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霉病霉素的生產(chǎn)方法

文檔序號:88423閱讀:498來源:國知局
專利名稱:霉病霉素的生產(chǎn)方法
本發(fā)明與生產(chǎn)霉病霉素的發(fā)酵方法有關(guān)。
霉病霉素是一具有結(jié)構(gòu)式〔Ⅰ〕的化合物;通過培養(yǎng)屬于鏈輪絲菌
屬產(chǎn)霉病霉素的菌株,它作為抗菌素首次被發(fā)現(xiàn)并命名為“抗菌素B-98891”。我們把注意力集中在它的活性上,特別是它作為多種植物的一種預(yù)防和治療白粉病藥或作為殺螨劑的作用。因此,希望提高霉病霉素的產(chǎn)量,包括在至少含3毫摩爾(毫摩爾/升)N-甲基化合物培養(yǎng)基上或含5-羥甲基胞嘧啶的培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)霉病霉素的菌株的發(fā)酵方法?!睻.S.P.4007267;U.S.P.4334022;U.S.P.4296107;英國專利號1507193;“抗菌素雜志”31卷,6期511-518頁,519-524頁(1978);“殺蟲劑科學(xué)雜志”4卷3期,349-353頁(1979);“四面體化學(xué)”37卷,1317-1327頁(1981);等等〕。
然而,就目前所知的生產(chǎn)霉病霉素的發(fā)酵方法,所采用的產(chǎn)霉病霉素菌株生產(chǎn)霉病霉素的能力是有限的,因而通過改進(jìn)培養(yǎng)基中含有的物質(zhì)來提高霉病霉素的產(chǎn)率也是限制的,因此這些方法已不能滿足工業(yè)化大規(guī)模地生產(chǎn)霉病霉素的需要。
本項(xiàng)發(fā)明的發(fā)明者經(jīng)過對提高菌株產(chǎn)霉病霉素能力勤奮研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn);當(dāng)把產(chǎn)霉病霉素的菌株對具有結(jié)構(gòu)式
〔Ⅱ〕的絲氨酸氧肟酸鹽或?qū)哂薪Y(jié)構(gòu)式
〔Ⅲ〕的刀豆氨酸有抗性時,即便使用普通培養(yǎng)基,菌株生產(chǎn)霉病霉素的能力也得到意想不到的提高,從而使霉病霉素的生產(chǎn)效率變得更高。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn),完成了本項(xiàng)發(fā)明。
更準(zhǔn)確地說,本發(fā)明是關(guān)于(1)一種生產(chǎn)霉病霉素的方法,其特征在于通過在培養(yǎng)基上培養(yǎng)屬于鏈輪絲菌屬,產(chǎn)霉病霉素的菌株,由于此菌株抗培養(yǎng)基中的絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸,從而引起所說菌株合成和積累霉病霉素,并從最后培養(yǎng)物液中回收霉病霉素。
(2)上述申請專利(1)所述的生產(chǎn)霉病霉素的方法,其特征在于培養(yǎng)基中至少含有3毫摩爾的N-甲基化合物。
(3)申請專利(1)或(2)所述的生產(chǎn)霉病霉素的方法,其特征在于培養(yǎng)基中含有5-羥甲基胞嘧啶。
(4)裂生鏈輪絲菌(Streptoverticillium rimofaciens)能抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸并能產(chǎn)生霉病霉素。
在本發(fā)明制備霉病霉素的方法中,應(yīng)用的是屬于鏈輪絲菌屬,有抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸特性的產(chǎn)霉病霉素的菌株(這里或以后稱“本發(fā)明菌株”)。舉例來說,本發(fā)明菌株有如下特性〔1〕形態(tài)學(xué)特性在各種不同的常規(guī)培養(yǎng)基上,本發(fā)明菌株形成氣生菌絲,呈輪狀具二級輪枝。在合成瓊脂培養(yǎng)基如,葡萄糖、天冬酰胺瓊脂上雖然很少但也能發(fā)現(xiàn)孢子絲環(huán)和鉤狀孢子絲。孢子形狀為卵形到園筒形,大小為0.6~0.8×0.7~1.3微米。一般孢子產(chǎn)生呈鏈狀,含3到16個,每個孢子表面光滑或瘤狀。在常規(guī)培養(yǎng)基上,沒有觀察到孢子囊、鞭毛、菌核等等。
〔2〕培養(yǎng)特性本發(fā)明菌株的培養(yǎng)特性如表1所示。如無特殊說明,描述的是在28℃下經(jīng)21天培養(yǎng)后的結(jié)果。表中用括號()表明的顏色名稱是根據(jù)《色譜手冊》,第4版,Container Corporation of America。
〔3〕生理特性(1)生長溫度范圍在15~38℃范圍內(nèi)生長,更好地生長和產(chǎn)生氣生菌絲的溫度為28~36℃。
(2)明膠液化(24℃培養(yǎng)28天)不液化。
(3)淀粉水解陽性(4)硝酸鹽還原在細(xì)菌硝酸鹽培養(yǎng)液(ISP-No.8)和查氏培養(yǎng)液(Czapek′s solution)中陰性。
(5)脫脂乳凝固反應(yīng)陽性蛋白胨化陽性(6)黑色素的產(chǎn)生陽性(蛋白胨、酵母液、鐵離子瓊脂培養(yǎng)基)陰性(酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基)(7)碳源的利用(在Pridham·Gottlieb瓊脂培養(yǎng)基上)ⅰ)利用相當(dāng)好的碳源肌醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、麥芽糖、D-甘露糖、淀粉、甘油、醋酸鈉、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉。
ⅱ)一般利用的碳源D-果糖、海藻糖。
ⅲ)不利用的碳源赤蘚醇、核糖醇、D-山梨醇、D-甘露醇、半乳糖醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷、七葉苷、菊粉。
(8)在蛋白質(zhì)培養(yǎng)基上的色素生成弱(9)肉湯-瓊脂培養(yǎng)基上的裂化無(10)對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸的抗性抑制菌絲生長的最低濃度;抗絲氨酸氧肟酸鹽至少是40微克/毫升,抗刀豆氨酸至少是100微克/毫升。
〔4〕其它特性按照“發(fā)酵工程雜志”63卷,1期,17-21頁(1985)上描述的酶學(xué)方法,產(chǎn)生5-羥甲基胞嘧啶的比活力為0.18毫微摩爾/分/毫克蛋白或更大。
具有上述特性的這個菌株是裂生鏈輪絲菌,例如裂生鏈輪絲菌CR3-182(抗絲氨酸氧肟酸鹽),裂生鏈輪絲菌CVR-48(抗絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸)和裂生鏈輪絲菌CVR-16(抗刀豆氨酸)。上述裂生鏈輪絲菌CR3-182已于1985年6月28日保藏大阪發(fā)酵研究所(IFO),保藏號為IFO-14448,同時于1985年7月8日把它保藏在工業(yè)科學(xué)和技術(shù)局的發(fā)酵研究所(FRI),保藏號為FERM P-8334,裂生鏈輪絲菌CVR-48 1985年6月28日保藏在IFO,保藏號為IFO-14449,1985年7月8日保藏在FRI,保藏號為FERM P-8333,裂生鏈輪絲菌CVR-16于1986年7月15日保藏在IFO,保藏號為IFO-14527,1986年7月25日保藏在FRI,保藏號為FERMP-8874。
在生產(chǎn)霉病霉素這個方法的菌株培養(yǎng)中,可利用通常微生物可吸收的碳源,易消化的氮源和無機(jī)鹽等等組成的培養(yǎng)基。如需要時,培養(yǎng)基中可加入微量營養(yǎng)物,生長促進(jìn)劑,前體和其它少量就能起作用的物質(zhì)。通??赏奶荚窗?,如淀粉、糊精、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糖蜜、玉米漿、谷子凝膠,以及有機(jī)酸如醋酸、琥珀酸等等或脂肪和油或多羥基醇如甘油,這些物質(zhì)可單獨(dú)用或聯(lián)合應(yīng)用。易消化的氮源包括無機(jī)硝酸鹽如各種銨鹽、硝酸鹽和尿素以及有機(jī)的天然物質(zhì)如酵母浸出液,酪素,肉汁、棉籽粉、玉米漿、豆粉等等,它們既可單用也可以聯(lián)合使用。當(dāng)需要時培養(yǎng)基還包含有無機(jī)鹽、鐵、鎂、錳、鈷、銅、鈉、鉀、鈣、鋅等金屬鹽。此外如果有必要用的微生物的話,則培養(yǎng)基中應(yīng)含有適量的特殊營養(yǎng)物,如氨基酸、維生素、核酸堿基等等物質(zhì)。只要能達(dá)到本發(fā)明的目的這些外加物的濃度沒有特別限定,可從常規(guī)發(fā)酵過程一般使用的范圍中適當(dāng)選出合適濃度。
為了獲得霉病霉素較高的產(chǎn)量,最好使N-甲基化合物組合在培養(yǎng)基中。這種N-甲基化合物可包括在其分子中具有不少于1個可被1個到4個甲基取代氮原子。較好是在分子中有1個被1個或多個甲基取代的那些化合物,特別是具有三甲基氨基基團(tuán)(其中氮原子被3個甲基取代,即
的季銨鹽最好。另外,在培養(yǎng)基中具有一個基團(tuán)能轉(zhuǎn)化成N-OH3基團(tuán)的化合物,如,N1N-甲撐雙丙烯酰胺,也能用作為所說的N-甲基化合物。N-甲基化合物通常分子量在50-1000范圍內(nèi),最好在90-130范圍內(nèi)。N-甲基化合物可以是水溶性或水不溶的,但易水溶性的N-甲基化合物應(yīng)用較為有利。這種N-甲基化合物的實(shí)例有;N-甲基酸酰胺,N-甲基氨基化合物、N-甲基胺、N-甲基銨化合物、N1N-甲基雙丙烯酰胺等等。N-甲基酸酰胺類有,例如N1N-二甲基乙酰胺,N-甲基-丙烯酰胺等等,N-甲基氨基化合物有,例如,N-甲基尿素,1,1,3,3-四甲基尿素,2-二甲基氨基乙醇等等;N-甲基胺有例如,三甲基胺,二甲基胺等等;N-甲基銨化合物有,例如,卵磷脂,膽堿,甜菜堿,四甲基銨,等等,以上物質(zhì)都能有利地使用。使用N-甲基銨化合物,特別是膽堿、甜菜堿或四甲基銨可獲得滿意的結(jié)果。這些N-甲基化合物既可單獨(dú)使用也可以兩種、數(shù)種混合使用。在上述范圍內(nèi),為了使培養(yǎng)基中含有多于3毫摩爾的N-甲基化合物,本發(fā)明也包括一種方法,即在培養(yǎng)基中加入大量的含N-甲基化合物的物質(zhì),如含有甜菜堿的甜菜糖密,含有卵磷脂的豆?jié){或含有卵磷脂的雞蛋等等。培養(yǎng)基中N-甲基化合物的濃度在不抑制所用微生物的生長范圍內(nèi)進(jìn)行擇優(yōu)選擇,而且也可調(diào)整到大于3毫摩爾。合適的濃度為4毫摩爾到200毫摩爾,最適濃度為7到50毫摩爾,在超過200毫摩爾的更高濃度下,加入N-甲基化合物所獲得的效果與低于200毫摩爾濃度下N-甲基化合物獲得的效果比較,趨向不明顯。含有N-甲基化合物的天然物質(zhì)用量的選擇,要使其N-甲基化合物濃度達(dá)到上述要求,但這種濃度需要用比常規(guī)培養(yǎng)所用的天然物質(zhì)量要大,由此微生物的生長相反受到天然物質(zhì)中N-甲基化合物以外成份的影響,從而阻止霉病霉素的產(chǎn)生。這時,最好把N-甲基化合物與天然物質(zhì)聯(lián)合使用。考慮到操作方便和有效性,培養(yǎng)基中加入N-甲基化合物的時間。最好是在接種微生物到培養(yǎng)基中以前,但N-甲基化合物也可以在培養(yǎng)過程中的適當(dāng)時間加入。
此外,在本發(fā)明的方法中,為了獲得更多的霉病霉素,培養(yǎng)基中可加入5-羥甲基胞嘧啶或一種能在培養(yǎng)基中能生成5-羥甲基胞嘧啶物質(zhì)。5-羥甲基胞嘧啶或在培養(yǎng)基中能生成5-羥甲基胞嘧啶物質(zhì)的濃度,以5-羥甲基胞嘧啶表示的適量為0.01~1.0%(重量/體積),最適為0.03~0.5%(重量/體積)。培養(yǎng)基中加入這些物質(zhì)的時間最好在有效的培養(yǎng)開始以前,但也可在培養(yǎng)過程中的適當(dāng)時期加入。
雖然表面培養(yǎng)是可行的,但通氣的深層培養(yǎng)通常更適用。在進(jìn)行通氣深層培養(yǎng)時,培養(yǎng)基的PH適宜在微酸到微堿的范圍內(nèi),培養(yǎng)溫度最好保持在15-40℃,特別在24-34℃。這些培養(yǎng)條件當(dāng)然可以按所應(yīng)用的微生物的特殊菌株,外部條件和內(nèi)部因素進(jìn)行控制和選擇,以得到滿意的結(jié)果。不管怎樣,一般在開始培養(yǎng)后4~14天能獲得含有大量霉病霉素的培養(yǎng)液。為了從培養(yǎng)液中回收霉病霉素,最好使用從培養(yǎng)液中分離微生物代謝物的常規(guī)方法。例如,由于霉病霉素是一種水溶性堿,其大部分存在于培養(yǎng)液的液體部分,通過過濾或離心可先把細(xì)胞從培養(yǎng)液中除去。然后把這樣得到的液體部分加入適當(dāng)?shù)奈絼┤缁钚蕴?、吸附樹脂、陽離子交換樹脂、活性氧化鋁或硅膠,或者用分子篩,使活性部分吸附在其上面的。然后,用水溶性的有機(jī)溶劑水溶液如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等等,以及酸性、堿性緩沖液作成水溶液和無機(jī)或有機(jī)鹽的水溶液作為溶劑去洗脫活性部分。這些分離步驟也可以適當(dāng)?shù)嘏浜线M(jìn)行,活性部分可濃縮并粉碎以得到單體或鹽形式的霉病霉素。
在本發(fā)明生產(chǎn)霉病霉素的方法中所使用的屬于鏈輪絲菌屬抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產(chǎn)霉病霉素的菌株,可通過把屬于鏈輪絲菌屬的產(chǎn)霉病霉素菌株誘導(dǎo)突變成抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸菌株而獲得。進(jìn)行誘導(dǎo)突變的屬于鏈輪絲菌屬產(chǎn)霉病霉素的菌株,常用的是裂生鏈輪絲菌E5-24-5(這里或以后都稱為“親本菌株”)。這個親本菌株,于1981年6月12日已保藏在IFO,保藏號為IFO-14125,并在1981年6月24日也已保藏在FRI,保藏號為FERM P-6052。為了引起菌株突變產(chǎn)生抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸的菌株,應(yīng)用的突變方法例如,應(yīng)用屬于鏈輪絲菌屬產(chǎn)霉病霉素菌株的孢子或菌絲進(jìn)行紫外線照射,或應(yīng)用屬于鏈輪絲菌屬產(chǎn)霉病霉素的菌株與具有結(jié)構(gòu)式為
〔Ⅳ〕的N-甲基N′-硝基-N-亞硝基胍接觸的方法,以及把屬于鏈輪絲菌屬產(chǎn)霉病霉素的菌株生長在含有其結(jié)構(gòu)式
〔Ⅴ〕的D-4-氨基-3-異噁唑酮(俗名“環(huán)絲氨酸”)的培養(yǎng)基上的方法,或者把這些方法適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合使用。
例如,當(dāng)采取用屬于鏈輪絲菌屬產(chǎn)霉病霉素菌株的孢子或菌絲用紫外線照射的方法進(jìn)行突變時,親本菌株的孢子或菌絲用10~100瓦,最好是30~60瓦的紫外燈進(jìn)行紫外線照射。紫外線波長通常是130~350毫微米,最好為190~290毫微米。照射時間通常30秒到5分鐘,最好為60秒到90秒。應(yīng)當(dāng)把親本菌株的孢子和菌絲懸浮在無菌水中后再進(jìn)行照射。例如,將親本菌株的孢子懸浮在無菌水中,置30瓦紫外燈下方30厘米處,攪拌下照射90分鐘(波長2537
)以引起突變。
在采用把屬于鏈輪絲菌屬產(chǎn)霉病霉素的菌株與N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(Ⅳ)接觸的方法進(jìn)行突變時,最好把菌株的孢子或單個細(xì)胞與化合物〔Ⅳ〕接觸。接觸可用任何一種方式進(jìn)行,通常是用相互混合。進(jìn)行接觸時的溫度范圍從0℃到50℃,最好為10℃到40℃,所需時間范圍常從10秒到3小時,最好是10分鐘到2小時。產(chǎn)霉病霉素菌株的孢子或單細(xì)胞可分散在適當(dāng)?shù)姆稚⑴囵B(yǎng)基中,此培養(yǎng)基由,1到9%(重量/體積)蔗糖、1到6%(重量/體積)谷氨酸鈉、0.001~0.1%(重量/體積)吐溫-80(由Kao Atlas Co.,Ltd.生產(chǎn))和無菌水組成,培養(yǎng)基事先在110~130℃高壓蒸汽滅菌10~30分鐘?;衔铩并簟晨扇芙庠诰彌_液如三氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)中后使用,其濃度為1.0到5000微克/毫升,最好為100到200微克/毫升。另外,在采用讓屬于鏈輪絲菌屬產(chǎn)霉病霉素株生長在含有環(huán)狀絲氨酸〔Ⅴ〕的培養(yǎng)基上的方法進(jìn)行突變時,最好把產(chǎn)霉病霉素菌株培養(yǎng)在含環(huán)狀絲氨酸〔Ⅴ〕量為10~100微克/毫升的培養(yǎng)基上,最適為20~60微克/毫升。其它的培養(yǎng)條件可從前述的與培養(yǎng)抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產(chǎn)霉病霉素菌株有關(guān)的培養(yǎng)條件中適當(dāng)?shù)剡x擇。
從用上述引起突變的方法獲得的突變體中選擇抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產(chǎn)霉病霉素的菌株。也可按照在放線菌領(lǐng)域中通常使用的篩選方法進(jìn)行選擇。例如把孢子懸浮液、孢子混合液或經(jīng)突變處理獲得的生長菌株涂布或移種到含有絲氨酸氧肟酸鹽(40到200微克/毫升,最好為60到120微克/毫升)或刀豆氨酸(100到300微克/毫升,最好為110到240微克/毫升)的量足以阻止親本菌株生長的培養(yǎng)基上,然后,分離生長在培養(yǎng)基上的菌株?;蛘撸褢腋∫?,混合液或經(jīng)突變處理獲得的生長菌株涂布在含有5-羥甲基胞嘧啶生物合成的抑制劑-氨基蝶吟(2到50微克/毫升,最好為5到20微克/毫升)的培養(yǎng)基上,然后讓菌株生長,接著切下一塊瓊脂,用常規(guī)方法測定這塊瓊脂的抗菌活力(測定菌紅色酵母),篩選那些表現(xiàn)抗菌活力強(qiáng)的菌株,從而確定篩選出有絲氨酸氧肟酸鹽抗性優(yōu)良的產(chǎn)霉病霉素菌株。通過重復(fù)上述獲得產(chǎn)霉病霉素菌株抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸鹽方法,抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產(chǎn)霉病霉素菌株的性能得到進(jìn)一步提高。經(jīng)上述的產(chǎn)霉病霉素菌株對絲氨酸氧肟酸鹽或?qū)Φ抖拱彼岬目剐酝蛔儯a(chǎn)霉病霉素菌株也能同時獲得抗絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸的抗性。這些菌株也包括在本發(fā)明屬于鏈輪絲菌屬抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸菌株的類型中。
通過上述本發(fā)明的方法,制得的霉病霉素能安全地植物上用作防止和治療白粉病制劑的有效成份,或作為殺菌或殺螨劑的有效成份。(U.S.P.4007267,英國專利號1507193)
本發(fā)明中屬于鏈輪絲菌屬,抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸的產(chǎn)霉病霉素菌株,除了具有對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸高抗性外,在5-羥甲基胞嘧啶生物合成中有高的活力。
試驗(yàn)實(shí)例1在由2%蔗糖,0.5%可溶性淀粉,0.12%硝酸銨,0.25%磷酸二氫鉀、0.005%硫酸鎂、0.0025%酪蛋白氨基酸、0.0025%酵母浸出液和2.0%瓊脂粉(%指重量/體積)組成的瓊脂培養(yǎng)基(pH7.0)中加入各種不同濃度的絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸。這樣配制成的培養(yǎng)基經(jīng)120℃高壓蒸汽滅菌15分鐘后,倒入培養(yǎng)皿中,每皿20毫升。冷卻后,每皿培養(yǎng)基上涂布如下試驗(yàn)菌株的孢子。培養(yǎng)皿放在28℃下培養(yǎng)10天,確定了MIC即最小抑制生長濃度如表2所示。
試驗(yàn)菌株(1)裂生鏈輪絲菌E5-24-5(2)裂生鏈輪絲菌CR3-182(3)裂生鏈輪絲菌CVR-48(4)裂生鏈輪絲菌CVR-16表2菌株 最小抑制生長濃度(微克/毫升)絲氨酸氧肟酸鹽 刀豆氨酸(1) 40 100(2) 70 120(3) 100 200(4) 40 400
試驗(yàn)實(shí)例2配制由2.5%葡萄糖、2.0%玉米漿、1.0%棉籽粉(商品名Proflo,Trader Oil Mill Co.)、0.3%硫酸銨、0.05%硫酸鎂和0.3%碳酸鈣(%指重量/體積)組成的培養(yǎng)基,向其中滴加20%(重量/體積)苛性鈉水溶液以調(diào)節(jié)pH為7.0。這樣制得的培養(yǎng)基倒入200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中,每瓶25毫升,接著在120℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。這些培養(yǎng)基上分別接種裂生鏈輪絲菌E5-24-5,CR3-182、CVR-48和CVR-16菌種的孢子,在28℃200rpm下旋搖培養(yǎng)20小時以得到種子培養(yǎng)液。然后配制由11%葡萄糖、3.0%山梨醇、3.0%酪素、0.5%玉米漿、20%Preflo、0.5%硫酸銨、0.5%硝酸銨、0.1%氯化膽堿、0.005%硫酸鎂、0.005%硫酸鐵和0.003%硫酸銅(%指重量/體積)組成的培養(yǎng)基,向其中滴加20%(重量/體積)苛性鈉水溶液以調(diào)節(jié)pH為7.0。培養(yǎng)基中加入碳酸鈣使其濃度達(dá)1%(重量/體積)接著充分混合。這樣制得的培養(yǎng)基倒入200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中,每瓶25毫升,隨之在120℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。每瓶培養(yǎng)基(25毫升)中加入上述的種子培養(yǎng)液2毫升,在28℃以200轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)3~5天。然后,按照(1985)“發(fā)酵工業(yè)月刊”63卷17頁所述的步驟制備無細(xì)胞提取液,進(jìn)行酶反應(yīng)和5-羥甲基胞嘧啶的測定,獲得結(jié)果如表3所示的產(chǎn)5-羥甲基胞嘧啶的活力。
表3菌株產(chǎn)5-羥甲基胞嘧啶的活力*(毫微摩爾/分/毫克蛋白)E5-24-5 0.17CR3-182 0.24CVR-48 0.27CVR-16 0.19*3天,4天,5天培養(yǎng)后的平均值。
實(shí)例1(1)在裂生鏈輪絲菌E5-24-5(FERM P-6052,IFO-14125)的斜面培養(yǎng)基上前面收集孢子和氣生菌絲,并放在由3%蔗糖、2%谷氨酸鈉和0.01%吐溫-80組成的分散培養(yǎng)基上(經(jīng)120℃高壓蒸汽滅菌15分鐘)?;旌弦河锰沾蓜驖{器充分研磨,研磨液用Toyo 101號濾紙(由Toyo Filter Paper Co.,Ltd.生產(chǎn))過濾得到濾液為孢子和氣生菌絲碎片的懸浮液(25毫升)。
(2)在由(1)制得的懸浮液中加入等體積的溶解在三氨基甲烷-鹽酸緩沖液(0.1M,pH7.5)中的N-甲基N′-硝基-N-亞硝基胍,使其濃度達(dá)2毫克/毫升。混合液在28℃搖動90分鐘。把這樣得到的混合液涂布在含有濃度為30微克/毫升環(huán)狀絲氨酸的瓊脂平板培養(yǎng)基(pH7.0)上,在28℃靜止培養(yǎng)14天,該平板培養(yǎng)基的其他成份為2%蔗糖、0.5%可溶性淀粉、0.2%硝酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鉀、0.05%硫酸鎂、0.0015%硫酸鐵和2.0%瓊脂粉(%指重量/體積)。在長出的菌落中,分離出100個形態(tài)正常具有氣生菌絲的菌落。這些菌落分別用無菌玻璃棒研磨,每個被研磨菌落中加入10毫升無菌水,然后用Toyo 101號濾紙過濾得濾液。把濾液涂布在不含環(huán)狀絲氨酸的瓊脂平板培養(yǎng)基上,28℃靜止培養(yǎng)10天。把獲得的菌落分別轉(zhuǎn)接到瓊脂斜面上(培養(yǎng)基成份與上述的瓊脂平板培養(yǎng)基成份相同)。在28℃靜止培養(yǎng)10天。從斜面培養(yǎng)基表面刮面收集氣生菌絲和孢子,接著通過上述(1)中所述的懸浮、研磨、用濾紙過濾等步驟,制得100個懸浮液樣品。
(3)取第(2)步制備的100個懸浮液樣品(活菌量約1×105)分別涂布在100個對應(yīng)編號的各含有10微克/毫升氨基蝶呤的瓊脂平板培養(yǎng)基的整個表面上,28℃下靜止培養(yǎng)10天。利用鉆孔器打出一個園柱狀塊(直徑6毫米,高約4毫米),并轉(zhuǎn)移到測定其抗菌活力的培養(yǎng)基上(測試菌紅色酵母,肉汁瓊脂培養(yǎng)基,pH7.0)。把這樣處理過的培養(yǎng)基在30℃放置過夜。其中有5個懸浮液樣品顯示較大的(直徑14毫米或更大)抑菌圈(抑制生長圈)。
(4)第(2)步得到的100個懸浮液樣品分別用無菌水稀釋使每個樣品含活菌數(shù)為1×105/毫升。每個樣品取20微升稀釋后的懸浮液涂布在各含有40毫克/毫升絲氨酸氧肟酸鹽的相應(yīng)編碼瓊脂平板培養(yǎng)基上,28℃下靜止培養(yǎng)14天。在100個樣品中,觀察到有在7個培養(yǎng)基上的生長,其中有5個樣品都顯示如上第(3)步的那樣較大抑菌圈。在5個樣品中有一個突變菌株形成如上第(3)步所述的最大抑菌圈,分離后標(biāo)為裂生鏈輪絲菌CR1-18。
實(shí)例2用實(shí)例1中獲得的CR1-18菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5,按實(shí)例1的第(1)和(2)步的相同方法制備這菌株的150個懸浮液樣品。按照實(shí)例1中第(3)和(4)步方法,從這些樣品中分離出裂生鏈輪絲菌CR2-125〔只要在第(4)步使用含濃度為50毫克/毫升的絲氨酸氧肟酸鹽的瓊脂平板培養(yǎng)基〕實(shí)例3用實(shí)例2制得的CR2-125菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5,按實(shí)例1中的第(1)和(2)步相同方法制備這菌株200個懸浮液樣品。按實(shí)例1中的第(3)和(4)步方法從這些樣品中分離出裂生鏈輪絲菌CR3-182(FERM P-8334,IFO-14448)〔只要在第(4)步使用含濃度為6.0毫克/毫升絲氨酸氧肟酸鹽的瓊脂平板培養(yǎng)基〕。
實(shí)例4用實(shí)例3獲得的CR3-182菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5,按實(shí)例1中的第(1)和(2)步相同方法從這菌株制備300個懸浮液樣品。按實(shí)例1中的第(3)和(4)步方法從這些樣品中分離出裂生鏈輪絲菌CR4-257〔只要在第(4)步使用含濃度為80微克/毫升絲氨酸氧肟酸鹽的瓊脂平板培養(yǎng)基〕。
實(shí)例5用實(shí)例4獲得的CR4-257菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5,按實(shí)例1中的第(1)和(2)步相同方法從這菌株制備100個懸浮液樣品。把每個懸浮液樣品涂布在含有濃度為190毫克/毫升刀豆氨酸的瓊脂平板培養(yǎng)基上。100個樣品在28℃下靜止培養(yǎng)14天。把只一個樣品中出現(xiàn)的菌落移接到由2.0%基糖,0.5%可溶性淀粉、0.12%硝酸銨、0.25%磷酸二氫鉀、0.005%硫酸鎂、0.0025%酪蛋白氨基酸、0.0025%酵母浸出液和2.0%瓊脂(%指重量/體積)組成的培養(yǎng)基上(pH7.0),在28℃下靜止培養(yǎng)10天獲得具有抗絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸特性的突變菌株CVR-48(FERM P-8333 IFO-14449)。
實(shí)例6在成份由2.5%葡萄糖、2%玉米漿、1.0%棉籽粉(商品名Proflo,由Trader Oil Mill Co.生產(chǎn))。0.3%硫酸銨、0.05%硫酸鎂和0.3%碳酸鈣(%指重量/體積)組成的培養(yǎng)基中滴加20%(重量/體積)苛性鈉水溶液使pH達(dá)7.0。200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中加入25毫升培養(yǎng)基,120℃下高壓蒸汽滅菌15分鐘。把裂生鏈輪絲菌E5-24-5、CR3-182和CVR-48菌株的孢子分別接種到培養(yǎng)基上,并在28℃,200轉(zhuǎn)下轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)20小時,得到所需的各個種子培養(yǎng)液。然后,制備含11%(重量/體積)葡萄糖、3.0%山梨醇、3.0%干酪素、0.5%玉米漿、2.0%Proflo、0.5%硫酸銨、0.5%硝酸銨、0.1%氯化膽堿、0.005%硫酸錳、0.005%硫酸鐵和0.003%硫酸銅(%指重量/體積)的培養(yǎng)基,在其中滴加20%(重量/體積)的苛性鈉水溶液以使pH達(dá)7.0。在這培養(yǎng)基中加入碳酸鈣使其濃度達(dá)1%(重量/體積),把混合液充分搖動,接著在每個200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中加入25毫升培養(yǎng)基,于120℃高壓蒸汽滅菌20分鐘制得發(fā)酵培養(yǎng)基。每瓶這樣制得的培養(yǎng)基中接入2毫升上述的種子培養(yǎng)液。在28℃200轉(zhuǎn)下?lián)u動發(fā)酵培養(yǎng)10天。培養(yǎng)完后,按照“發(fā)酵工程雜志”62卷537頁(1984)上描述的高效液相色譜方法定量測定霉病霉素。按上述方法進(jìn)行的霉病霉素生產(chǎn)試驗(yàn),所得試驗(yàn)結(jié)果如表4所列。
表4菌株 產(chǎn)生霉病霉素的數(shù)量(微克/毫升)E5-24-5 3887CR3-182 5755CVR-48 8000實(shí)例7在與實(shí)例6相同的條件下,把裂生鏈輪絲菌CVR-48進(jìn)行發(fā)酵。收集發(fā)酵液,把1升發(fā)酵液經(jīng)離心獲得的上清液,然后通過由2.5升離子交換樹脂Amberlite IRC-50(H+型)(Rohm & Haas Co.)裝成的柱。柱用水洗,再用2.5升0.5%(重量/體積)氨水進(jìn)行洗脫?;钚圆糠?按實(shí)例6的定量測定方法)讓其流到由250毫升層析用活性炭(由Takeda Chemical Industries,Ltd.生產(chǎn))裝成的柱中,使之吸附。用1.25升丙酮-水(3∶7)混合液洗脫。收集和濃縮洗脫的活性部分。在濃縮液中滴加500毫升甲醇促使粗的霉病霉素沉淀。過濾收集粉狀霉病霉素粗制品。用水溶解6.5克這樣的粉末,并使其流過由125毫升Amberlite CG-50(H+型)(由Rohm & Haas Co.生產(chǎn))裝成的柱。柱用50毫升水清洗,接著用1.25升0.5%(重量/體積)氨水洗脫。收集活性部分并上由250毫升活性碳裝成的吸附柱。用1.25升丙酮-0.1當(dāng)量濃度甲酸(2∶8)進(jìn)行分部洗脫,濃縮活性部分。在濃縮液中加入甲醇使霉病霉素沉淀,用離心法收集沉淀,在減壓下干燥獲得5.5克霉病霉素甲酸鹽。在這甲酸鹽的物化性質(zhì)中,熔點(diǎn),比旋度(〔α〕24D水中濃度1.0,在0.1當(dāng)量HCl中濃度1.0)和271毫微米和280毫微米處紫外吸收值完全符合“抗菌素雜志”1978年31卷6期第523頁所報道的。
實(shí)例8在按實(shí)例1第(1)步使用裂生鏈輪絲菌E5-24-5制得的懸浮液中,加入等體積的溶解在三氨基甲烷-鹽酸緩沖液(0.1摩爾,pH7.5)中的N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍溶液,使其濃度達(dá)2毫克/毫升?;旌弦?8℃下?lián)u動90分鐘。把這樣得到的上述混合液涂布在含300微克/毫升L-刀豆氨酸的瓊脂平板培養(yǎng)基上,28℃靜止培養(yǎng)14天。所得菌落分別移接到斜面瓊脂培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成份與上述的瓊脂平板培養(yǎng)基相同)。28℃下靜止培養(yǎng)10天獲得14個具有抗刀豆氨酸特性的突變菌株。
在與實(shí)例6相同的條件下,這些抗刀豆氨酸的突變菌株和親本菌株(E5-24-5)進(jìn)行發(fā)酵,比較它們霉病霉素的產(chǎn)率。在它們中分離到表現(xiàn)最高產(chǎn)率的一個突變菌株,并編為裂生鏈輪絲菌CVR-16(FERM P-8874,IFO-14527)。親本菌株和突變菌株CVR-16按上述方法產(chǎn)生霉病霉素的量如表5所示。
表5菌株 產(chǎn)生霉病霉素的數(shù)量(微克/毫升)E5-24-5 3900CVR-16 4680
從上表很明顯看出突變菌株CVR-16生產(chǎn)霉病霉素能力要比親本菌株高得多。
實(shí)例9在與實(shí)例6相同的條件下,把裂生鏈輪絲菌CVR-16進(jìn)行發(fā)酵。收集發(fā)酵液(1升),按實(shí)例7相同的步驟處理發(fā)酵液并分離和純化霉病霉素。通過這些步驟得到3.1克霉病霉素甲酸鹽。在這甲酸鹽的物化性質(zhì)中,熔點(diǎn)、比旋度和271毫微米和280毫微米處的紫外吸收值與文獻(xiàn)報道的完全符合(文獻(xiàn)在實(shí)例7中已講過)。
本發(fā)明生產(chǎn)霉病霉素的方法,包括屬于鏈輪絲菌屬對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的產(chǎn)霉病霉素的菌株的培養(yǎng),高效能的生產(chǎn)霉病霉素,因此是一個大量生產(chǎn)霉病霉素的在工業(yè)上優(yōu)越的發(fā)酵方法。
勘誤表
勘誤表
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)霉病霉素的方法,特征在于培養(yǎng)屬于鏈輪絲菌屬和對培養(yǎng)液中的絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的菌株,促使所說菌株合成和積累霉病霉素,并從所得的培養(yǎng)物液中回收霉病霉素。
2.如權(quán)利要求
1中所述的生產(chǎn)霉病霉素的方法,它的特征在于培養(yǎng)基中要含有至少3毫摩爾的N-甲基化合物。
3.如權(quán)利要求
(1)或權(quán)利要求
(2)所述的生產(chǎn)霉病霉素的方法,特征在于培養(yǎng)基中要含有5-羥甲基胞嘧啶。
4.對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的裂生鏈輪絲菌能夠生產(chǎn)霉病霉素。
專利摘要
霉病霉素,在農(nóng)業(yè)和園藝中用作抗菌劑,殺菌劑或殺螨劑,通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于鏈輪絲菌屬(Streptoverticillium),并且對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的產(chǎn)霉病霉素菌株,可以工業(yè)上便利地生產(chǎn)霉病霉素。上述培養(yǎng)基最好至少含有3毫摩爾的N-甲基化合物或/和含有5-羥甲基胞嘧啶,以促使所說菌株的合成積累霉病霉素,并從所得培養(yǎng)液中回收霉病霉素。
文檔編號C12P17/10GK86106265SQ86106265
公開日1987年8月12日 申請日期1986年8月20日
發(fā)明者沢田秀和 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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