一種蛇毒抗栓酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種從蛇毒中制備蛇毒抗栓酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛇毒抗栓酶的主要成分是精氨酸酯酶等抗凝成分，它具有抗凝、去纖、降脂、溶栓、擴張血管等多種功能，適用于腦血栓、血栓閉塞性脈管炎等常見的缺血性疾病。
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種從蛇毒中制取蛇毒抗栓酶的簡便方法，縮短制取周期，增加每克蛇毒制取蛇毒抗栓酶的量，并使該藥物毒性低療效高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供從蛇毒中提取蛇毒抗栓酶的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將蛇毒干粉經(jīng)離子交換層析、凝膠過濾純化和冷凍干燥得到取蛇毒抗栓酶精品，包括如下步驟:
(1)蛇毒干粉用pH 7.0 ?9.0 的含 0.1 ?0.5mol/L NaCl.0.01 ?0.05 mol/L EDTA的Tris-HCl緩沖液溶解，離心去沉淀，得上清液；
(2)離子交換層析:取上述緩沖液上樣于DEAE-SepharoseFast Flow柱后，用pH
7.0 ?9.0 含 0.01 ?0.20mol/L NaCl 的 Tris-HCl 的平衡液沖洗至 0D〈0.1，換用 pH 7.0 ?9.0含0.1?0.5mol/L NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫，紫外檢測，收集酶活性部分，超濾濃縮；
(3)凝膠過濾層析:將上述濃縮液上樣于SepharcylS-200凝膠柱，用pH 7.0?9.0含
0.01?0.20mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液，紫外檢測儀檢測并記錄，洗脫酶活性峰，超濾后冷凍干燥，即得成品。
【具體實施方式】
[0006]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于實施例表述的范圍。
[0007]實施例1
1)蛇毒干粉的溶解
取蛇毒干粉 50g,溶于 1500ml pH 8.5 含 0.2mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA 的Tris-HCl緩沖液中，于4°C冰箱中放置過夜，1000rpm離心8min,去除不溶物，得蛇毒上清液；
2)離子交換層析
2.1)將上述上清液上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱，用 ρΗ7.5 含 0.10mol/LNaCl的Tris-HCl的平衡液沖洗至0D〈0.1 ；
2.2)換用pH 7.5含0.20 mol/L NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫，紫外檢測，收集酶活性部分； 2.3)用超濾器(3KD膜)超濾濃縮至約100ml。
[0008]3)凝膠過濾層析
3.1)將上述濃縮液上樣于Sepharcyl S-200凝膠柱。
[0009]3.2)用 pH 7.2 含 0.1OmoI/L NaCl 的 Tris-HCl 緩沖液洗脫，流速為 lml/min。
[0010]3.3)用紫外檢測儀檢測并記錄，洗脫酶活性峰。
[0011]3.4)超濾(3KD)脫鹽后再進小型凍干機冷凍干燥，即得成品。
[0012]實施例2
1)蛇毒干粉的溶解
取蛇毒干粉 50g,溶于 1500ml pH 8.8 含 0.15mol/L NaCl、0.0lmol/L EDTA 的Tris-HCl緩沖液中，于4°C冰箱中放置過夜，1000rpm離心8min,去除不溶物，得蛇毒上清液；
2)離子交換層析
2.1)將上述上清液上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱，用 ρΗ7.2 含 0.15mol/LNaCl的Tris-HCl的平衡液沖洗至0D〈0.1 ；
2.2)換用pH 7.2含0.15 mol/L NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫，紫外檢測，收集酶活性部分；
2.3)用超濾器(3KD膜)超濾濃縮至約100ml。
[0013]3)凝膠過濾層析
3.1)將上述濃縮液上樣于Sepharcyl S-200凝膠柱。
[0014]3.2)用 pH 7.0 含 0.05mol/L NaCl 的 Tris-HCl 緩沖液洗脫，流速為 lml/min。
[0015]3.3)用紫外檢測儀檢測并記錄，洗脫酶活性峰。
[0016]3.4)超濾(3KD)脫鹽后再進小型凍干機冷凍干燥，即得成品。
[0017]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種從蛇毒中提取蛇毒抗栓酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)蛇毒干粉用含NaCl、EDTA的Tris-HCl緩沖液溶解，離心去沉淀，得上清液； (2)離子交換層析:將上述上清液，上樣于DEAE-SepharoseFast Flow柱，用含NaCl的Tris-HCl平衡液沖洗，換用含不同濃度NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫； 紫外檢測，收集酶活性部分，超濾濃縮； (3)凝膠過濾層析:將上述濃縮液上樣于SepharcylS-200凝膠柱，用含NaCl的Tris-HCl緩沖液平衡，紫外檢測儀檢測并記錄，洗脫酶活性峰，超濾后冷凍干燥，即得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒抗栓酶的方法，其特征在于所述步驟(I)中所述的緩沖液是pH 7.0?9.0的含0.1?0.5mol/L NaCl.0.01?0.05 mol/L EDTA的Tris-HCl緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒抗栓酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中所述平衡液是pH 7.0?9.0含0.01?0.20mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒抗栓酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中所述洗脫液用pH 7.0?9.0含0.1?0.5mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒抗栓酶的方法，其特征在于所述步驟(4)中所述平衡液是pH 7.0?9.0含0.01?0.20mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蛇毒抗栓酶的制備方法。其特征在于包含以下步驟：蛇毒干粉的溶解、離子交換層析、凝膠過濾純化和冷凍干燥以得到降纖酶成品。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點在于本發(fā)明采用多次層析能有效去除雜質(zhì)，提高蛇毒抗栓酶的純度，進而以較高的收率獲得純度高、活性好的蛇毒抗栓酶，大大提高了產(chǎn)品的市場競爭力。
【IPC分類】A61P7-02, C12N9-18, A61P9-14, A61P9-10
【公開號】CN104531631
【申請?zhí)枴緾N201410807768
【發(fā)明人】劉冠男, 于曉娜, 孫延年
【申請人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月23日