緩釋組分培養(yǎng)免疫細胞方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種緩釋組分培養(yǎng)免疫細胞方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
經(jīng)典的CIK細胞培養(yǎng)方法需要通過多種細胞因子的共同培養(yǎng)誘導，如白細胞介素2、干擾素、抗CD3單克隆抗體等，傳統(tǒng)方法是將這些細胞因子直接加入細胞培養(yǎng)基中，但是細胞因子在培養(yǎng)基中濃度減少較快，需要每天添加細胞因子，工作效率低，且影響細胞增殖速率。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種緩釋組分培養(yǎng)免疫細胞方法。
[0004]上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn):
一種緩釋組分培養(yǎng)免疫細胞方法，將采集分離得到的外周血單個核細胞與含15%胎牛血清的DMEM—起置于包被有重組人纖維連接片斷的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至第2日，加入各細胞因子微球100(^8/1111、抗0)3單克隆抗體2 4 8/1111、白細胞介素2 1000 yg/ml;放入37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且培養(yǎng)過程中調(diào)整細胞密度為0.5X 10 6-l.5XlOVmlο之后每3天更換培養(yǎng)基，每7天添加細胞因子微球至培養(yǎng)至第14天，細胞成熟。
[0005]培養(yǎng)時大約每_升培養(yǎng)基中含7 μ I PLGA微球制備液(每微升制備液中含有1000個微球)。PLGA微球10-50 μ m，包含0.5%細胞因子(活性劑)，3% Mg(OH) 2 (PH穩(wěn)定劑)，肝素(生長因子穩(wěn)定劑):細胞因子重量比=1:1，I mM EDTA。
[0006]有益效果:
1.本發(fā)明應用乳化溶劑蒸發(fā)法制作PLGA (聚乳酸-羥基乙酸共聚物)微球，含有PLGA及PVA (聚乙烯醇)，PVA為穩(wěn)定劑或乳化劑。根據(jù)微球大小不同PVA含量不同，釋放曲線不同。PLGA微球尺寸10-40 μ m，平均直徑為20 μ m，尺寸可由攪拌速度不同控制。
[0007]本發(fā)明將細胞因子(白細胞介素2、干擾素、抗CD3單克隆抗體)加入微囊或微球中，應用其緩釋特性使生長因子在培養(yǎng)基中能夠持續(xù)平穩(wěn)、釋放，節(jié)省成本、提高工作效率、使免疫細胞平穩(wěn)擴增。
[0008]本發(fā)明緩釋組分可使用多種，如:微球(PLGA微球)、無水聚乙烯醇(PVA)、納米泵、藻酸鹽凝膠、生物可降解水凝膠、脂質(zhì)體、絡合劑、持續(xù)釋放微泵、納米微粒、其它生物相容性材料。
[0009]【附圖說明】:
附圖1是本發(fā)明為在培養(yǎng)基中添加含細胞因子的常規(guī)培養(yǎng)基后，IL-2濃度在培養(yǎng)基中隨時間的變化百分比。
[0010]附圖2是本發(fā)明比較在培養(yǎng)基中直接加入IL-2細胞因子及加入IL-2微球后，IL-2濃度在培養(yǎng)基中隨時間變化的百分比。
[0011]附圖3是本發(fā)明比較在培養(yǎng)基中直接加入細胞因子及加入IL-2、IFN-γ、⑶3McAb微球后，CIK細胞集落形成情況。
[0012]【具體實施方式】: 實施例1:
一種緩釋組分培養(yǎng)免疫細胞方法，將采集分離得到的外周血單個核細胞與含15%胎牛血清的DMEM—起置于包被有重組人纖維連接片斷的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至第2日，加入各細胞因子微球100(^8/1111、抗0)3單克隆抗體2 4 8/1111、白細胞介素2 1000 yg/ml;放入37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且培養(yǎng)過程中調(diào)整細胞密度為0.5 X 16-L 5 XlOfVml。之后每3天更換培養(yǎng)基，每7天添加細胞因子微球至培養(yǎng)至第14天，細胞成熟。
[0013]實施例2:
本發(fā)明應用乳化溶劑蒸發(fā)法制作PLGA (聚乳酸-羥基乙酸共聚物)微球，含有PLGA及PVA (聚乙烯醇)，PVA為穩(wěn)定劑或乳化劑。
[0014]根據(jù)微球大小不同PVA含量不同，釋放曲線不同。PLGA微球尺寸10-40 μπι,平均直徑為20 μm，尺寸可由攪拌速度不同控制。培養(yǎng)時大約每_升培養(yǎng)基中含7 μ I PLGA微球制備液(每微升制備液中含有1000個微球)。PLGA微球10-50 μ m，包含0.5%細胞因子(活性劑)，3% Mg (OH) 2 (PH穩(wěn)定劑)，肝素(生長因子穩(wěn)定劑):細胞因子重量比=1:1，
I mM EDTA。
【主權(quán)項】
1.一種緩釋組分培養(yǎng)免疫細胞方法，其特征是:將采集分離得到的外周血單個核細胞與含15%胎牛血清的DMEM—起置于包被有重組人纖維連接片斷的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至第2日，加入各細胞因子微球1000 μ g/ml、抗⑶3單克隆抗體2 μ g/ml、白細胞介素2 1000 μ g/ml ?’放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且培養(yǎng)過程中調(diào)整細胞密度為0.5X 16-L 5X 16/ml，之后每3天更換培養(yǎng)基，每7天向培養(yǎng)基中添加細胞因子微球，培養(yǎng)至第14天，細胞成熟。
【專利摘要】緩釋組分培養(yǎng)免疫細胞方法。傳統(tǒng)方法是將這些細胞因子直接加入細胞培養(yǎng)基中，但是細胞因子在培養(yǎng)基中濃度減少較快，需要每天添加細胞因子，工作效率低，且影響細胞增殖速率。 本發(fā)明方法包括：將采集分離得到的外周血單個核細胞與含 15 ％胎牛血清的 DMEM 一起置于包被有重組人纖維連接片斷的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至第 2 日，加入各細胞因子微球 1000μg/ml 、抗 CD3 單克隆抗體 2μg/ml 、白細胞介素 2 1000μg/ml ；放入 37 ℃、 5 ％ CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且培養(yǎng)過程中調(diào)整細胞密度為 0.5×106-1.5×106/ml ；之后每 3 天更換培養(yǎng)基，每 7 天 向培養(yǎng)基中添加細胞因子微球，培養(yǎng)至第 14 天，細胞成熟。 本發(fā)明用于 培養(yǎng)免疫細胞 。
【IPC分類】C12N5-078
【公開號】CN104531616
【申請?zhí)枴緾N201410813001
【發(fā)明人】徐霜, 宋云慶, 欒志偉, 張陽
【申請人】哈爾濱壹加壹再生醫(yī)學科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月24日