專利名稱：角質(zhì)酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種角質(zhì)酶變體，更明確的說，本發(fā)明涉及一種提高了熱穩(wěn)定性的角質(zhì)酶變體。本發(fā)明也涉及編碼此變體的DNA序列，含有此DNA序列的載體，轉(zhuǎn)化后的含有此DNA序列或載體的宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)這種變體的方法，和這種變體的用途。
背景技術(shù)：
角質(zhì)酶是一種分解脂肪的酶，它可以水解角質(zhì)。已知多種真菌中均含有角質(zhì)酶(參見P.E.Kolattukudy的“脂肪酶”一文，Ed.B.Borgstrm和H.L.Brockman，Elsevier，1984年，第471-504頁)。有文獻(xiàn)描述豌豆茄病鐮孢中角質(zhì)酶的氨基酸序列和晶體結(jié)構(gòu)(S.Longhi等，分子生物學(xué)雜志，268(4)，779-799(1997))。Humicola insolens中角質(zhì)酶的氨基酸序列也已被公開(美國專利5,827,719)。
豌豆茄病鐮孢中角質(zhì)酶的一些變體也已被公開WO 94/14963；WO94/14964；《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》64，2794-2799，1998；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和遺傳學(xué)26，442-458，1996；計(jì)算機(jī)化學(xué)雜志17，1783-1803，1996；蛋白質(zhì)工程6，157-165，1993；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和遺傳學(xué)33，253-264，1998；生物技術(shù)雜志66，11-26，1998；生物化學(xué)35，398-410，1996。
真菌角質(zhì)酶可以用來酶性水解聚(對苯二甲酸亞乙酯)的環(huán)狀低聚物，例如用在以聚(對苯二甲酸亞乙酯)纖維涂飾紗線或織物的方法中(WO97/27237)。然而，亟需增進(jìn)已知真菌角質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性而獲得更高的操作溫度。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)真菌角質(zhì)酶的某些變體具有更好的熱穩(wěn)定性。
即，本發(fā)明提供了一種親代真菌角質(zhì)酶的變體，其是親代真菌角質(zhì)酶在以下位置的一個或多個氨基酸殘基被取代后的產(chǎn)物。
a)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或
b)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)。
本發(fā)明還提供了編碼此變體的DNA序列，含有此DNA序列的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化后的含有此DNA序列或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)這種變體的方法，使用此變體的方法，和一種含有此變體的去污劑組合物。
附圖簡述

圖1給出了H.insolens角質(zhì)酶三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)。
圖2顯示了豌豆茄病鐮孢(左)和H.insolens(右)的角質(zhì)酶三維結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型。圖中使用了不同的顏色以區(qū)分N末端氨基酸和圍繞其的直徑為12和17的區(qū)域。
圖3-6顯示了c3ET的水解過程。細(xì)節(jié)參見實(shí)施例。
發(fā)明詳述真菌角質(zhì)酶親代角質(zhì)酶是一種真菌角質(zhì)酶，例如一種絲狀真菌角質(zhì)酶，其為腐質(zhì)霉或鐮孢霉菌株所固有，尤其H.insolens或豌豆茄病鐮孢，更尤其H.insoensDSM 1800株。
H.insolens DSM 1800的角質(zhì)酶的氨基酸序列和編碼其的DNA序列由美國專利5,827,719中SEQ ID NO2和SEQ ID NO1表示。這里使用于H.insolens角質(zhì)酶的編號系統(tǒng)是基于其成熟肽，如SEQ IDNO2所示。
豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶的氨基酸序列由WO 94/14964中圖1D的成熟肽表示。文中使用于豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶的編號系統(tǒng)與使用在WO 94/14964中所用編號系統(tǒng)相同；它含有如圖1D所示的蛋白質(zhì)序列；因此成熟的角質(zhì)酶是在16-214位點(diǎn)之間。
母體角質(zhì)酶的氨基酸序列可至少50％(尤其至少70％或至少80％)同源于H.insolens DSM 1800的角質(zhì)酶。母體角質(zhì)酶可具體為與H.insolens DSM1800的角質(zhì)酶相匹配的酶。
氨基酸及其改變的命名法說明書和權(quán)利要求書均以單一字母代碼表示氨基酸。在某一序列中的特定氨基酸由其單一字母代碼和其位置表示，舉例來說，Q1代表Gln(在位置1的谷氨酰胺，即位于N末端)。
文中用于定義取代的命名法基本與WO 92/05249中的描述一致。因此，R51P代表在位置51由P(脯氨酸，Pro)取代R(精氨酸，Arg)。
同源性和比對為了本發(fā)明的目的，宜參照Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學(xué)雜志，48，433-45所述方法確定同源程度，并以下列設(shè)置用于多肽序列比對GAP生成罰分3.0，GAP延伸罰分0.1。同源性的確定可使用已知的計(jì)算機(jī)程序完成，例如GCG軟件包中提供的GAP程序(Wisconsin軟件包程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)。
可按Needleman(出處同上)所述方法使用同樣的參數(shù)對兩個給定的序列進(jìn)行比對。這種比對可以使用GAP程序(出處同上)完成。
角質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)H.insolens角質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)依照所選X射線晶體衍射方法的原理得出，例如在X射線結(jié)構(gòu)測定，Stout，G.K.和Jensen，L.H.，John Wiley&Sons，Inc.NY，1989中所示的原理。使用同晶置換的方法得出的分辨率為2.2的晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)由圖1以標(biāo)準(zhǔn)PDB(蛋白數(shù)據(jù)庫，Brookhaven國家實(shí)驗(yàn)室，Brookhaven，CT)格式給出。
豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)在Martinez等(1992)自然356，615-618有描述。豌豆茄病鐮孢和H.insolens角質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)用圖2中的計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行比較。
應(yīng)該注意到真菌角質(zhì)酶的總體三維結(jié)構(gòu)非常相似，并且X射線衍射顯示具有高度同源性。在圖2所示的計(jì)算機(jī)模型中可以清楚的看出豌豆茄病鐮孢和H.insolens角質(zhì)酶的相似性。因此，對一種真菌角質(zhì)酶的修飾對其他真菌角質(zhì)酶將同樣有效。
近N末端取代本發(fā)明的變體在N末端附近有一個或多個氨基酸取代。取代發(fā)生在距離N末端的17內(nèi)(例如在12以內(nèi))和/或在20個位置以內(nèi)(例如在15個位置以內(nèi))。與N末端的距離由晶體結(jié)構(gòu)(即X射線結(jié)構(gòu)中可見的結(jié)構(gòu))中氨基酸的α碳原子之間的距離計(jì)算得到。
在H.insolens DSM 1800的角質(zhì)酶中，N末端的兩個氨基酸(Q1和L2即分別在位置1和位置2的谷氨酰胺和亮氨酸)在X射線結(jié)構(gòu)中不可見，因此所述距離從氨基酸G3開始計(jì)算。在17距離內(nèi)的氨基酸包括以下位置，3-12，18，20-60，62-64，82，85-86，100-108，110-111，130-132，174，176-182，184-185，188，和192。在12距離內(nèi)的氨基酸包括以下位置，3-8，22-27，30-47，53-59，102，177，和180-181。
在豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶中，N末端氨基酸G17在X射線結(jié)構(gòu)中可見。在17距離內(nèi)的氨基酸包括以下位置，17-26，34-75，77-79，101，115，117-119，147，191-197，199-200，和203。在12距離內(nèi)的氨基酸包括以下位置，17-22，38，40，45-58，60，65，和70-72。
與親代酶相比較，本發(fā)明中的變體增進(jìn)了熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性可以通過DSC(差式掃描熱量法)對變性溫度的測量來確定，如在某實(shí)施例中在pH值8.5以掃描率90k/hr進(jìn)行測量。所述變體的變性溫度至少可比親代酶的變性溫度高出5℃。
在以上區(qū)域中的取代總數(shù)一般為1-10個，例如在以上區(qū)域中有1-5個取代。而且，本發(fā)明中的角質(zhì)酶變體可以選擇性含有對所述親代酶的其它修飾，一般小于或等于10個，例如在以上區(qū)域外有5個或更少的改變(取代，缺失或插入)。因此與親代酶相比較，所述變體的完整氨基酸序列一般有1-20，例如1-10個改變。
溶劑可接近性表面在一個外露的氨基酸殘基，即溶劑可按近性表面的氨基酸殘基中可發(fā)生一個或多個取代。這時(shí)可通過W.Kabsch和C.Sandar，生物多聚體，22(1983)2577-2637頁中所述的方法使用“dssp”程序(1988年10月版)計(jì)算得到。
在H.insolens DSM 1800的角質(zhì)酶中，以下位置的氨基酸殘基位于N末端17距離內(nèi)并且有大于0的溶劑可接近性表面3-12，18，26-33，36-38，40-45，47-56，59-60，62-64，82，85-86，104-105，174，176-179，181-182，192。
特定的取代接近N末端的取代可具體為增加電荷的取代，即以中性或帶正電的氨基酸取代帶負(fù)電的氨基酸，或者以帶正電的氨基酸取代中性氨基酸。因此可以由中性或帶正電的氨基酸，例如R，K，Y，H，Q或N取代H.insolens DSM1800的角質(zhì)酶中E6，E10，E30，E47，D63，E82和/或E179位置的帶負(fù)電的氨基酸殘基。一些特定的取代為E6Q/N，E10Q/N，E47K/R或E179Q/N。同樣，可以由帶正電的氨基酸，例如R，K或H取代H.insolens角質(zhì)酶中N7，S11，N44或N52位置的中性氨基酸。
另一個接近N末端取代的例子是以脯氨基酸殘基取代，例如對應(yīng)于H.insolens DSM 1800的角質(zhì)酶中A14P或R51P的取代。
特定的變體下列是一些H.insolens角質(zhì)酶的變體的實(shí)例。相應(yīng)的變體可以在其他親代角質(zhì)酶的基礎(chǔ)上經(jīng)改造而成。
R51PE6N/Q＋L138IA14P＋E47KE47KE179N/QE6N/Q＋E47K＋R51PA14P＋E47K＋E179N/QE47K＋E179N/QE47K＋D63NE6N/Q＋E10N/Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E179N/QE6N/Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E179N/QQ1P＋L2V＋S11C＋N15T＋F24Y＋L46I＋E47K角質(zhì)酶變體的用途本發(fā)明涉及的角質(zhì)酶變體可以用來酶性水解聚(對苯二甲酸亞乙酯)的環(huán)狀低聚物，例如環(huán)狀三(對苯二甲酸亞乙酯)，縮寫為c3ET。
特別地，使用本發(fā)明的角質(zhì)酶處理含聚酯的紗線或織物可以去除紗線或織物中的此類環(huán)狀低聚物，在此處理步驟后可選擇以pH約7-11的水溶液漂洗所述紗線或織物。對聚酯的處理可以方便地在高于c3ET的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度(約55℃)和低于聚酯的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度(約70℃)下進(jìn)行。因此，此處理方法適于在50-80℃下進(jìn)行，例如在60-75℃。處理方法可與WO 97/27237相似。
所述角質(zhì)酶變體可以用來處理含聚酯的紡織品，例如PET(1，2-亞乙基乙二醇和對苯二酸的聚合物)，P3GT(1，3丙二醇和對苯二酸的聚合物)或者聚酯/棉花的混合物。此處理可使聚酯紡織物具有以下優(yōu)點(diǎn)，例如增加穿著舒適度，增加水的穿透性，減小抗靜電行為，改善手感和柔軟度，改變再沉淀特性和/或顏色凈化。
所述角質(zhì)酶變體可以用來改進(jìn)對含PET的紗線或織物的功能性涂飾，方法是在經(jīng)所述角質(zhì)酶變體處理后以加工劑，例如軟化劑，抗皺樹脂，抗靜電劑，抗污劑或一些用來減弱無皺，持續(xù)壓力，或防火效果的試劑進(jìn)行處理。使用本角質(zhì)酶變體進(jìn)行處理可以增加織物等表面的功能性基團(tuán)的數(shù)目，從而用來吸附功能性涂飾劑。在由Nihon Seni Sentaa KK發(fā)表于1998年10月15日的“SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN”一文中有關(guān)于涂飾劑實(shí)例的描述。
本發(fā)明的角質(zhì)酶變體也可用于去污劑中，加入了這種角質(zhì)酶變體可以增進(jìn)去除脂類污漬的效果，如WO 94/03578和WO 94/14964所述。在衣用洗滌劑中加入這種角質(zhì)酶變體可以減少多次清洗/穿著后積存于衣物上的惡臭。
本角質(zhì)酶變體也可用來降解和回收利用聚酯，例如聚己內(nèi)酯(PCL)，聚1，2-亞乙基乙二醇對苯二酸酯(PET)，聚乳酸，聚亞丁基琥珀酸酯和聚(羥基丁酸)聯(lián)(羥基戊酸)，如膠片和瓶子，見日本平成5年專利申請344897。
本角質(zhì)酶變體也可用于脂肪酶和角質(zhì)酶的其他已知用途，如面包制造業(yè)(見WO 94/04035和EP 585988)，造紙業(yè)(如用于去除松脂，見EP 374700)和皮革、羊毛及相關(guān)產(chǎn)業(yè)(如用于對動物生皮、羊皮或羊毛的脫脂)，以及用于其他有關(guān)脫脂/去脂的用途。可在脂類和油類制造業(yè)中用固定化的所述變體作為有機(jī)合成的催化劑(如用于酯化作用，轉(zhuǎn)酯化作用或脂類水解反應(yīng))。
染色聚酯本發(fā)明提供了一種用于染色聚酯紗線或織物的方法。在該方法中，紗線或織物首先由角質(zhì)酶處理，如在50-70℃或65-70℃，pH7-10處理12-48小時(shí)，然后用染料染色，如反應(yīng)性染料，分散染料或陽離子染料。反應(yīng)性染料可以是與OH或COOH基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的那種，例如可擁有生色團(tuán)-NHPh-SO2CH2CH2OSO3Na結(jié)構(gòu)。染色可在40-80℃進(jìn)行，時(shí)間可為20-60分鐘。
本角質(zhì)酶變體可以是一種熱穩(wěn)定性角質(zhì)酶，其在pH8.5的熱變性溫度TC至少比親代酶高5℃，例如高出7-10℃，例如為65℃或更高。對熱變性溫度的測量可按本說明書中實(shí)施例所述的DSC方法進(jìn)行。
表面活性劑在對紗線或織物的處理方法中，可以使用傳統(tǒng)的潤濕劑和/或分散劑促進(jìn)紗線或織物與酶之間的接觸。潤濕劑可以是非離子型表面活性劑，例如脂肪醇乙氧酸酯。一種非常有效的潤濕劑是乙氧酸化和丙氧酸化的脂肪酸酯如Berol 087(瑞士Akzo Nobel產(chǎn)品)。
分散染料宜選自非離子型、陰離子型、陽離子型、兩性電解質(zhì)型或兩性離子型表面活性劑。更具體地，分散染料可選自羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、烷基芳基磺酸酯，長鏈醇硫酸酯(初級和二級烷基硫酸酯)，磺化烯烴、甘油單硫酸酯、硫酸化醚、磺基琥珀酸酯、磺化甲醚、烷基磺酸酯、磷酸酯、烷基異硫氰酸酯、?；“彼?、烷基氨基磺酸酯、含氟表面活性劑、脂肪醇和烷基酚縮合物、脂肪酸縮合物、環(huán)氧乙烷與胺的縮合物、蔗糖酯、山梨醇酐酯、烷基醇酰胺、脂肪族胺氧化物、乙氧基化-元胺、乙氧基化二胺、脂肪醇乙氧基化物和它們的混合物。非常有效的分散劑之一是一種脂肪醇乙氧基化物如Berol 08(瑞士Akzo Nobel產(chǎn)品)。
制備角質(zhì)酶變體的方法本發(fā)明的角質(zhì)酶變體可通過業(yè)內(nèi)已知的方法制備，如WO 94/14963或WO 94/14964(Unilever)所述。下文描述克隆編碼角質(zhì)酶的DNA序列的方法，然后描述在角質(zhì)酶編碼序列的特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的方法。
克隆編碼角質(zhì)酶的DNA序列編碼親代角質(zhì)酶的DNA序列可從任何產(chǎn)生這種角質(zhì)酶的細(xì)胞或微生物中，通過業(yè)內(nèi)已熟知的方法分離得到。首先，使用可產(chǎn)生目的角質(zhì)酶的生物的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果這種角質(zhì)酶的氨基酸序列已知，則合成標(biāo)記的寡核苷酸探針用以從目的生物所制備的基因組文庫中識別出角質(zhì)酶編碼克隆。或者，也可用含有與另一已知角質(zhì)酶基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針經(jīng)過低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交和洗滌，而鑒定出角質(zhì)酶編碼克隆。
另一種鑒別角質(zhì)酶編碼克隆的方法涉及將基因組DNA片段插入到表達(dá)載體，例如質(zhì)粒中，用所得基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化角質(zhì)酶陰性細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌鋪到含有角質(zhì)酶底物(即麥芽糖)的瓊脂板上，從而鑒定出表達(dá)角質(zhì)酶的克隆。
或者，編碼角質(zhì)酶的DNA序列可以使用已經(jīng)確立的標(biāo)準(zhǔn)方法人工合成，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，四面晶體通信1981年第22期1859-1869頁中所述的亞磷酰胺方法，或Matthes等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志1984年第3期801-805頁中所述的方法。在亞磷酰胺方法中，寡核苷酸在例如自動DNA合成儀中合成，然后經(jīng)純化、退火、連接并克隆到適宜的載體中。
最終，通過用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成產(chǎn)生的、基因組來源的或cDNA來源的片段(優(yōu)選這些片段對應(yīng)于完整DNA序列的各個部分)，可獲得基因組來源與合成來源相混合的DNA序列、合成來源與cDNA來源相混合的DNA序列、或cDNA來源與基因組來源相混合的DNA序列。DNA序列也可以使用特異引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備，如在US 4,683,202或R.K.Saiki等在《科學(xué)》1988年第239期487-491頁所述。
定點(diǎn)誘變一旦分離了編碼角質(zhì)酶的DNA序列，并鑒別出目的突變位點(diǎn)，可用合成性寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有側(cè)翼于目的突變位點(diǎn)的核苷酸序列。在一種特定的方法中，在含有角質(zhì)酶基因的載體中產(chǎn)生編碼角質(zhì)酶的DNA序列的單鏈缺口。然后使帶有目的突變的合成產(chǎn)生的核苷酸與所述單鏈DNA的同源部分退火。剩余的缺口由DNA多聚酶I(Klenow片段)填補(bǔ)，該構(gòu)建體由T4連接酶連接。這種方法的具體實(shí)例見Morinaga等，生物技術(shù)，1984年第2期646-639頁。美國專利4,760,025公開了通過使基因盒產(chǎn)生微小改變而引入編碼多個突變的寡核苷酸。但由于可引入不同長度的多種寡核苷酸，所以可通過Morinaga方法一次引入更多的突變。
另一種在編碼角質(zhì)酶的DNA序列中引入突變的方法由Nelson和Long在《分析生物化學(xué)》1989年第180期147-151頁中有述。它涉及經(jīng)3步產(chǎn)生含目的突變的PCR片段，其通過用化學(xué)合成的DNA鏈作為引物之一進(jìn)行PCR反應(yīng)而得?？捎孟拗菩詢?nèi)切核酸酶切割這種PCR產(chǎn)生的片段，從而分離含有目的突變的DNA片段，并將其重新插入到一種表達(dá)質(zhì)粒中。
角質(zhì)酶變體的表達(dá)依照本發(fā)明，由以上所述方法或任何業(yè)內(nèi)已知的其它方法制備的編碼角質(zhì)酶變體的DNA序列可以通過表達(dá)載體以酶的形式表達(dá)，所述表達(dá)載體一般含有控制序列，其編碼啟動子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號的調(diào)控序列和任選抑制基因或各種激活因子的基因。
表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明角質(zhì)酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何可方便進(jìn)行重組DNA操作的載體，并且對載體的選擇一般依賴于將要引入該載體的宿主細(xì)胞類型。當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，這種載體可以整合至宿主細(xì)胞基因組，并與這些染色體一同復(fù)制。合適的表達(dá)載體有pMT838。
啟動子在載體中，DNA序列應(yīng)被有目的的與合適的啟動子序列連接。這種啟動子可以是在選定的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，其可以源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
介導(dǎo)編碼本發(fā)明角質(zhì)酶變體的DNA序列的轉(zhuǎn)錄，尤其在細(xì)菌宿主中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子有大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因的dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖的淀粉酶基因(amyM)的啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。用于在真菌宿主中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子有米曲霉TAKA淀粉酶基因的啟動子，釀酒酵母TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)啟動子(Alber等，(1982)，J.Mol.Appl.Genet l，p.419-434)，以及米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶的啟動子。
表達(dá)載體本發(fā)明的表達(dá)載體還含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，所述載體還含有聚腺苷酸化序列，該序列與編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連。終止序列和聚腺苷酸化序列優(yōu)選與啟動子有相同的來源。
載體也可進(jìn)一步含有能使該載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這類序列有質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可以含有選擇標(biāo)記，例如產(chǎn)生可補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的產(chǎn)物的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者能賦予抗生素抗性，如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。另外，所述載體可含有曲霉屬的選擇標(biāo)記，如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的一種標(biāo)記，或可通過WO 91/17243所述的共轉(zhuǎn)化完成選擇。
用于分別連接編碼角質(zhì)酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動子，終止子和其它元件的方法，以及用于將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(例見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港，1989)。
宿主細(xì)胞含有如上所述的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞可以有利地用作重組生產(chǎn)本發(fā)明角質(zhì)酶變體的宿主細(xì)胞。通過將編碼所述變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，可以方便地轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般認(rèn)為這種整合是有利的，因?yàn)镈NA序列更可能在細(xì)胞中穩(wěn)定維持。可根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源重組將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體。或者，可以用上述相關(guān)于其它宿主細(xì)胞類型的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物如哺乳動物或昆蟲的細(xì)胞，但也優(yōu)選微生物細(xì)胞，如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
適當(dāng)?shù)募?xì)菌有革蘭氏陽性細(xì)菌，例如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌或淡紫青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌?？赏ㄟ^原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，或通過使用感受態(tài)細(xì)胞以其固有方式轉(zhuǎn)化細(xì)菌。
酵母優(yōu)選糖酵母屬或裂殖糖酵母屬的種，例如釀酒酵母。
宿主細(xì)胞也可以是絲狀真菌，例如曲霉屬的菌株，最優(yōu)選米曲霉或黑曲霉；或鐮孢屬的菌株，如尖孢鐮孢，禾谷鐮孢(最佳狀態(tài)稱為玉米赤霉，以前被稱為Sphaeria zeae，與Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis是同義詞)，或硫色鐮孢(最佳狀態(tài)稱為虱狀赤霉，與Fusarium trichothecioides，桿孢狀鐮孢，接骨木鐮孢，玫瑰色鐮孢和玫瑰色鐮孢禾谷變種是同義詞)，F(xiàn)usarium cerealis(與Fusarium crokkwellnse 是同義詞)，或Fusariumvenenatum。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷株或蛋白酶陰性株。
例如，宿主細(xì)胞可以是蛋白酶缺陷的米曲霉菌株JaL 125，其堿性蛋白酶基因(被稱為“alp”)缺失。該菌株描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。
可通過形成原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，接著以其原有方式再生細(xì)胞壁，而轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞。曲霉屬作為宿主微生物的用途描述于EP 238 023(Novo Nordisk A/S)，其內(nèi)容列入本文作為參考。
通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生角質(zhì)酶變體本發(fā)明特別涉及一種產(chǎn)生本發(fā)明角質(zhì)酶變體的方法，此方法包括在適于所述變體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并且從所述細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用以培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何一種傳統(tǒng)培養(yǎng)基，只需其適于所使用的宿主細(xì)胞的生長并可獲得本發(fā)明中角質(zhì)酶變體的表達(dá)。合適的培養(yǎng)基可以商購，或根據(jù)公開的配方(例如描述于美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中的配方)制備。
宿主細(xì)胞分泌的角質(zhì)酶變體可方便的通過眾所周知的操作從培養(yǎng)基中回收，此方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，使用鹽例如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，然后用例如離子交換層析、親和層析或類似的層析方法。
變體在植物中的表達(dá)本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物，植物部分或植物細(xì)胞，它們已被編碼本發(fā)明變體的DNA序列轉(zhuǎn)化，從而能夠以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生此酶?？蓮闹参锘蛑参锊糠种谢厥账雒浮；蛑苯邮褂煤兄亟M酶的植物或植物部分。
轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉或單子葉植物。單子葉植物的例子是禾本科植物，如草甸草(早熟禾屬(Poa))，飼料草，如羊茅屬(festuca)，黑麥草屬(lolium)，溫帶草如剪股潁屬(Agrostis)，和谷類植物，如小麥，燕麥，黑麥，大麥，水稻，高粱和玉米。
雙子葉植物的例子是煙草，豆科植物，如羽扇豆屬植物，馬鈴薯，甜豆，豌豆，蠶豆和大豆，和十字花科植物(蕓苔科)，如花椰菜，油菜子和密切相關(guān)的模型生物擬南芥。
植物部分的例子是莖，愈傷組織，葉，根，果實(shí)，種子和塊莖。在本發(fā)明的上下文中，特定的植物組織也被認(rèn)為是植物部分，如葉綠體，質(zhì)外體，線粒體，液泡，過氧化物酶體和胞質(zhì)。另外，任何植物細(xì)胞(無論其來源于何種組織)都被認(rèn)為是植物部分。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括所述植物，植物部分和植物細(xì)胞的后代。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明變體的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡單地說，可通過下列方法構(gòu)建植物或植物細(xì)胞，即將編碼本發(fā)明的酶的一種或多種表達(dá)構(gòu)建體摻入植物宿主基因組，并將所得的已修飾的植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。
合適的表達(dá)構(gòu)建體可以是DNA構(gòu)建體，其含有編碼本發(fā)明所述酶的基因，該基因與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作相連，所述調(diào)節(jié)序列是在選定植物或植物部分中表達(dá)該基因所必需的。另外，所述表達(dá)構(gòu)建體可含有選擇標(biāo)記和將該構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物所需的DNA序列(后者取決于所用的DNA導(dǎo)入法)，所述選擇標(biāo)記可用于鑒定整合了表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
可根據(jù)例如需要在何時(shí)，何地和以何種方式表達(dá)酶來選擇調(diào)節(jié)序列，例如啟動子和終止序列并任選包括信號序列或轉(zhuǎn)運(yùn)序列。例如，編碼本發(fā)明所述酶的基因的表達(dá)可以是組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)，或者可以是發(fā)育，階段或組織特異性表達(dá)，基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分，如種子或葉。調(diào)節(jié)序列描述于例如Tague等，植物生理學(xué)，86，506，1988。
為了進(jìn)行組成型表達(dá)，可使用35S-CaMV啟動子(Franck等，1980.細(xì)胞21285-294)。器官特異性啟動子可以是例如貯藏庫組織(如種子，馬鈴薯塊莖和果實(shí))的啟動子(Edwards&Comzzi，1990.遺傳學(xué)年鑒24275-303)，或代謝庫組織(如分生組織)的啟動子(Ito等，1994.植物分子生物學(xué).24863-878)，種子特異性啟動子，如水稻谷蛋白，谷醇溶蛋白，球蛋白或白蛋白的啟動子(Wu等，植物和細(xì)胞生理學(xué)Vol.39，No.8 pp.885-889(1998))，蠶豆豆球蛋白B4和蠶豆未知種子蛋白質(zhì)基因的啟動子(Conrad U等，植物生理學(xué)雜志Vol.152，No.6 pp.708-711(1998))，種子油體蛋白的啟動子(Chen等，植物和細(xì)胞生理學(xué)vol.39，No.9 pp.935-941(1998))；Brassica napus貯藏蛋白napA的啟動子，或本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異性啟動子(例見WO91/14772)。另外，啟動子可以是葉特異性啟動子，例如水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，植物生理學(xué)Vol.102，No.3 pp.991-1000(1993))，小球藻屬病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra，A和Higgins，OW，植物分子生物學(xué)Vol.26，No.1 pp.85-93(1994))，或水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，分子和普通遺傳學(xué)，Vol.248，No.6 pp.668-674(1995))，或創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，植物分子生物學(xué)Vol.22，No.4 pp.573-588(1993))。
可使用啟動子增強(qiáng)子元件在植物中獲得較高的酶表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)子元件可以是位于啟動子和編碼所述酶的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu等，文獻(xiàn)同上公開了使用水稻肌動蛋白1基因的第一個內(nèi)含子來增強(qiáng)表達(dá)。
選擇標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可選自本領(lǐng)域已知的那些。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將DNA構(gòu)建體摻入植物基因組，所述技術(shù)包括農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，顯微注射，微粒轟擊，biolistic轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，科學(xué)，244，1293；Potrykus，Bio/Techn.8，535，1990；Shimamoto等，自然，338，274，1989)。
目前，根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的候選方法(有關(guān)綜述見Hooykas&Schilperoort，1992.植物分子生物學(xué).1915-38)，然而，該方法也可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，但單子葉植物一般使用其它的轉(zhuǎn)化方法。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的候選方法是胚愈傷組織或發(fā)育中的胚的微粒(被轉(zhuǎn)化DNA包被的顯微金或鎢顆粒)轟擊(Christou，1992.植物雜志.2275-281；Shimamoto，1994.最新生物技術(shù)觀點(diǎn).5158-162；Vasil等，1992.Bio/Technology 10667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的另一種方法基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh S等，植物分子生物學(xué)Vol.21，No.3 pp.415-428(1993))。
轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法選擇摻入了所述表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子并將其再生成完整植物。
材料和方法質(zhì)粒pJSO026這是一種釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒，見WO 97/07205和J.S.Okkels，(1996)“pYES載體的URA3啟動子缺失可提高釀酒酵母中真菌脂肪酶的表達(dá)水平”，重組DNA技術(shù)III生物科學(xué)和工程科學(xué)的結(jié)合，紐約科學(xué)院年鑒，第782卷。
pFuku83這是一種酵母和大腸桿菌中的穿梭載體，可用來在TPI啟動子控制下表達(dá)H.insolens角質(zhì)酶，其由pJSO026改建而成。
底物BETEB
此處的對苯二酸雙(2-羥乙基)酯二苯甲酸鹽縮寫為BETEB(苯甲?；?亞乙基-對苯二酸基-亞乙基-苯甲酸鹽)。它由對苯二酸雙(2-羥乙基)酯和苯甲酸制備而成。
脂肪酶活性(LU)使用阿拉伯膠作為乳化劑乳化三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)來制備脂肪酶底物。在恒pH的滴定實(shí)驗(yàn)中，于30℃，pH7的條件下水解三丁酸甘油酯。一個單位的脂肪酶活性(1LU)等于能在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘釋放1μmol丁酸的酶量。
差式掃描熱量法(DSC)將樣品和參比溶液仔細(xì)脫氣并立即將樣品裝入熱量計(jì)中(參比溶液即不含酶的緩沖液)。樣品和參比溶液(約0.5ml)在5℃預(yù)先熱平衡20分鐘。以約90k/hr的掃描率從5℃到95℃進(jìn)行掃描。由此測出變性溫度，其準(zhǔn)確度在1℃上下。MicroCal Inc.的VP-DSC適用于這些實(shí)驗(yàn)。
方法PCR條件步驟194℃，120秒步驟294℃，60秒步驟350℃，60秒步驟472℃，150秒返回步驟2，35個循環(huán)步驟572℃，480秒步驟64℃，永久實(shí)施例實(shí)施例1角質(zhì)酶變體的制備如美國專利5,827,719(Novo Nordisk)所述獲得編碼H.insolens角質(zhì)酶的DNA序列，發(fā)現(xiàn)其具有本文SEQID NO1所示DNA序列。
經(jīng)定域隨機(jī)誘導(dǎo)變異，并于BETEB培養(yǎng)基上60℃保溫1天后篩選陽性克隆，可獲得變體。這種BETEB培養(yǎng)基含有200ml/l的濃度為500mM的甘油緩沖液(pH8.5)，1.25g/l的BETEB(溶于熱乙醇中)和20g/l的瓊脂。
分離出三個陽性變體，并測定了它們的氨基酸序列。與其母體H.insolens角質(zhì)酶相比，它們具有如下改變A14P＋E47K
E47KE179Q實(shí)施例2定點(diǎn)誘變H.insolens角質(zhì)酶的一種包含E6Q＋E47K＋R57P取代的變體如下所述方法制備利用鄰近區(qū)已有的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對PCR引物以引入氨基酸取代，如下(星號表示引入的突變)上游引物E6QFcgg cag ctg gga acc atc c*ag aacPvu II下游引物E47K，R51Pcgc cct gga tcc aga tgt tcg*gga tgt ggg act t*aa ggcBamH IPCR在上述的條件下使用這些引物并且以pFukuNL83為模板進(jìn)行。
獲得的PCR片段由Clontech離心柱純化，并用Pvu II和BamH I消化。
所得片段經(jīng)凝膠純化，與在相同限制酶切位點(diǎn)被消化的pFukuNL83連接。
實(shí)施例3角質(zhì)酶變體的熱穩(wěn)定性變體如下述檢測H.insolens角質(zhì)酶及其以下變體的熱穩(wěn)定性A14P＋E47KE47KE179QE6Q＋E47K＋R51PA14P＋E47K＋E179QE6Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E179QE6Q＋E10Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E179Q差式掃描熱量法(DSC)角質(zhì)酶變體的熱穩(wěn)定性使用DSC方法在pH4.5(50mM乙酸鹽緩沖液)和pH8.5(50mM甘氨酰-甘氨酸緩沖液)的環(huán)境下研究。熱變性溫度Td是指溫度記錄圖(Cp對T)上變性峰(主要吸熱峰)的最高溫度。此溫度記錄圖是已設(shè)好程序的恒定加熱速率下加熱酶溶液后得到的。
經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)母體角質(zhì)酶在pH8.5時(shí)其Td是63℃，而6種上述變體的Td是70-73℃，即提高了7-10℃。
經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)母體角質(zhì)酶在pH4.5時(shí)其Td是61℃，而5種上述變體的Td是64-66℃，即提高了3-5℃。
BETEB的水解H.insolens角質(zhì)酶和上述變體中的2種的熱穩(wěn)定性在升溫的條件下通過BETEB的水解來測定。在針對每種角質(zhì)酶的實(shí)驗(yàn)中，將以下混合物于55-70℃范圍內(nèi)的不同溫度保溫17小時(shí)。
0.1ml0.5M甘氨酰-甘氨酸緩沖液(pH8.5)0.1ml0.5％BETEB的乙醇溶液0.1ml酶溶液(約25LU/ml)0.7mlMilliQ水水解程度在保溫后測定，結(jié)果由下表所示。
這些結(jié)果清楚的顯示了與母體相比，變體的熱穩(wěn)定性提高了BETEB的水解H.insolens角質(zhì)酶和上述變體中的3種的熱穩(wěn)定性是在60℃通過BETEB水解2小時(shí)來測定的。除了溫度固定在60℃和角質(zhì)酶劑量有所變化，水解的條件與上述相同。結(jié)果由下表所示。
這些結(jié)果顯示，這些變體在60℃水解的速度明顯比親代角質(zhì)酶更快。
實(shí)施例4c3ET的水解通過在不斷升溫的條件下c3ET的水解來測定H.insolens角質(zhì)酶和上述變體中的5種。在針對每種角質(zhì)酶的實(shí)驗(yàn)中，將以下混合物于不同溫度保溫2小時(shí)。
0.115mg c3ET(在反應(yīng)容器中加入0.1ml溶于HFIP的2mM c3ET，真空除去溶劑，然后于70℃烘干過夜)0.1ml 0.5M甘氨酰-甘氨酸緩沖液(pH8.5)0.1ml 酶溶液(約600 LU/ml)0.8ml MilliQ水保溫后，在每種反應(yīng)混合物中加入2ml 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)，然后用HPLC測定水解速率。圖3所示結(jié)果清楚表明這些變體的熱穩(wěn)定性比親代角質(zhì)酶提高了。
實(shí)施例5紗線上c3ET的水解H.insolens角質(zhì)酶和上述變體中的5種的熱穩(wěn)定性通過含有副產(chǎn)物c3ET的聚酯紗線來測定。將以下底物混合物于60或65℃預(yù)保溫。
0.1g聚酯紗線0.2ml 0.5M甘氨酰-甘氨酸緩沖液(pH8.5)1.7ml MilliQ水預(yù)保溫后，每個反應(yīng)容器中加入0.1ml酶溶液(約1000LU/ml)并保溫17小時(shí)。然后加入2ml HFIP，作用30分鐘以抽提并水解所述聚酯紗線表面的c3ET，再測定水解率，結(jié)果如圖4所示。
顯而易見，在水解聚酯紗線上的c3ET方面，變體比母體更加有效。其中一種變體在65℃時(shí)的水解率高于在60℃時(shí)的水解率。
實(shí)施例6用角質(zhì)酶變體處理紗線本實(shí)施例考察了不同溫度、不同c3ET劑量對聚酯型紗線的c3ET水解進(jìn)程。圖5顯示了不同溫度下的時(shí)間進(jìn)程。從此圖可見最適溫度為65℃。70℃時(shí)仍保留約一半的活性。圖6顯示了以逐漸增加的酶量進(jìn)行的水解進(jìn)程。劑量為275和550LU/ml的兩條曲線相同，這表明在100到275LU/ml之間水解率到達(dá)了一個平臺期。因此可以假定200LU/ml已足夠。
實(shí)施例7以反應(yīng)性染料對聚酯染色本實(shí)施例中對以下的聚酯型織物進(jìn)行了處理機(jī)織織物；大約2×2cm，34mg編織織物；大約1.5×1.5cm，50mg每種織物均在0.9ml、50mM GlyGly(甘氨酰甘氨酸)緩沖液(pH8.5)和0.1ml H.insolens角質(zhì)酶變體溶液(1100 LU/ml)中浸泡，并在65℃或70℃下保溫。一天后加入另一份0.1ml酶溶液并繼續(xù)保溫，兩天后取出織物并以清水漂洗。使用親代角質(zhì)酶進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，空白對照組織物以相同方式不加酶來處理。
在60℃下，將織物在120g Na2SO4和60g Na2CO3的9g混合物在3升去離子水中攪拌30分鐘，并在流動溫水中漂洗。反應(yīng)性染料為考馬斯亮藍(lán)B(日本Mitsui Chemical Co.生產(chǎn))，其結(jié)構(gòu)為生色團(tuán)-NHPh-SO2CH2CH2OSO3Na。
在所有四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，(機(jī)織織物和編織織物，65℃和70℃)，織物均被均勻的染色。
實(shí)施例8編織織物中聚酯碎片的增溶作用將1×1cm的聚酯型編織紡織物(PET，亞乙基乙二醇和對苯二酸的聚合物)與0.01mg H.insolens角質(zhì)酶變體于60℃在1ml緩沖液pH10中保溫1小時(shí)。分離反應(yīng)混合物，通過在250nm下測量溶液的OD值可以發(fā)現(xiàn)對苯二酸的釋放(以O(shè)D250/mgPET表示)。對照實(shí)驗(yàn)在不含此酶或含有親代角質(zhì)酶的條件下進(jìn)行。結(jié)果為
此結(jié)果表明該角質(zhì)酶變體可有效促進(jìn)聚酯型織物的溶解。
另一個實(shí)驗(yàn)中，于65℃使用從0.5到200LU/ml的不同酶量，對加入或不加入非離子型表面活性劑(脂肪醇乙氧基化物，產(chǎn)品名Softanol 50)的角質(zhì)酶變體測試2小時(shí)。結(jié)果顯示在非離子型表面活性劑存在時(shí)角質(zhì)酶變體的增溶作用更強(qiáng)。
實(shí)施例9聚己內(nèi)酯膠片和聚酯膠片的水解在試管中放入約0.1克的聚己內(nèi)酯或聚酯膠片。將其浸泡在5ml 50mM的GlyGly緩沖液中(pH8.5)，緩沖液中含或不含H.insolens角質(zhì)酶變體(450LU)。70℃保溫5小時(shí)。反應(yīng)后的聚己內(nèi)酯膠片和聚酯膠片在含酶的試管壁上均觀察到薄層的水解產(chǎn)物。而在不含酶的對照管中卻無變化。聚己酯膠片有10％的重量損失。聚酯膠片未見任何重量變化。
實(shí)施例10cPET的水解本實(shí)驗(yàn)中對角質(zhì)酶變體與親代酶的效用進(jìn)行了比較。試驗(yàn)如下進(jìn)行在微型滌垢儀中相對輕微的攪拌下用所述酶處理一塊有寡聚體污漬的(黑色)PET織物樣品(約4cm×13cm)。PET織物放置在一個有孔圓柱形固定器上(半徑約2cm，高約6cm)，該固定器圍繞其軸線旋轉(zhuǎn)，使該P(yáng)ET織物被寡聚體浸漬過的一面朝向圓柱體的外表面。
在指定溫度下(這里是65℃)，將織物浸泡于盛有100ml處理液的150ml玻璃燒杯中。處理一定時(shí)間后(這里是90分鐘)，將PET樣品從處理液中取出，用去離子水漂洗并風(fēng)干。
在調(diào)整處理后，對樣品浸漬過寡聚體的一面目測評級(依照寡聚體污漬斑塊被去除的效果)。評級標(biāo)準(zhǔn)如下-2樣品明顯劣于空白對照(不加酶)-1樣品略差于空白對照(不加酶)0樣品無法與空白對照分優(yōu)劣1樣品略優(yōu)于白對照2樣品明顯優(yōu)于白對照同時(shí)，使用分光光度計(jì)(儀器Hunterlab Reflectometer)讀取樣品以量化顏色強(qiáng)度(600nm處的K/S-值)。
下表總結(jié)了在相似條件下比較所述酶之性能的試驗(yàn)中所使用的測試條件溫度 65℃緩沖液/pH 50mM甘氨酸緩沖液，pH10.3處理時(shí)間(分鐘)90酶的劑量(LU/g)30000該試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在下表中
從本組實(shí)驗(yàn)可以看出，親代角質(zhì)酶在給定的測試條件下無效果或僅有非常有限的效果(可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)溫度太高以致酶很難保留其活性)，然而角質(zhì)酶變體可以明顯的去除PET織物上的寡聚體污漬。
實(shí)施例11cPET的水解在模式化分散染色實(shí)驗(yàn)中測試H.insolens角質(zhì)酶變體的pH和溫度特性。試驗(yàn)如下述進(jìn)行使用Wemer Mathis Labomat的典型的分散染色系列程序，處理一塊有寡聚體污漬的(黑色)PET織物樣品。此過程可概述為，將所述樣品加入到緩沖溶液中，加熱到130℃，再冷卻到處理溫度。加入酶或緩沖液并維持所需溫度30分鐘。將溶液冷卻至室溫并測量洗液的混濁度?；鞚岫鹊南陆凳菍琴|(zhì)酶活性的直接測定，其對應(yīng)于已水解的cPET寡聚物。
本實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)描述將一塊黑色PET樣品(約4cm×13cm)加入到含有0.2g/l LutensolAT11(BASF)的140ml 100mM的Britton-Robinson緩沖液中，并置于Labomat中(32轉(zhuǎn)每分鐘)。
以9℃/分鐘的速率將Labomat加熱到130℃，并維持10分鐘。
以9℃/分鐘的速率將燒杯降溫到運(yùn)行溫度(參照下表)，并維持1分鐘。
在燒杯中注入合適pH值的10mL酶溶液(100LU/ml所述變體)或緩沖溶液(0LU/ml)。
以2℃/分鐘的速率重新加熱Labomat，并維持30分鐘。
取出樣品，將洗液冷卻至室溫。
測量洗液的混濁度。
評價(jià)以1.8、18和180NTU標(biāo)準(zhǔn)混濁度為標(biāo)準(zhǔn)，使用Hach 18900比率混濁度儀測量混濁度。計(jì)算相對于空白對照的酶效應(yīng)，其為對照空白液(無酶)和酶處理液的混濁度之間的差異。
計(jì)算出了所述角質(zhì)酶變體的相對性能(混濁度的降低)，結(jié)果如下表所示。當(dāng)計(jì)算得到負(fù)數(shù)值時(shí)，結(jié)果表示為“負(fù)”。由于設(shè)置的變化，可以假定負(fù)數(shù)結(jié)果是人為因素的結(jié)果。
結(jié)果顯示該角質(zhì)酶變體在較寬pH和溫度范圍內(nèi)均有活性，在pH9和75℃的設(shè)置下有最佳寡聚物去除效果。似乎在85℃或更高溫度下此酶會失活。
實(shí)施例12cPET的水解在模式化分散染色實(shí)驗(yàn)中研究H.insolens角質(zhì)酶變體的處理時(shí)間的影響。試驗(yàn)如下進(jìn)行使用Wemer Mathis Labomat的典型的分散染色系列程序，處理一塊有寡聚體污漬的(黑色)PET織物樣品。此過程可概述為，將樣品加入到緩沖溶液中，加熱到130℃，再冷卻到處理溫度。加入酶或緩沖液(100mM Britton-Robinson pH9)并于75℃維持0-40分鐘。將溶液冷卻至室溫并測量洗液的混濁度?；鞚岫鹊南陆凳菍琴|(zhì)酶活性的直接測定，其對應(yīng)于已水解的cPET寡聚物。
本實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)描述將一塊黑色PET樣品(約4cm×13cm)加入到含有0.2g/l LutensolATll(BASF)的140ml 100mM的Britton-Robinson緩沖液中，并置于Labomat中(32轉(zhuǎn)每分鐘)。
以9℃/分鐘的速率將Labomat加熱到130℃，并維持10分鐘。
以9℃/分鐘的速率將燒杯降溫到75℃，并維持1分鐘。
在燒杯中注入10mL酶溶液(100LU/ml的變體)或100mM Britton-Robinson pH 9的緩沖溶液(0LU/ml)。
以2℃/分鐘的速率重新加熱Labomat到75℃，并維持合適的時(shí)間(0-40分鐘，參見下表)。
取出樣品，將洗液冷卻至室溫。
測量洗液的混濁度。
評價(jià)(以1.8、18和180NTU標(biāo)準(zhǔn)混濁度為標(biāo)準(zhǔn)，)使用Hach 18900比率混濁度儀測量混濁度。以0時(shí)的空白對照為參照，計(jì)算酶的相對效應(yīng)0時(shí)空白對照液(無酶)的混濁度減去酶處理液的混濁度(指定時(shí)間)。
計(jì)算出了該角質(zhì)酶變體的相對性能(混濁度的降低)，結(jié)果如下表所示。
結(jié)果表明酶的效果隨時(shí)間而增加。在本實(shí)驗(yàn)所用的酶劑量和寡聚體濃度下，在約20分鐘后酶的效果趨于穩(wěn)定。
實(shí)施例13纖維的改性通過在染色前用一種H.insolens角質(zhì)酶變體處理分散染色后的聚酯纖維，研究了此酶對這類纖維的潤濕性能的影響。因此本實(shí)驗(yàn)包括兩個階段，纖維改性和分散染色。
階段1-纖維改性設(shè)備Atlas Launder-O-meter LP2纖維Testfabrics提供的100％聚酯編織物pH值50mM磷酸鉀緩沖液，pH 7研磨劑 5個大鋼球燒杯容量120mL處理65℃2小時(shí)后突升至90℃并維持1小時(shí)樣品制備切下3*1.59的織物樣品，每燒杯3塊＝4.59漂洗在去離子水中漂洗。
階段2-染色-分散染料染料溶液加入去離子水配成1∶20的0.4％Dianix Red(DyStar)SE-CB(owf)溶液
pH4.5-5染色方法1.每次使用一塊經(jīng)纖維改性后的樣品進(jìn)行染色(使用1.5g/樣品進(jìn)行溶液比率的計(jì)算)。
2.依照上述配方配制染色液。在Labomat燒杯中加入冷染色溶液并以3.5℃/分鐘的速率加熱到55℃。到達(dá)預(yù)定溫度后繼續(xù)運(yùn)行5分鐘。
3.將織物加入到燒杯中。
4.以1.5℃/分鐘的速率加熱到130℃。染色30分鐘。
5.以5℃/分鐘的速率冷卻到70℃。倒掉染色液，但收集并熱(60℃)漂洗織物10分鐘。熱漂洗后，室溫下充溢漂洗直到不再有顏色被洗下。
6.放置風(fēng)干過夜。
測試/分析AATCC測試方法61-洗滌不褪色性染色液耗損百分比-分光光度計(jì)K/S和L*-反射計(jì)AATCC TM-79微量測試結(jié)果纖維改性的結(jié)果如下表所示。
結(jié)果表明使用該角質(zhì)酶變體處理聚酯可以顯著增加其潤濕性。在以上設(shè)置下未發(fā)現(xiàn)其對分散染料染色性的副作用。
實(shí)施例14洗衣業(yè)中使用角質(zhì)酶變體以減少源于人類汗液/皮脂污漬的紡織品上的惡臭使用振蕩式滌垢儀(Terg-O-tometer)進(jìn)行單輪洗滌試驗(yàn)以測試角質(zhì)酶去除惡臭的性能。
實(shí)驗(yàn)條件洗滌液每燒杯1000ml
樣品100％聚酯(連鎖編織，使用前經(jīng)Soxhlet提取液清洗)。每燒杯24決樣品(3.3×3.5cm)。
污漬人類男性腋窩汗液和取自運(yùn)動后腋窩的皮脂。
洗滌劑5g/L標(biāo)準(zhǔn)脫色劑。未調(diào)整pH值。
水的硬度3.2mM Ca2+/Mg2+(比值為5∶1)洗滌溫度30℃洗滌時(shí)間30分鐘漂洗流動自來水中15分鐘評價(jià)清洗后的潮濕樣品放置于密封的200ml有色玻璃杯中。一組經(jīng)過訓(xùn)練的感覺人員(9-11個評委組成)嗅聞潮濕樣品的頂部空間從而對其氣味和總氣味強(qiáng)度做出評價(jià)。氣味強(qiáng)度通過在15cm長的非格度坐標(biāo)上放置標(biāo)記的方法紀(jì)錄，在非格度坐標(biāo)兩端分別標(biāo)有文字(坐標(biāo)開始處為“無”，結(jié)尾處為“非常強(qiáng)烈”)。所有的評價(jià)均進(jìn)行兩次。樣品在清洗后的第1、2和3天進(jìn)行評價(jià)(樣品始終放置于玻璃杯中)。
權(quán)利要求
1.一種親代真菌角質(zhì)酶的變體，其a)在以下位點(diǎn)含有一個或多個氨基酸殘基的取代i)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或ii)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)，和b)比親代角質(zhì)酶具有更好的熱穩(wěn)定性。
2.上一權(quán)利要求中的變體，其在以下位點(diǎn)含有一個或多個氨基酸殘基的取代i)從N末端氨基酸起12以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或ii)從N末端氨基酸起15個殘基以內(nèi)。
3.一種親代真菌角質(zhì)酶的變體，其在以下位點(diǎn)含有一個或多個氨基酸殘基的取代a)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或b)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)，但須不是一種有以下取代之一的豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶變體R17、T18、T19V、D21N、I24E、Y38F、R40、G41A、S42、T43、E44、T45、G46、N47R、G49、T50、L51、P53、S54、A56C、S57、N58R、S61、A62E、K56A、D66S、G67D、W69Y、I70C、G74、G75、R78、Y119、G192、P193、D194R、A195、R196、G197V或A199C(豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶編號)。
4.一種親代真菌角質(zhì)酶的變體，其含有一個或多個氨基酸殘基的取代，所述取代具有以下特性a)含有溶劑易接觸的表面，并且b)其位于i)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或ii)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)，附帶條件是，這不是一種具有以下取代之一的豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶的變體，這些取代指T18、Y38F、R40、G41A、S42、T43、E44、T45、N47R、G49、T50、L51、P53、S54、A56C、A62E或G192(豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶編號)。
5.一種親代真菌角質(zhì)酶的變體，這種變體含有一個或多個氨基酸殘基的取代，其位于a)從N末端氨基酸起12以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或b)從N末端氨基酸起15個殘基以內(nèi)，附帶條件是，這不是一種具有以下取代之一的豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶的變體，這些取代指R17、T18、T19V、D21N、Y38F、R40、T45、G46、N47R、G49、T50、L51、P53、S54、A56C、S57、N58R、K65A或170C(豌豆茄病鐮孢角質(zhì)酶編號)。
6.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其中的親代角質(zhì)酶為絲狀真菌，優(yōu)選腐質(zhì)霉屬或鐮孢霉屬所固有，更優(yōu)選Humicola insolens或豌豆茄病鐮孢，最優(yōu)選Humicola insolens DSM 1800株。
7.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其中的親代角質(zhì)酶氨基酸序列與Humicola insolens DSM 1800的角質(zhì)酶的相匹配。
8.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其中的親代角質(zhì)酶氨基酸序列與Humicola insolens DSM 1800的角質(zhì)酶有至少50％同源性，更優(yōu)選至少70％同源性，更優(yōu)選至少80％同源性。
9.Humicola insolens親代真菌角質(zhì)酶的變體，其在以下位點(diǎn)含有一個或多個氨基酸殘基的取代a)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或b)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)。
10.上一權(quán)利要求中的變體，其在以下位點(diǎn)含有一個或多個氨基酸殘基的取代a)從N末端氨基酸起12以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或b)從N末端氨基酸起15個殘基以內(nèi)。
11.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其含有一個或多個氨基酸殘基的取代從而擁有可接觸溶劑的表面。
12.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其中所述一個或多個取代為荷負(fù)電荷的氨基酸被中性或荷正電荷的氨基酸取代，或中性氨基酸被荷正電荷的氨基酸取代。
13.上一權(quán)利要求中的變體，其中所述一個或多個取代位于Humicolainsolens DSM 1800的角質(zhì)酶中E6，E10，E30，E47，D63，E82和/或E179的位置，優(yōu)選用R/K/Y/H/Q/N取代，更優(yōu)選對應(yīng)于E6N/Q，E10N/Q，E47K/R和/或E179 N/Q的取代(Humicola insolens角質(zhì)酶編號)。
14.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其中所述一個或多個取代是用脯氨酸殘基取代，其位于A14和/或R51。
15.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其含有1、2、3、4、5或6個上述取代。
16.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其在對應(yīng)于Humicola insolens DSM1800的角質(zhì)酶中以下位置具有取代a)R51Pb)E6N/Q＋L138Ic)A14P＋E47Kd)E47Ke)E179N/Qf)E6N/Q＋E47K＋R51Pg)A14P＋E47K＋E179N/Qh)E47K＋E179N/Qi)E47K＋D63Nj)E6N/Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E179N/Qk)E6N/Q＋E10N/Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E179N/Q，或1)Q1P＋L2V＋S11C＋N15T＋F24Y＋L46I＋E47K
17.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其對對苯二酸酯有水解活性，特別是對環(huán)三(對苯二甲酸亞乙酯)和/或?qū)Ρ蕉犭p(2-羥乙基)酯二苯甲酸鹽(BETEB)。
18.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其變性溫度至少比親代角質(zhì)酶高出5℃，優(yōu)選在pH8.5所測。
19.一種DNA序列，其編碼在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體。
20.一種載體，其含有上一權(quán)利要求中的DNA序列。
21.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其攜有權(quán)利要求19的DNA序列或 20的載體。
22.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的變體的方法，其包括a)培養(yǎng)權(quán)利要求21的細(xì)胞，從而表達(dá)并優(yōu)選分泌所述變體，和b)回收變體。
23.一種構(gòu)建角質(zhì)酶變體的方法，其包括a)選擇親代真菌角質(zhì)酶，b)鑒定所述親代角質(zhì)酶中以下位點(diǎn)的一個或多個氨基酸殘基i)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或ii)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)，和c)實(shí)施改變，每個改變分別為氨基酸殘基的插入、缺失或取代，d)任選在除b)以外的一個或多個位置上進(jìn)行改變，所述改變各為插入，缺失或取代一個氨基酸殘基，e)制備步驟b-d獲得的變體，f)測量所述變體的熱穩(wěn)定性，g)任選重復(fù)步驟b-f，和h)選出熱穩(wěn)定性高于親代角質(zhì)酶的變體。
24.一種產(chǎn)生角質(zhì)酶變體的方法，包括a)選擇親代真菌角質(zhì)酶，b)鑒定所述親代角質(zhì)酶中以下位點(diǎn)的一個或多個氨基酸殘基i)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或ii)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)，和c)實(shí)施改變，每個改變分別為氨基酸殘基的插入、缺失或取代，d)任選在除b)以外的一個或多個位置上進(jìn)行改變，所述改變各為插入，缺失或取代一個氨基酸殘基，e)制備步驟b-d獲得的變體，f)測量所述變體的熱穩(wěn)定性，g)可選擇地重復(fù)步驟b-f，和h)選出熱穩(wěn)定性高于親代角質(zhì)酶的變體，i)生產(chǎn)該變體以獲得角質(zhì)酶變體。
25.一種酶性水解聚(對苯二甲酸亞乙酯)的環(huán)狀低聚物的方法，此方法包括以親代真菌角質(zhì)酶的一種變體處理該環(huán)狀低聚物，其中的變體在以下位點(diǎn)有一個或多個氨基酸殘基的取代i)從N末端氨基酸起17以內(nèi)(按晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基計(jì)算)，和/或ii)從N末端氨基酸起20個殘基以內(nèi)。
26.上一權(quán)利要求的方法，其中環(huán)狀低聚物是環(huán)狀三(對苯二甲酸亞乙酯)。
27.權(quán)利要求25或26的方法，其中所述處理在60-80℃進(jìn)行，優(yōu)選65-75℃。
28.權(quán)利要求25-27的方法，其中環(huán)狀低聚物存在于含聚酯的織物或紗線中或其上。
29.權(quán)利要求25-28的方法，其進(jìn)一步包括隨后對所述織物或紗線進(jìn)行漂洗，優(yōu)選用pH約7-11的水溶液漂洗。
30.對聚酯型織物或紗線進(jìn)行染色的方法，其包括a)用pH8.5時(shí)熱變性溫度為65℃或更高的角質(zhì)酶處理所述織物或紗線；b)使用反應(yīng)性染料或分散染料對處理過的織物染色。
31.上一權(quán)利要求的方法，其中的角質(zhì)酶為權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的變體。
32.一種去污組合物，其含有一種表面活性劑以及權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的變體。
33.一種檢測樣品中角質(zhì)酶活性的方法，包括使所述樣品與對苯二酸雙(2-羥乙基)酯二苯甲酸鹽一起保溫，并測量上述酯的水解。
34.一種改進(jìn)含PET的紗線或織物的功能性涂飾的方法，包括a)用權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的變體處理所述織物或紗線，b)然后用選自軟化劑，抗皺樹脂，抗靜電劑，抗污劑的涂飾劑處理所述織物或紗線。
全文摘要
真菌角質(zhì)酶的變體,其具有更好的熱穩(wěn)定性。所述變體在角質(zhì)酶的氨基酸序列N末端鄰近區(qū)或三維結(jié)構(gòu)中包含一或多個氨基酸參加的取代。
文檔編號C08G63/91GK1329664SQ99814071
公開日2002年1月2日 申請日期1999年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月4日
發(fā)明者阿保正伸, 福山志朗, 阿倫·斯文森, 松井知子 申請人:諾維信公司