專利名稱：從羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用離子交換柱層析和凝膠柱層析方法，從羊肚菌中提取具有生物活性的一定分子量，官能團(tuán)結(jié)構(gòu)確定的純多糖的方法及其產(chǎn)品。
羊肚菌目前被譽為世界上最名貴的食用菌，屬于低溫型大型食藥兼用菌，早在我國《廣菌譜》和《本草綱目》中就被列入“菜部”中，稱為羊肚菜。其肉質(zhì)脆嫩，香甜可口，是食用菌中的珍品之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床表明羊肚菌中含有抗癌的有效成份，具有增強免疫力，抗腫瘤，防衰老等方面的作用而越來越被世人重視。食用菌多糖具有獨特的生物學(xué)特性而日益受到人們親睞，如香菇多糖，槐耳多糖等被用于增強免疫功能，治療肝炎和腫瘤。由于羊肚菌中多糖的復(fù)雜性以及分離和分析方法的種種限制，羊肚菌多糖的種類至今尚未探明，其結(jié)構(gòu)也未完全確定，對羊肚菌多糖的結(jié)構(gòu)與它的藥理作用關(guān)系的報導(dǎo)也很少。人們對羊肚菌的認(rèn)識和使用上還停留在原汁原味的劑量大，攜帶和食用均不方便的營養(yǎng)原液階段，目前，對羊肚菌的分離提純，拿到有效生物活性的雜多糖，是現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究的一個問題。
本發(fā)明的目的就是利用離子交換柱層析方法和凝膠柱層析等方法，從羊肚菌營養(yǎng)液中提取具有生物活性的一定分子量，官能團(tuán)結(jié)構(gòu)確定的純多糖。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的采用去離子水為洗脫液，通過纖維素離子交換柱及凝膠柱，將由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩爾比為0.29∶0.24∶0.61∶0.39)縮合而成，具有β-吡喃糖苷鍵、分子量為11500的雜多糖從羊肚菌營養(yǎng)液中得到的分子量為1-10萬的粗多糖中分離出來。首先裝填離子交換纖維素柱，取一定量的DE-52纖維素，將其浸泡在分析純的三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸混配的緩沖液中，使之pH值為9.6，使離子交換纖維素變?yōu)镺H-型。將浸泡過的DE-52纖維素填入玻璃柱中，用蠕動泵輸入三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸混配的緩沖液，pH9.6，平衡適當(dāng)?shù)臅r間。第二步將用超濾方法從羊肚菌培養(yǎng)液中提取的分子量為1-10萬的粗多糖溶于去離子水中，去離子水用量為充分溶解粗多糖為準(zhǔn)，將溶解液直接慢慢上于柱頭。用蠕動泵將去離子水注入離子交換纖維素柱，流速為0.8-1.2ml/min，時間為6-10小時，溫度為室溫。用餾分收集器以每5min收集一管，將洗脫液收集，然后用UV250PC紫外可見分光光度計做苯酚-硫酸法檢測多糖峰位，合并單一峰多糖，將測定在490nm有最大吸收高峰的洗脫液收集。冷凍干燥后，將此單一多糖溶于蒸餾水中，蒸餾水用量以充分溶解此單一多糖為準(zhǔn)，然后將其上柱于Sepharose CL-6B凝膠柱頭，用蒸餾水充分洗滌、收集，將收集液再經(jīng)過苯酚-硫酸法檢測多糖峰位，收集在490nm高吸收峰位的收集液，脫鹽冷凍干燥后，得到白色棉絮狀單一多糖成品。
對單一多糖做如下測定單一多糖經(jīng)KBr壓片，按常規(guī)測定紅外光譜，隨后做H-NMR及13C-NMR核磁共振波譜分析。
1.分子量及純度測定本實驗用高效液相色譜法鑒定多糖純度，并測定其分子量。高效液相色譜儀為Waters 600，Ultrahydrogel 2000和Ultrahydrogel 500色譜柱串聯(lián)，Waters 410型示差折光檢測器。流動相為0.1mol/l磷酸鹽緩沖液，流速為0.6ml/min。
測得單一多糖分子量為11500。
測得單一多糖在Waters HPLC上為單一對稱峰。
2.高效毛細(xì)管電泳分析取單一多糖10mg溶于1ml 1mol/L硫酸中，封管水解10h，中和，離心，上清液與α-萘胺衍生后進(jìn)行HPCE分析?；旌蛦翁菢?biāo)準(zhǔn)采用同樣方法衍生后進(jìn)行分析。高效毛細(xì)管電泳實驗條件電壓18KV，電流46μA，紫外檢測波長254nm，硼砂緩沖液100mol/l，pH10.0。經(jīng)測定此單一多糖是由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩爾比為0.29∶0.24∶0.61∶0.39)等四種單糖殘基為重復(fù)單元組成的雜多糖。
3.紫外光譜在260nm和280nm處未見蛋白質(zhì)及核酸的特征吸收峰。元素分析結(jié)果為含碳39.11％，含氫為8.98％，不含氮。
4.紅外光譜顯示在4000cm-1-650cm-1區(qū)內(nèi)具有多糖類物質(zhì)的一般特征。在3500cm-1的吸收峰是游離OH的伸縮振動峰，在1024cm-1和1039cm-1為吡喃糖環(huán)的醚鍵C-O-C振動吸收峰；在890cm-1附近有β-糖苷鍵的特征吸收峰，而在840cm-1處沒有α-糖苷鍵的特征吸收峰。在1H-NMR中δ4.80ppm的共振信號，即C1質(zhì)子區(qū)的信號峰在5.0ppm以下，進(jìn)一步證明糖苷鍵為β型。
以上實驗證明，本發(fā)明獲得的單一多糖為由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩爾比為0.29∶0.24∶0.61∶0.39)縮合而成的，具有β-吡喃糖苷鍵的分子量為11500的雜多糖。
用DE-52纖維素離子交換和Sepharose CL-6B，以去離子水為洗脫液，對羊肚菌粗糖進(jìn)行純化分離得到四種單糖(木糖、葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖)殘基為重復(fù)單元縮合而成的，其分子量為11500，具有β-吡喃糖苷鍵的雜多糖，工藝簡單，操作方便，可以得到具有生物活性的一定分子量，官能團(tuán)結(jié)構(gòu)確定的純多糖，為下一步研究羊肚菌多糖生物活性和走向更高層次的生化市場打下基礎(chǔ)。


圖1羊肚菌多糖在DE-52上洗脫曲線。
圖2單一多糖凝膠滲透色譜洗脫曲線。
圖3高效液相色譜對單一多糖的分子量測定圖。
圖4標(biāo)準(zhǔn)單糖和單一多糖水解物的高效毛細(xì)管電泳圖。
圖中1.木糖、2、4.甘露糖、3.葡萄糖、5.阿拉伯糖、6.半乳糖圖5單一多糖的紅外譜圖。
實施例1首先制備DE-52纖維素柱，取足夠的DE-52纖維素，將其浸泡在分析純的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中，用HCl將其pH值調(diào)至9.6，使DE-52纖維素變?yōu)镺H-型。然后將浸泡好的DE-52纖維素裝填入一根Ф2.6×90cm的玻璃柱中，用蠕動泵輸入三(羥甲基)氨基甲烷，pH9.6的緩沖溶液對柱中填料平衡二天。通過超濾從羊肚菌培養(yǎng)液中提取分子量為1-10萬的粗多糖100mg，溶于1ml的去離子水中溶解，將其直接上樣于DE-52纖維素玻璃柱頭，用蠕動泵將去離子水注入DE-52纖維素柱，流速為0.93ml/min，洗脫粗多糖9個小時，用餾分收集器將洗脫液以每5分鐘收集一管收集起來，用苯酚-硫酸法檢測收集液的多糖峰位，儀器為日本島津UV2501PC紫外分光光度計，收集在490nm有最大吸收高峰的洗脫液，將其冷凍干燥后，得到白色粉末，再將此單一多糖白色粉末溶于1ml蒸餾水中，將其上樣于Sepharose CL-6B凝膠柱頭，(凝膠柱為Ф1.6×80cm)，過柱，收集。用苯酚-硫酸法檢測洗脫液的多糖峰位，收集高吸收值峰位的洗脫液，冷凍干燥，得到一種白色棉絮狀單一多糖30.1mg。經(jīng)KBR壓片，按常規(guī)測定紅外光譜，隨后做H-NMR及13C-NMR核磁共振波譜分析，此白色棉絮狀單一多糖為木糖、葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖縮合而成的具有β-吡喃糖苷鍵的分子量為11500的雜多糖。
實施例2根據(jù)實施例1的方法獲得1g羊肚菌粗多糖，將其溶于8ml的去離子水中，用實施例1的方法制得Ф2.6×90cm的DE-52纖維素柱，將配液上柱，用去離子水洗脫，流速為1.15ml/min，時間為8小時。用與實施例1同樣的方法收集洗脫液，冷凍干燥后得到白色粉沫，將白色粉沫溶于蒸餾水中，經(jīng)過Sepharose CL-6B凝膠柱的處理，最后得到301mg的棉絮狀的單一多糖。經(jīng)KBr壓片，按常規(guī)測定紅外光譜，做核磁共振波譜分析，此棉絮狀單一多糖為木糖、葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖縮合而成的具有β-吡喃糖苷鍵的分子量為11500的雜多糖。
實施例3用實施例1同樣的工藝方法從羊肚菌粗多糖中提取木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖結(jié)實合而成的具有β-吡喃糖苷鍵的分子量為11500的雜多糖。取羊肚菌粗多糖1000g，DE-52纖維素柱為Ф0.5×2m，去離子水流速為0.8ml/min，時間為10小時，Sepharese CL-6B凝膠柱適當(dāng)按比例增加體積。最后得到301g白色棉絮狀單一多糖。經(jīng)KBr壓片，按常規(guī)進(jìn)行紅外光譜，隨后做核磁共振波譜分析，此白色棉絮狀單一多糖為預(yù)提取物。
權(quán)利要求
1.一種從羊肚菌粗多糖中提取的單一多糖，其特征在于它是一種由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩爾比為0.29∶0.24∶0.61∶0.39)縮合而成，具有β-吡喃糖苷鍵，其分子量為11500的雜多糖。
2.一種從羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法，其特征在于采用以去離子水為洗脫液，通過纖維素離子交換柱及凝膠柱，將木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖縮合而成，具有β-吡喃糖苷鍵，其分子量為11500的雜多糖從羊肚菌營養(yǎng)液中得到的分子為1-10萬的粗多糖中分離出來；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法，其特征在于纖維素離子交換柱的裝填物是DE-52纖維素；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法，其特征在于DE-52纖維素是經(jīng)過三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩沖液浸泡后轉(zhuǎn)換成OH-型的纖維素；
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法，其特征在于去離子水洗脫時間為8-10小時，水的流速為0.8-1.2ml/min，溫度為室溫；
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法，其特征在于凝膠柱的填充物為Sepharose CL-6B；
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法，其特征在于對通過DE-52纖維素離子交換柱的洗脫液，用苯酚-硫酸法檢測其的多糖峰位，收集在490nm有最大吸收高峰的洗脫液冷凍干燥；
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從羊肚菌粗多糖中提取單一多糖的方法，其特征在于通過Sepharose CL-6B凝膠柱的洗脫液用苯酚-硫酸法檢測其多糖峰位，收集在490nm有最大吸收高峰的洗脫液冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從羊肚菌粗多糖中提取具有生物活性、由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖縮合而成,具有β－吡喃糖苷鍵,分子量為11500的單一多糖,此單一多糖是將從羊肚菌營養(yǎng)液中得到的分子量為1—10萬的粗多糖,通過DE－52纖維素離子交換柱和SepharoseCL－6B凝膠柱,用去離子水洗脫,進(jìn)行純化分離獲得的,用此工藝方法簡單,操作方便,能得到分子量一定,官能團(tuán)結(jié)構(gòu)也能確定的單一多糖。
文檔編號C08B37/00GK1240214SQ9910980
公開日2000年1月5日 申請日期1999年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月14日
發(fā)明者魏云, 張?zhí)煊? 張姝, 劉慶輝 申請人:北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所