蜜制備工業(yè)乙醇的方法。本發(fā)明的方法為：甘蔗糖蜜糖錘度稀釋至5°BX，加入干酪乳桿菌生長必需氮源，調(diào)節(jié)pH值至6.0。灌裝入發(fā)酵罐并密封，滅菌冷卻后，接入1×108CFU/mL濃度干酪乳桿菌。發(fā)酵罐恒定pH值6.0，磁力攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)定100rpm，通入惰性氣體保持無氧發(fā)酵環(huán)境，37℃發(fā)酵48h。本發(fā)明的方法能夠提高發(fā)酵速率，提高糖蜜中碳水化合物的利用率，降低糖蜜酒精發(fā)酵廢液的污染。
【IPC分類】C12P7-06, C12R1-245
【公開號(hào)】CN104531778
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510019244
【發(fā)明人】王松, 張柏林, 趙宏飛, 周方
【申請(qǐng)人】北京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月14日