專利名稱:新型的氨基甲?；痚po及其制備方法
引言本發(fā)明涉及一種新型的化合物，以及制備所述化合物的方法。該新型的化合物，氨基甲?；偌t細胞生成素(CEPO)，其特征是，在賴氨酸的全部或大部分伯胺上以及在分子的N-末端氨基酸上被氨基甲?；?，此外，在該化合物分子其它氨基酸的伯胺具有低水平的氨基甲?；４送?，該新型的化合物無聚集蛋白質(zhì)和聚合物，而且適合于在疾病治療的藥物組合物中應(yīng)用，例如中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，及其它表達重要的EPO受體的組織。本制備方法的另一個異常驚人的優(yōu)點是，該方法提供了一種產(chǎn)品，與從其它已知的述及促紅細胞生成素氨基甲?；椒ǐ@得的產(chǎn)品相比，其含有較少的聚集蛋白質(zhì)和較少的聚合物。
發(fā)明背景氨基甲?；疎PO的生物造血活性的減弱已揭示于Satake，R.等.(1990)Biochimica et Biophysica Acta；1038125-129，以及Mun，K-C.和Golper，TA.(2000)Blood Purif.；1813-17。Brines等2003，美國專利申請20030072737揭示造血活性的喪失并不干擾EPO的組織保護性能。
作為在蛋白質(zhì)純化中使用尿素的副反應(yīng)和作為高尿素血清水平的結(jié)果，蛋白質(zhì)的氨基甲?；菑V為人知的。這是由于尿素自然分解為氰酸鹽而引起的。氰酸鹽是造成蛋白質(zhì)伯胺的氨基甲?；脑?，從而蛋白質(zhì)的N-末端和賴氨酸易受氨基甲?；挠绊?圖1)。此外，易受氨基甲?；绊懙钠渌鼭撛诘陌被釟埢鶠榫彼?、半胱氨酸、酪氨酸、門冬氨酸、谷氨酸和組氨酸，然而反應(yīng)是pH依賴型的，并且不像N末端和賴氨酸殘基那樣容易地發(fā)生。
對揭示蛋白質(zhì)的氨基甲?；欠衲軌蚋纳苹驌p傷蛋白質(zhì)的生物活性的研究，其已由Hrkk，S.等(1992)Kidney International；411175-1181，Plapp，B.V.等(1971)Jour.Bio1.Chem.；246(4)939-945，Satake，R.等(1990)Biochimica et Biophysica Acta；1038125-129以及Mun，K-C.和Golper，T.A.(2000)Blood Purif.；1813-17進行。通過使用KCNO作為氰酸鹽的來源，他們研究了蛋白質(zhì)氨基甲?；纳飳W(xué)作用。他們都發(fā)現(xiàn)，由于氨基甲?；黾佣股飳W(xué)活性降低或改變。氨基甲?；某潭鹊脑u價是根據(jù)兩個分析方法1、使用三硝基苯磺酸(TNBS)分析法測定游離氨基的降低，和2、氨基酸分析法測定賴氨酸轉(zhuǎn)化成高瓜氨酸殘基。
Hrkk，S.等(1992)以2M KCNO于37℃下最大6小時氨基甲酰化低密度脂蛋白，但是，以TNBS測定法測定，沒有獲得完全氨基甲酰化的蛋白質(zhì)。
Plapp，B.V.等(1971)研究了時間的影響，并且以1M KCNO于37℃下處理24小時后，獲得幾乎完全氨甲酰基化的牛胰脫氧核糖核酸酶A。
Mun，K-C.和Golper，T.A.(2000)使用2M KCNO以最大6小時的反應(yīng)時間研究了時間的影響。他們還研究了于37℃下6小時全部反應(yīng)中增加KCNO濃度的影響。根據(jù)該試驗設(shè)計，Mun，K-C.和Golper，T.A.(2000)未能驗證氨基甲酰化的確切程度(請參考16頁33-35行)。
在本發(fā)明中，我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，EPO的氨基甲?；a(chǎn)生聚合物和聚集物，從而使它不適合于生物制藥。此外，我們發(fā)現(xiàn)這些聚合物和聚集物的產(chǎn)生依賴于氨基甲?；姆椒l件。因此，需要開發(fā)具有涉及pH、時間、氰酸鹽濃度、溫度、蛋白質(zhì)濃度和最重要的蛋白質(zhì)聚合程度的最佳參數(shù)的方法。本發(fā)明包括氨基甲?；淖罴逊椒ǎ删哂械投染酆虾途奂漠a(chǎn)品，此外，令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)獲得了針對N-末端和全部賴氨酸殘基(后者發(fā)生于特定的pH范圍)的完全氨基甲酰化的EPO。進行了本發(fā)明方法的隨后步驟，目的在于除去所生成的聚集物和聚合物。所得的氨基甲?；僂PO是一種新型的化合物，并連同包括該化合物的藥物組合物一起被要求于本申請中。
前已說明，氨基甲酰化程度依賴于氰酸鹽濃度和時間。然而，并未描述如何獲得生物制藥生產(chǎn)的能規(guī)?；陌被柞；姆椒?。
未達最佳標準的產(chǎn)品的聚集物的存在伴隨抗體的誘導(dǎo)作用。并且因此聚集物的存在造成生物制藥產(chǎn)品不適合用于人。
在本發(fā)明中描述的氨基甲酰化和純化方法引導(dǎo)出一種蛋白質(zhì)，其特征在于完全氨基甲?；?，具有盡可能最低生成量的聚合物或聚集物，和最小損失量的終產(chǎn)物。從而使之成為經(jīng)濟可行的步驟。
對氨基甲?；鞍踪|(zhì)的進一步處理提供了一種對生物制藥有用的產(chǎn)品，其僅具有由于聚集物和聚合物對蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的最低風險。
完全氨基甲?；u價的分析方法是除氨基酸分析以外的；TNBS對游離伯胺基團和產(chǎn)品的最終特征，以及通過MALDI-TOF消化的產(chǎn)品。
本發(fā)明的新型化合物，其為在分子的N-末端和賴氨酸的游離基團完全氨基甲?；拇偌t細胞生成素，并且進一步的，其未聚集和未聚合至高于2.5％的量，以及含有最小量的過-或次-氨基甲?；偌t細胞生成素，可用于制備藥物組合物，以治療對天然促紅細胞生成素的神經(jīng)保護作用響應(yīng)的疾病。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用于生物制藥生產(chǎn)的可規(guī)模化的蛋白質(zhì)氨基甲?；^程。而且，其涉及該方法的產(chǎn)品，和包含該化合物的藥物組合物，以及該組合物的用途。
本申請中描述的氨基甲?；图兓椒óa(chǎn)生一種蛋白質(zhì)，其特征在于完全氨基甲酰化的，具有盡可能最低地形成聚合物或聚集物，和最小量的終產(chǎn)物的損失。
該氨基甲?；椒▋?yōu)選地產(chǎn)生具有最低量的聚合物和聚集物的氨基甲酰化蛋白質(zhì)，使之成為一種經(jīng)濟可行的方法。該終產(chǎn)物還包含有限量的過-和/或次-氨基甲?；偌t細胞生成素的異型(每分子少于或多于9個氨基甲?；?。次-氨基甲?；疎PO含有少于9個氨甲?；鶜埢?，即，不是全部的8個賴氨酸和N-末端被氨基甲?；?。次-氨基甲酰化EPO可以具有少量的5個氨甲?；鶜埢⑶胰匀徊痪哂薪?jīng)典的促紅細胞生成素活性，使之適用于在本發(fā)明中使用。過-氨基甲?；疎PO具有多于9個氨甲酰基殘基，并且在除8個賴氨酸和N-末端以外的氨基酸上氨基甲?；?。CEPO可以具有15個之多的氨甲?；鶜埢?，并且仍然具有期望的效果，即，無經(jīng)典的促紅細胞生成素活性。至少約90％，并且極有可能為95％的CEPO異型在8個賴氨酸殘基和唯一的N-末端被氨基甲?；?br>氨基甲?；鞍踪|(zhì)的進一步處理，除去聚集的和聚合的產(chǎn)物，至最高3％或2.5％的水平，使產(chǎn)品僅有最小限度的由于聚集物和聚合物對蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的風險發(fā)生，從而可作為生物制藥使用。
對氨基甲?；u價的分析方法是除氨基酸分析以外的；TNBS對游離伯胺基團和產(chǎn)品的特征，以及通過MALDI-TOF和LC-MS/MS消化的產(chǎn)品。
發(fā)明詳述制備方法蛋白質(zhì)氨基甲?；姆椒ㄓ?步組成1.超濾濃縮2.氨基甲?；揎?.凝膠過濾脫鹽4.陰離子交換純化5.通過超-和透析過濾的濃縮和緩沖液交換6.0.22μm過濾本氨基甲?；椒ǖ钠鹗疾牧陷^好的是純化的人EPO，但可以是任意的動物或人種的EPO型，非限制性實例是合成的、重組人EPO或者生物學(xué)或化學(xué)修飾的人EPO，例如缺乏唾液酸基的EPO，人EPO的突變體，即，被引入氨基酸序列變化的分子，EPO碎片，EPO的肽，其它蛋白質(zhì)，或假如有多個蛋白質(zhì)需要氨基甲?；瘯r的蛋白質(zhì)的混合物。
該方法的第一步包括通過超濾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度，其中蛋白質(zhì)濃度是以保持低處理容積為目的的調(diào)節(jié)。0.05-10mg/ml或0.05-8mg/ml的蛋白質(zhì)濃度是優(yōu)選的實施方案。更優(yōu)選的實施方案為0.05-7mg/ml，并且最優(yōu)選的為2-5mg/ml。如果濃度增加則聚集物的形成增加。超濾優(yōu)選的通過BioMax(Millipore)以5kDa的MWCO的方式。其它濾器也可以使用。此外，蛋白質(zhì)的溶解度可以通過加入穩(wěn)定劑調(diào)節(jié)。
在完成濃縮步驟后，該蛋白質(zhì)溶液與K-硼酸鹽四水合物、K-氰酸鹽以pH7-11或pH7-10混合。在優(yōu)選的實施方案中，pH為8-10，并且最優(yōu)選為9.0。溫度范圍為0°-60℃或0°-50℃或0°-40℃或0°-＜37℃，但一個優(yōu)選的實施方案為30-34℃的溫度區(qū)間，優(yōu)選為32℃，時間窗為10分鐘-30天或30分鐘-30天或1小時-30天或1小時-20天或1小時-10天或1小時-5天或1小時-2天或1小時-26小時或18-26小時或優(yōu)選的22小時-26小時，最優(yōu)選的24小時。然而，如果其它方法參數(shù)即溫度、氰酸鹽濃度和蛋白質(zhì)濃度改變，這些優(yōu)選的區(qū)間也可以改變。
如果溫度低于該限度，產(chǎn)率將降低，因為氨基甲?；瘜⒎怕⑶倚实汀Ｈ绻麥囟认薅瘸?，由于聚集增加而使產(chǎn)率降低。另一個決定性的參數(shù)是時間，如果時間減少氨基甲?；瘜⒉煌耆?，或如果時間增加就可觀測到形成聚集物，從而得到較低的產(chǎn)率。
因此，提出了一種具有相關(guān)參數(shù)的方法，即，如果溫度降低，減少的氨基甲酰化反應(yīng)可以通過增加氰酸鹽濃度和/或反應(yīng)時間而補償。此外，如果反應(yīng)時間減少，減少的氨基甲?；磻?yīng)可以通過增加溫度和/或氰酸鹽濃度而補償。最后，在減少氰酸鹽濃度的方法中，減少的氨基甲酰化反應(yīng)可以通過增加反應(yīng)時間和/或溫度而補償。
因此，總之，為了獲得具有生成較低聚集物和聚合物的完全氨基甲酰化的分子，一個重要參數(shù)(時間、溫度、氰酸鹽濃度和蛋白質(zhì)濃度)的明顯改變將意味著一個或多個其它重要參數(shù)改變。
在質(zhì)子攝取和緩沖能力不足導(dǎo)致溶液的pH值漂移之下，由于氰酸鹽固有的水解和聚合，硼酸鹽緩沖液的濃度可以是0.05-2M，但在優(yōu)選的實施方案中為0.1-1M，并且最優(yōu)選0.5M。
此外氰酸鹽濃度優(yōu)選范圍為0.05-10M或0.05-8M或0.05-6M或0.05-4M或0.05-2M，優(yōu)選的實施方案為0.05-1M并且最優(yōu)選0.5M。
0.5M硼酸鹽緩沖液溶液的濃度是需要的，以控制由使用0.5M氰酸鹽濃度的質(zhì)子攝取引起的pH值漂移。可以使用應(yīng)用其它氰酸鹽和硼酸鹽的方法。另外，可以使用除硼酸鹽外的其它反應(yīng)緩沖液，例如，碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
蛋白質(zhì)和氰酸鹽的反應(yīng)混合物的脫鹽通過色譜凝膠過濾的方式進行。使用G-25 Fine(Amersham Biosciences)基質(zhì)?？刂平o柱上樣之前的死時間(hold up time)并且不應(yīng)超過2小時，因為這將引起進一步的氨基甲?；途酆衔镄纬伞５鞍踪|(zhì)的脫鹽和更換緩沖液可通過透析、透析-超濾或通過色譜凝膠過濾的方式進行?？梢允褂闷渌z過濾基質(zhì)例如交聯(lián)多糖或交聯(lián)混合多糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯的基質(zhì)或者天然陶瓷的基質(zhì)。此外，在該步驟中柱高是可以改變的。
可以調(diào)節(jié)氨基甲?；襟E，以獲得具有小于40％聚集物和聚合物的產(chǎn)品，或小于30％或小于25％或小于20％或小于15％或小于12.5％或小于10％或小于8％或小于7％。
聚集物和聚合物的去除是通過使用陰離子交換的純化步驟進行的。觀測到可以從起始材料的殘余物中或從聚集物/聚合物中分離氨基甲酰化EPO。流動緩沖液(running buffer)A為0.3％Tris(25mM)，0.3％(50mM)NaCl，pH8.5±0.2，洗脫緩沖液B0.3％Tris(25mM)，5.8％(1M)NaCl，pH8.5±0.2。梯度以0-30％進行，超過20柱體積產(chǎn)生理想的分離。純化步驟可產(chǎn)生小于3％聚集物和聚合物的產(chǎn)品，或小于2.5％或小于2％或小于1.5％或小于1％或小于約0.5％。
洗脫，收集以及氨基甲?；疎PO峰的混合集中影響被洗脫的蛋白質(zhì)的不均勻性即異型的分布。換言之，過-和次-氨基甲?；疌EPO的量將會依賴于收集和混合集中的過程而改變。狹窄的集中混合會導(dǎo)致過-和/或次-氨基甲?；偌t細胞生成素的含量降低。增加梯度的長度，通過除去某些物質(zhì)將會選擇出更確切的產(chǎn)物。
以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約40％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷陌被柞；疎PO的混合物是本發(fā)明的一個實施方案。更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約35％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷腃EPO。甚至更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約30％重量的過-和次-氨基甲酰化異型的CEPO。甚至更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約25％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷腃EPO。甚至更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約20％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷腃EPO。甚至更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約15％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷腃EPO。甚至更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約10％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷腃EPO。甚至更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約5％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷腃EPO。甚至更優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約2％重量的過-和次-氨基甲酰化異型的CEPO。最優(yōu)選的實施方案是，以ESI-質(zhì)譜法測定，具有小于約1％重量的過-和次-氨基甲?；愋偷腃EPO。
除了影響全部異型的含量，EPO氨基甲?；宓氖占突旌霞羞€影響過-氨基甲酰化CEPO的分布。優(yōu)選的以ESI-質(zhì)譜法測定，過-氨基甲?；疌EPO異形的量小于約35％重量。甚至更優(yōu)選的以ESI-質(zhì)譜法測定，過-氨基甲酰化CEPO的量小于約30％重量，并且甚至更優(yōu)選的以ESI-質(zhì)譜法測定，過-氨基甲?；疌EPO的量小于約25％重量，并且甚至更優(yōu)選的小于約20％，并且甚至更優(yōu)選的小于約15％。最優(yōu)選的以總CEPO重量計過-氨基甲?；疎PO不多于約10％、約5％或約1％。
可以使用其它運行和洗脫緩沖溶液，同樣可以使用其它陰離子交換基質(zhì)和電荷過濾器。非限制性的基質(zhì)實例為交聯(lián)多糖或交聯(lián)混合多糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或天然陶瓷基質(zhì)。
此外，還可以使用聚苯乙烯、疏水作用色譜、反相色譜法、親合色譜、分子排阻色譜純化。
在下面的濃度和緩沖液調(diào)節(jié)的步驟中，使用透析-超濾正切流動過濾單元。氨基甲酰化EPO調(diào)節(jié)至濃度＞0.5mg/ml，緩沖溶液換成20mM檸檬酸鹽、100mM NaCl緩沖液。濃度和緩沖溶液的變化是通過BioMax(Millipore)以5kDa的MWCO的方法進行的。其它過濾器也可以使用。
最后，純化的生物制藥的藥品使用Millipak(Millipore)0.22μm過濾，以除去微生物。任何0.22μm過濾器均可使用。
使用該方法，獲得了完全氨基甲酰化EPO，其經(jīng)SEC-HPLC測定小于3％或優(yōu)選小于2.5％的聚集物。使用氨基酸分析測定賴氨酸轉(zhuǎn)化為高瓜氨酸，驗證8個賴氨酸殘基的完全氨基甲?；?。此外，氨基甲?；又褂肨NBS分析測定伯胺，由此顯示完全的氨基甲?；馁嚢彼岷蚇-末端。
此外，使用MALDI-TOF，充分的鑒定測定了對肽N糖苷酶處理的蛋白質(zhì)和具有N-聚糖的蛋白質(zhì)的完整質(zhì)量(intact mass)的變化。另外，MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋分析/LC-MS/MS分析表明顯示全部的8個賴氨酸和N-末端被氨基甲?；Ｎ礄z測到其它氨基甲?；被?，并且未檢測到聚糖的修飾。而且，在終產(chǎn)物中獲得了EPO的過-和次氨基甲?；问降牧繙p少。該產(chǎn)物是新型的并被要求其權(quán)利。
本發(fā)明的一個實施方案為氨基甲酰化后陰離子交換純化前獲得的混合物，包括氨基甲酰化EPO，其小于約40％重量的聚集物和聚合物、或小于約30％、或小于約25％、或小于約20％、或小于約15％、或小于約12.5％、或小于約10％、或小于約8％、或小于約7％，和一定量的氰酸鹽。
本發(fā)明進一步的實施方案為陰離子交換純化后獲得的混合物，包括氨基甲?；疎PO，其小于約3％重量的聚集物和聚合物、或小于約2.5％、或小于約2％、或小于約1.5％、或小于約1％、或小于約0.5％。進一步的，該混合物包括含有過-或次-氨基甲酰化EPO的異型，其量為小于約40％總氨基甲?；疎PO的重量、或者更優(yōu)選小于約35％、或者小于約30％、或者小于約25％、或者小于約20％、或者小于約15％、或者小于約10％、或者小于約7.5％、或者小于約5％、或者小于約2％，并且最優(yōu)選小于約1％。進一步的，混合物中過-氨基甲酰化EPO的量為小于約35％總氨基甲?；疎PO的重量、或更優(yōu)選的小于約30％、或小于約25％、或小于約20％、或小于約15％、或小于約10％、或小于約7.5％、或小于約5％、或小于約2％，并且最優(yōu)選小于約1％。
本發(fā)明的藥物組合物本發(fā)明的一方面是本發(fā)明化合物在制備藥物組合物中的用途，用于人或哺乳動物以治療下述癥狀。
本發(fā)明的一個實施方案為藥物組合物，包括治療有效量的氨基甲酰化EPO，其具有小于約3％重量的聚集物和聚合物、或更優(yōu)選小于約2.5％、或小于約2％、或小于約1.5％、或小于約1％并且最優(yōu)選小于約0.5％，并且進一步的，該組合物包括含有過-或次-氨基甲酰化EPO的異型，為小于約40％總氨基甲?；疎PO的重量、或者更優(yōu)選小于約35％、或者小于約30％、或者小于約25％、或者小于約20％、或者小于約15％、或者小于約10％、或者小于約5％、或者小于約3％、或者小于約2％，并且最優(yōu)選小于約1％。進一步的，組合物中過-氨基甲?；疎PO的量小于約35％總氨基甲?；疎PO的重量、或更優(yōu)選的小于約30％、或小于約25％、或小于約20％、或小于約15％、或小于約10％、或小于約5％、或小于約3％、或小于約2％，并且最優(yōu)選小于約1％。
在本發(fā)明一方面的實施中，如上述包含本發(fā)明化合物的藥物組合物可以任意途徑給哺乳動物施用，其在血管系統(tǒng)中提供了本發(fā)明化合物足夠的濃度，以容許穿過上皮細胞屏障易位，并對易感細胞產(chǎn)生有益作用。當以灌注組織或器官為目的使用時，預(yù)期有相似的結(jié)果。在當細胞或組織是非血管化和/或給藥是通過以本發(fā)明組合物沐浴(bath)細胞或組織時，在該實例中，該藥物組合物提供了有效應(yīng)答細胞一有益量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明化合物穿過而可以易位的上皮細胞屏障，其包括存在于哺乳動物中的緊密連接、突破連接、有孔連接和任意其它類型的上皮屏障。優(yōu)選的屏障為上皮細胞緊密連接，但本發(fā)明不限于此。
本發(fā)明的前述化合物廣泛用于治療或預(yù)防處理人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要有神經(jīng)或精神癥狀，眼科疾病，心血管疾病，心肺性疾病，呼吸系統(tǒng)疾病，腎臟、泌尿和生殖疾病，胃腸道疾病以及內(nèi)分泌和代謝疾病。特別是，這些癥狀和疾病包括低氧癥狀，其不利地影響可興奮組織，例如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織或心臟中的可興奮組織，或者視網(wǎng)膜組織，諸如，例如，腦、心或視網(wǎng)膜/眼。因此，本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防對可興奮組織的損傷，其起因于在多種癥狀和狀況下的低氧癥狀。該癥狀和狀況的非限制性舉例提供于下述的表中。
在根據(jù)本發(fā)明的可治療的神經(jīng)元組織病理學(xué)保護的實施例中，該病理包括那些由于神經(jīng)元組織的氧合減少產(chǎn)生的。任何減少給予神經(jīng)元組織可利用的氧的情況，其導(dǎo)致應(yīng)激、損害及最終神經(jīng)元細胞死亡，可通過本發(fā)明的方法治療。通常所說的低氧和/或局部缺血，這些癥狀產(chǎn)生于或包括，但不限于，中風、血管閉塞、產(chǎn)前或產(chǎn)后缺氧、窒息、氣哽、近乎溺死、一氧化碳中毒、煙吸入、包括外科和放射的創(chuàng)傷、昏厥、癲癇、低血糖、慢性阻塞性肺病、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征、低血壓暈厥、敗血癥性休克、過敏性休克、胰島素休克、鐮狀細胞危象、心搏停止、節(jié)律障礙、氮麻醉以及由心肺分流術(shù)引起的神經(jīng)缺損。
在一個實施方案中，例如，包含本發(fā)明的組合物的特定的藥物組合物可用于預(yù)防損傷或組織損傷，其產(chǎn)生于手術(shù)操作期間的損傷或組織損傷的危險，例如，舉例，腫瘤切除術(shù)或動脈瘤修復(fù)。低血糖引起或起因于它的其它可通過描述于此的方法治療的病狀，包括胰島素過量，還指醫(yī)源性高胰島素血癥、胰島素瘤、生長激素缺乏、腎上腺皮質(zhì)功能減退、藥物過量和某些腫瘤。
起因于可興奮神經(jīng)元組織損傷的其它病狀包括癲癇疾患，例如癲癇、驚厥或慢性癲癇疾病。其它可治療的癥狀和疾病包括，但不限于，疾病例如中風(缺血性中風、蛛網(wǎng)膜下腔出血、大腦內(nèi)出血)、多發(fā)性硬化癥、低血壓、心搏停止、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、腦性麻痹、腦或脊髓創(chuàng)傷、愛滋病癡呆、年齡相關(guān)性認知功能喪失、記憶喪失、肌萎縮側(cè)索硬化、癲癇疾患、酒精中毒、視網(wǎng)膜缺血、青光眼引起的視神經(jīng)損傷、神經(jīng)元損耗。
本發(fā)明的特定的組合物和方法可用于治療由疾病癥狀或各種創(chuàng)傷引起的炎癥，例如物理或化學(xué)引起的炎癥。該創(chuàng)傷可包括脈管炎、慢性支氣管炎、胰腺炎、骨髓炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、視神經(jīng)炎、顳動脈炎、腦炎、腦脊膜炎、橫貫性脊髓炎、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、necrotizing fascilitis、肝炎和壞死性小腸結(jié)腸炎證據(jù)表明，活化的星形膠質(zhì)細胞可通過產(chǎn)生神經(jīng)毒素而對神經(jīng)元產(chǎn)生細胞毒作用。氧化亞氮、活性氧簇和細胞因子是從神經(jīng)膠質(zhì)細胞中釋放的，以適應(yīng)腦缺血(見Becker，K.J.2001.Targeting the centralnervous system inflammatory response in ischemic stroke.Curr OpinionNeurol 14349-353以及Mattson，M.P.，Culmsee，C.，和Yu，Z.F.2000.Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke.Cell TissueRes301173-187.)。研究進一步證明，在神經(jīng)變性模型中，神經(jīng)膠質(zhì)的活化和隨后炎性細胞因子的產(chǎn)生依賴于初級神經(jīng)元的損傷(見Viviani，B.，Corsini，E.，Galli，C.L.，Padovani，A.，Ciusani，E.和Marinovich，M.2000.Dying neural cells activate glia through the release of a protease product.Glia 3284-90和Rabuffetti，M.，Scioratti，C.，Tarozzo，G.，Clementi，E.，Manfredi，A.A.，和Beltramo，M.2000.Inhibition of caspase-1-likesactivity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes longlasting nenroprotection in cerebral ischemia through apoptosisreduction and decrease of proinflammatory cytokines. J Neurosci204398-4404)。炎癥和神經(jīng)膠質(zhì)活化通常是神經(jīng)變性疾病的不同形式，包括腦缺血、腦外傷和實驗性過敏性腦脊髓炎，在這些疾病中促紅細胞生成素產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。促紅細胞生成素產(chǎn)生的細胞因子的抑制作用能夠，至少部分地，介導(dǎo)它的保護作用。然而，與“典型的”抗炎細胞因子例如IL-10和IL-13不同，其直接地抑制腫瘤壞死因子的生成，促紅細胞生成素僅在神經(jīng)元出現(xiàn)死亡時顯示出活性。
雖然不希望被任何特別的理論束縛，該抗炎活性似乎可能被假想地由多種非限制性理論解釋。首先，由于促紅細胞生成素抑制細胞凋亡，由細胞凋亡引起的發(fā)炎可以被預(yù)防。此外，促紅細胞生成素可以防止分子信號從瀕死的神經(jīng)元中釋放，該神經(jīng)元刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞或者直接地作用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞減少其對這些產(chǎn)物的反應(yīng)。另一可能性是促紅細胞生成素靶向于更多鄰近的引起細胞凋亡和炎癥的炎癥級聯(lián)反應(yīng)成員(例如，半胱天冬酶1(caspase 1)、活性氧或氮媒介物)。
此外，促紅細胞生成素顯示提供抗炎保護作用，而沒有典型地與其它抗炎化合物例如地寒米松伴隨的反彈作用。另一方面，不希望被任何特別的理論束縛，看來這是由于促紅細胞生成素對多功能神經(jīng)毒素例如氧化亞氮(NO)的作用。盡管活化的星形膠質(zhì)細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)產(chǎn)生NO的神經(jīng)毒性量相應(yīng)于不同的創(chuàng)傷，NO在體內(nèi)用于許多目的，包括基本生理功能的調(diào)節(jié)。這樣，盡管使用抗炎藥可能通過抑制NO或其它神經(jīng)毒素而減輕炎癥，如果該抗炎藥具有太長的半衰期，它還可能干擾其它化學(xué)藥物在修復(fù)起因于引發(fā)炎癥創(chuàng)傷的損傷中的作用。假設(shè)本發(fā)明的化合物能夠減輕炎癥，而不防礙神經(jīng)毒素例如NO的康復(fù)能力。
本發(fā)明的特定組合物和方法可用于治療視網(wǎng)膜組織的和對其損傷的癥狀。這些障礙包括，但不限于視網(wǎng)膜缺血、黃斑變性、視網(wǎng)膜剝離、視網(wǎng)膜色素變性、動脈硬化性視網(wǎng)膜病、高血壓性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜動脈阻斷、視網(wǎng)膜靜脈阻斷、低血壓和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
在另一實施方案中，本發(fā)明的方法和原理可用于保護或治療損傷，其起因于輻射損傷或化學(xué)誘導(dǎo)對可興奮組織的損傷。在非限制性實例中，保護免受由化合物如紫杉烷類、順鉑和其它具有潛在誘發(fā)周圍神經(jīng)病變的其它化學(xué)治療引起的損傷。本發(fā)明方法的進一步的應(yīng)用是治療神經(jīng)毒素中毒，例如軟骨藻酸蛤貝中毒、山黧豆中毒和關(guān)島病(Guam disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化和帕金森氏病。
如上所述，本發(fā)明也涉及一種在哺乳動物中通過外周給予本發(fā)明上述化合物以增強可興奮組織的功能的方法。多種疾病和癥狀適合于使用該方法治療，并且進一步的，該方法可用于增強在任何癥狀或疾病的缺失下的認知功能。本發(fā)明的這些應(yīng)用在下面進一步的詳細描述，并包括在人和非人類哺乳動物中促進學(xué)習和訓(xùn)練。
針對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可通過本發(fā)明這方面的方法治療的癥狀和疾病包括，但不限于，心境障礙、焦慮癥、抑郁癥、孤獨癥、注意缺陷障礙伴多動和認知機能障礙。增強神經(jīng)功能對這些癥狀是有益的。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的可治療的其它障礙包括例如，睡眠中斷，睡眠性呼吸暫停和行走相關(guān)障礙；蛛網(wǎng)膜下和動脈瘤出血，血壓過低休克，震蕩性損傷，敗血癥性休克，過敏性休克和各種腦炎和腦脊膜炎的后遺癥，例如，結(jié)締組織疾病相關(guān)性cerebritides例如狼瘡。其它用途包括預(yù)防或保護來自神經(jīng)毒素的中毒，例如軟骨藻酸蛤貝中毒、山黧豆中毒和關(guān)島病、肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病；術(shù)后治療血栓或局部缺血的損傷；全腦輻射；鐮狀細胞危象和驚厥。
本發(fā)明的方法進一步治療的癥狀組包括遺傳性或后天性的線粒體機能障礙，其為以神經(jīng)元損傷或死亡為表征的多種神經(jīng)性疾病的起因。例如，以進行性視力喪失和由于神經(jīng)元脫離造成的腦病和肌病為特征的利氏(Leigh)病(亞急性壞死性腦病)。在這些病例中，不完整的線粒體代謝未能提供足夠高的能量基礎(chǔ)給可興奮細胞的代謝供應(yīng)燃料。促紅細胞生成素受體調(diào)節(jié)器使在多種線粒體疾病中的缺損功能得以完善。如上所述，低氧癥狀不利地影響可興奮組織。該可興奮組織包括，但不限于，中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織和心臟組織。除上述的癥狀外，本發(fā)明的方法還可用于吸入中毒的治療，例如一氧化碳和煙吸入，重度哮喘，成人呼吸窘迫綜合征，氣哽和近乎溺死。產(chǎn)生低氧癥狀或被其它方式誘發(fā)的可興奮組織損傷的更多癥狀包括低血糖癥，其可能發(fā)生于胰島素使用劑量不當，或胰島素產(chǎn)生的贅生物(胰島素瘤)。
被認為是源發(fā)于可興奮組織損傷的各種神經(jīng)心理癥狀可通過瞬時的方法治療。與神經(jīng)元損傷有關(guān)的和以本發(fā)明所提供的治療的慢性疾病包括與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，其包括年齡相關(guān)性認知功能喪失和老年性癡呆，慢性癲癇疾患，阿耳茨海默氏病，帕金森氏病，癡呆，記憶喪失，肌萎縮性側(cè)索硬化，多發(fā)性硬化癥，結(jié)節(jié)性硬化癥，大腦威爾遜氏病(Wilson’s Disease)和進行性核上性麻痹，關(guān)島病，Lewy體癡呆(Lewy body dementia)，蛋白酶傳染性因子疾病，例如海綿狀腦病，例如，克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)，亨延頓氏舞蹈病(Huntington′s disease)，肌強直性營養(yǎng)不良，夏科-馬里-圖思病(Charcot-Marie-Tooth Disease)，佛里德里希氏(Freidrich′s)共濟失調(diào)和其它共濟失調(diào)，以及，基爾-德-拉-圖雷特(氏)綜合征(Gilles de Ia Tourette′s syndrome)，癲癇疾患例如癲癇和慢性癲癇疾患，休克，腦或脊髓創(chuàng)傷，艾滋病癡呆，酒精中毒，孤獨癥，視網(wǎng)膜缺血，青光眼，自發(fā)性功能障礙例如高血壓和睡眠障礙，以及神經(jīng)精神疾病包括，但不限于，精神分裂癥，情感分裂性精神障礙，注意力缺陷障礙性興奮過度，情緒惡劣性障礙，嚴重的抑郁性障礙，躁狂癥，強制性障礙，應(yīng)用精神作用物質(zhì)所致精神障礙，焦慮癥，驚恐性障礙，以及單相和雙相感情失常。其它神經(jīng)精神和神經(jīng)變性疾病包括，例如，在最新版本IV的American PsychiatricAssociation′s Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM)中列出的，其整體在此引入作為參考。
在另一實施方案中，包含本發(fā)明化合物的重組嵌合性毒素分子可用于毒素投遞的治療，以治療增殖性疾病，例如癌癥或病毒性疾病如亞急性硬化性全腦炎。
表1列舉了其它的代表性的、非限制性的適應(yīng)癥，作為通過本發(fā)明前述化合物可治療的各種癥狀和疾病。
表1
如上所述，這些疾病、病癥或癥狀僅僅是對于本發(fā)明化合物所提供的有益效果所列的例證。相應(yīng)地，本發(fā)明廣泛地提供了機械創(chuàng)傷的或人體疾病的結(jié)果的治療或預(yù)防性治療。對于CNS和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、病癥或癥狀的治療或預(yù)防性治療是優(yōu)選的。提供了對具有精神病成分的疾病、病癥或癥狀的治療或預(yù)防性治療。提供了對疾病、病癥或癥狀的治療或預(yù)防性治療，其包括但不限于，眼、心血管、心肺、呼吸、腎臟、泌尿、生殖、胃腸、內(nèi)分泌或代謝部位。
在一種實施方案中，包括本發(fā)明化合物的該藥物組合物可以全身性地給藥以保護或增強靶點的細胞、組織或器官。該給藥可以是胃腸外的，通過吸入或粘膜穿透的，例如，經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、舌下、粘膜下或經(jīng)皮。優(yōu)選的，是注射給藥，例如，通過靜脈或腹膜內(nèi)注射，并且還包括，但不限于動脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)和皮下給藥。
對于其它給藥途徑，例如使用灌注液，注入器官中或其它局部地區(qū)給藥，所提供的藥物組合物會致使本發(fā)明化合物與上述相似的濃度。約0.01pM-30nM的濃度是優(yōu)選的。
本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的化合物和可藥用的載體。在特定的實施方案中，術(shù)語“可藥用的”意指被聯(lián)邦或州政府管理機構(gòu)批準的，或列于美國藥典或其它通常認可的外國的用于動物并且更特別地用于人的藥典。術(shù)語“載體”指稀釋劑、輔劑、賦形劑或媒介物，以其治療性的給藥。這些藥學(xué)載體可以是無菌液體，例如鹽水溶液和油，包括石油、動物、植物或來源于人造的，例如花生油、大豆油、芝麻油等等。當該藥物組合物經(jīng)靜脈給藥時，鹽溶液是優(yōu)選的載體。鹽溶液以及葡萄糖和丙三醇的水溶液也可以作為液體載體使用，特別是對于可注射的溶液。適宜的藥學(xué)輔料包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、丙三醇、丙烯、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH值緩沖劑。這些組合物可采取溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、緩釋制劑等的形式。該組合物可以以傳統(tǒng)的粘合劑和載體例如甘油三酯配制成栓劑。本發(fā)明的化合物可以以中性的或鹽的形式配制?？伤幱玫柠}包括那些與游離氨基形成的例如那些產(chǎn)生于鹽酸的、磷酸的、乙酸的、草酸的、酒石酸的，等等，以及那些與游離羧基形成的例如產(chǎn)生于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等。適合的藥學(xué)載體的舉例如E.W.Martin在″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中所述的。該組合物包含治療有效量的優(yōu)選以純化形式的化合物與適宜量的載體，從而提供適合患者給藥的形式。該制劑應(yīng)當適合給藥模式。
可提供適合于口服給藥的藥物組合物，如膠囊劑或片劑；如粉末劑或顆粒劑；如溶液劑、糖漿劑或混懸劑(在水性或非水性液體中)；如可食用的泡沫或whips；或如乳劑。片劑和硬膠囊劑可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸或其鹽。軟明膠膠囊可以包含植物油、蠟、脂肪、半固體或液體多元醇等。溶液劑和糖漿劑可以包含水、多元醇和糖。
用于口服給藥的活性劑可以以延遲活性成分在胃腸道中崩解和/或吸收的材料包裹或混合(例如，可以使用單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。這樣，活性劑的持續(xù)釋放可以達到數(shù)小時以上并且，如果需要，該活性劑可以在胃中被保護而避免降解。供口服的藥物組合物可以被配制，以促進活性劑在具有特定pH或酶環(huán)境的特定胃腸部位釋放。
可供適合于經(jīng)皮給藥的藥物組合物為不連續(xù)的貼片，以保持與受試者的表皮緊密結(jié)合，從而延長時間。可供適合于局部給藥的藥物組合物為軟膏劑、乳膏劑、混懸劑、洗劑、粉末劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。對于皮膚、口腔、眼或其它外部組織的局部給藥，優(yōu)選使用軟膏劑或乳膏劑。當配制成軟膏劑時，活性成分可以與石蠟或可與水混合的軟膏基質(zhì)使用。另選的，該活性成分可以與水包油基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制成乳膏。適合于眼部局部給藥的藥物組合物包括滴眼液。在這些組合物中，活性成分可溶解或混懸于合適的載體中，例如，在水性溶劑中。適合于口腔局部給藥的藥物組合物包括錠劑(lozenges)、軟錠劑(pastilles)和漱口劑。
適合于經(jīng)鼻和經(jīng)肺給藥的藥物組合物可以含有固體載體如粉末(優(yōu)選粒度范圍為20～500μm)?？梢詫⒎勰┮员俏幍姆绞浇o藥，即，從將靠近鼻子的粉末容器中經(jīng)鼻迅速吸入。另選的，適合于經(jīng)鼻給藥的藥物組合物可以含有液態(tài)載體，例如，鼻噴霧劑或滴鼻劑。另選的，直接進入肺中的吸入劑可以通過深吸入或經(jīng)進入口咽的煙嘴裝置而實現(xiàn)。這些組合物可以包括活性成分的水或油溶液。經(jīng)吸入給藥的組合物可以以特別適合的裝置提供，包括但不限于，壓力氣霧劑、噴霧器或吸入器，它可以具有用于提供預(yù)定劑量的活性成分的構(gòu)造。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物直接進入鼻腔中或通過鼻腔或口咽進入肺中而給藥。
可供適合于直腸給藥的藥物組合物為栓劑或灌腸劑?？晒┻m合于陰道給藥的藥物組合物可以為陰道栓劑、棉塞劑(tampons)、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑劑型。
適合于胃腸外給藥的藥物組合物包括水性或非水性無菌可注射的溶液或混懸液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使組合物基本上與需要使用者的血液等滲的溶質(zhì)?？梢源嬖谟谠摻M合物中的其它組分包括，例如水、醇類、多元醇、丙三醇和植物油。適合于注射給藥的藥物組合物可以存在于單-劑量或多-劑量容器中，例如密封的安瓿和管形瓶，并且可以貯存在冷凍干燥的(低壓凍干的)條件下，僅要求在使用前立即添加無菌液狀載體例如注射用無菌鹽水溶液。臨時注射溶液和混懸液可以從無菌粉末、顆粒和片配制。在一種實施方案中，包括本發(fā)明化合物的可注射溶液的自動注射器可以在救護車、急診室和戰(zhàn)場情況下緊急使用，以及甚至在家庭環(huán)境下的自己使用，特別是可能發(fā)生外傷性切斷的可能性時，例如魯莽地使用割草機。通過在復(fù)置術(shù)后，甚至在醫(yī)務(wù)人員到達現(xiàn)場之前，或遭受腳趾切斷的個體到達急診室之前，立即向切斷部位的多個位置給予本發(fā)明的化合物，在已切斷的腳和腳趾中的細胞和組織幸存的可能性可能增加。
在優(yōu)選的實施方案中，該組合物根據(jù)可適合于向人靜脈給藥的藥物組合物的常規(guī)程序配制。例如，靜脈給藥組合物是無菌等滲水性緩沖溶液。需要時，該組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。一般的，各組分為分別的或共同混合的、以單劑量形式提供，例如，干燥的冷凍干燥粉末或在熔封容器如安瓿或sachette中的無水濃縮液，標示出活性劑的量。該組合物經(jīng)輸注給藥時，它可以與含有無菌藥用級的水或鹽水的輸注瓶調(diào)配。該組合物通過注射給藥時，可以提供無菌鹽水的安瓿，以便各成分可以在給藥前預(yù)先混合。
栓劑通常含有0.5％～10％重量的活性成分；口服制劑優(yōu)選含有10％～95％的活性成分。
可提供灌注液組合物以用于移植器官浴槽、原位灌注，或在器官采集前向器官供者的血管系統(tǒng)給藥。該藥物組合物可以包含不適用于給個體急性或慢性、局部或全身給予本發(fā)明的化合物的濃度，但是，在將該治療器官或組織暴露或復(fù)原到正常循環(huán)之前，預(yù)先除去或減少包含于此的本發(fā)明化合物濃度之前，此時可預(yù)備用于尸體、器官浴、器官灌注或原位灌注。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝或藥盒，其包括一個或多個填充了一種或多種本發(fā)明藥物組合物的成分的容器。任選的與該容器結(jié)合，其可以是以管理藥物制劑或生物制品的制備、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定的形式公告，該公告反映了經(jīng)過人用藥制備、使用或銷售機構(gòu)的批準。
在另一實施方案中，例如，本發(fā)明的該化合物可以以控釋系統(tǒng)投遞。例如多肽可以使用靜脈輸注、植入性滲透泵、透皮貼劑、脂質(zhì)體或其它給藥形式給予。在一種實施方案中，可以使用泵(見Langer，supra，Sefton，1987，CRC Crit.Ref. Biomed.Eng.14201；Buchwald等，1980，Surgery 88507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一實施方案中，該化合物可以以泡囊投遞，特別是脂質(zhì)體(見Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat等，于Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；WO 91/04014；美國專利號4,704,355；Lopez-Berestein，同上，pp.317-327；通常出處同上.)。在另一實施方案中，可以使用聚合物材料(見Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC PressBoca Raton，F(xiàn)lorida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Bail(eds.)，WileyNew York(1984)；Ranger and Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromoi.Chem.2361，1953；還見Levy等，1985，Science 228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71105)。
在再另一個實施方案中，控制釋放系統(tǒng)可置于接近治療靶點，即靶細胞、組織或器官，從而僅要求全身劑量的一部分(見，例如，Goodson，pp.115-138于Medical Applications of Controlled Release，vo1.2，supra，1984)。其它控制釋放系統(tǒng)已由Langer(1990，Science 2491527-1533)在綜述中討論。
在另一實施方案中，本發(fā)明的化合物通過適當?shù)呐渲?，可以?jīng)鼻、口、直腸、陰道或舌下給藥。
在特定的實施方案中，期望將本發(fā)明的組合物向需要治療的局部區(qū)域給藥；這可以通過例如，并且不限于以下方式達到在手術(shù)期間局部輸注，局部給藥，如與傷口敷料結(jié)合；注射；導(dǎo)管方式；栓劑方式；植入劑方式，所述的植入劑為多孔的、無孔的或明膠材料，包括薄膜，例如硅橡膠薄膜或纖維。
該優(yōu)選有效劑量的選擇由技術(shù)人員根據(jù)多種因素考慮決定，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。這些因素包括本發(fā)明化合物的特定形式，以及其藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用度、代謝、半衰期等，它們在典型地用于獲得藥物化合物規(guī)定批準的常規(guī)開發(fā)過程中就已經(jīng)確定。其它應(yīng)考慮的劑量因素包括需要治療的癥狀和疾病，或在正常個體中可達到的益處、患者體重、給藥途徑、給藥是否為急性或慢性、聯(lián)合用藥及其它已知的影響給藥效果的因素。因此應(yīng)當根據(jù)醫(yī)生和每名患者的狀況的判斷確定精確的劑量，例如，依靠每名患者的狀況和免疫狀態(tài)，并依照標準的臨床技術(shù)。
本發(fā)明的另一方面，灌注液或灌注溶液是供灌注和移植器官貯存用的，該灌注溶液包括一定量的本發(fā)明化合物，有效地保護敏感細胞和相關(guān)的細胞、組織或器官。移植包括但不限于異種移植，其中器官(包括細胞、組織或其它身體部分)是從一個供體獲得的，并移植到不同的受體上；以及自體移植，其中器官取自身體的一個部分并補充到另一處，包括實驗臺手術(shù)操作，其中一個器官可以被移除，然后離體切除、修復(fù)或其它操作，例如腫瘤切除術(shù)，再送回原始位置。在一種實施方案中，灌注溶液為Wisconsin大學(xué)(UW)溶液(美國專利號4798824)，其含有約1～約25U/ml促紅細胞生成素、5％羥乙基淀粉(分子量為約200000～約300000，并且基本上無乙二醇、2-氯乙醇、氯化鈉和丙酮)、25mM KH2PO4、3mM谷胱甘肽、5mM腺苷、10mM葡萄糖、10mMHEPES緩沖液、5mM葡萄糖酸鎂、1.5mM CaCl2、105mM葡萄糖酸鈉、200000單位青霉素、40單位胰島素、16mg地塞米松、12mg酚磺酞，并且pH為7.4-7.5及滲透壓約320mOSm/l。該溶液用于在移植前維持尸體的腎臟和胰臟。使用該溶液，推薦用于尸體腎臟保存時，保存可延長到超過30小時的限度。該特殊灌注液只是許多目前適合使用的這種溶液的例證，其包含本發(fā)明有效量的化合物。在另一實施方案中，灌注溶液含有約0.01pg/ml～約400ng/ml的本發(fā)明化合物，或者約40～約300ng/ml的本發(fā)明化合物。
當本發(fā)明化合物貫穿于此處使用的優(yōu)選受體為人時，此處使用的方法等同于其它哺乳動物，特別是家養(yǎng)動物、家畜、伴侶和動物園的動物。然而，本發(fā)明并不限于此，并且其益處可用于任何哺乳動物。
本發(fā)明化合物的治療和預(yù)防應(yīng)用如下述實施例所述，在人類內(nèi)皮的腦毛細管中，促紅細胞生成素受體的存在表明本發(fā)明化合物的靶點為人腦，并且對本發(fā)明這些化合物的動物研究可直接轉(zhuǎn)移到人類的治療或預(yù)防上。
本發(fā)明的另一方面，通過將細胞、組織或器官直接向包含本發(fā)明化合物的藥物組合物暴露，或?qū)谒幬锝M合物中的本發(fā)明化合物給予或接觸組織或器官的血管系統(tǒng)，對于未被上皮細胞屏障與血管系統(tǒng)隔離的細胞、組織或器官，提供了提高它們的存活率的方法和化合物。積極效果突出的原因在于提高了治療組織或器官中的敏感細胞的活性。
如上所述，本發(fā)明的一部分是基于這一發(fā)現(xiàn)，即促紅細胞生成素分子可以從腔表面轉(zhuǎn)運到與上皮細胞緊密連接的器官毛細血管上皮細胞的基底膜表面，包括，例如，腦、視網(wǎng)膜和睪丸。這樣，對于本發(fā)明化合物的有益效果，敏感細胞通過的該屏障是敏感的靶點，而且對于本發(fā)明的方法而言，包含和全部或部分地依賴于此處的敏感細胞的其它細胞類型或組織或器官也是靶點。當不希望被任何特定的理論束縛時，本發(fā)明化合物跨細胞作用后，本發(fā)明的該化合物可以干擾敏感細胞上的促紅細胞生成素受體，例如，神經(jīng)元、視網(wǎng)膜、肌肉、心臟、肺、肝、腎、小腸、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、毛細管內(nèi)皮、睪丸、卵巢、胰腺、骨、皮膚或子宮內(nèi)膜細胞，并且受體結(jié)合能夠引發(fā)信號傳導(dǎo)串聯(lián)，致使敏感細胞或組織之內(nèi)的基因表達程序的激活，導(dǎo)致細胞或組織或器官免受例如毒素、化學(xué)治療劑、放射治療、缺氧等的損傷的保護作用。這樣，保護含有敏感細胞的組織避免損傷或缺氧應(yīng)激以及增強這些組織的功能的方法在下文進行了詳細描述。如上所述，本發(fā)明的方法同樣適用于人以及其它動物。
在本發(fā)明的一個實施方案的實施中，哺乳動物的患者經(jīng)歷了癌癥治療的全身化學(xué)治療，包括放射治療，其通常具有不良反應(yīng)例如神經(jīng)、肺、心臟、卵巢或睪丸損傷。如上所述的包含本發(fā)明化合物的藥物組合物的給藥是在化學(xué)治療和/或放射治療之前或期間完成的，以保護各種組織和器官避免化學(xué)治療劑的損傷，例如保護睪丸?？梢赃B續(xù)進行治療，直至化學(xué)治療劑的循環(huán)濃度下降到低于對哺乳動物身體的潛在危險的濃度以下。
在本發(fā)明的另一實施方案的實施中，有計劃地從汽車事故的受害者中采集不同的器官以移植到多個接受者，其中一部分需要長距離和時間的運輸。在器官采集之前，將包含本發(fā)明此處所述化合物的藥物組合物灌注給受害者。需要運輸?shù)牟杉鞴儆冒景l(fā)明此處所述化合物的灌注液灌注，并貯存在含有本發(fā)明化合物的浴槽中。利用根據(jù)本發(fā)明的含有本發(fā)明化合物的灌注液，以搏動灌注裝置連續(xù)地灌注某些器官。在運輸和移植以及器官原位再灌注期間，器官功能發(fā)生最低限度的衰退。
在本發(fā)明的另一實施方案中，修復(fù)心瓣膜的手術(shù)操作需要臨時的心臟停搏和動脈閉塞。手術(shù)之前，患者每kg體重灌注本發(fā)明化合物4μg。這樣處理防止了低氧局部缺血的細胞損傷，特別是在再灌注之后。
在本發(fā)明的另一實施方案中，在任意手術(shù)操作例如在心肺旁路手術(shù)中可以使用本發(fā)明的化合物。在一種實施方案中，在旁路手術(shù)之前、期間和/或之后，給予包含本發(fā)明化合物的藥物組合物，以保護腦、心臟和其它器官的功能。
在上述本發(fā)明化合物離體使用或治療敏感細胞例如神經(jīng)元組織、視網(wǎng)膜組織、心臟、肺、肝、腎、小腸、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、毛細管內(nèi)皮、睪丸、卵巢或子宮內(nèi)膜細胞或組織的實例中，本發(fā)明提供了適合于保護或增強敏感細胞、組織或器官遠端至血管系統(tǒng)的單元劑量形式的藥物組合物，每一單元劑量包含有效、非毒性量的范圍為約0.01pg～5mg、1pg～5mg、500pg～5mg、1ng～5mg、500ng～5mg、1μg～5mg，500μg～5mg或1mg～5mg的本發(fā)明化合物和可藥用的載體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物的量的范圍為約1ng～5mg。
本發(fā)明的另一方面，在經(jīng)歷腦外傷的動物中，發(fā)現(xiàn)EPO給藥可恢復(fù)認知功能。預(yù)期本發(fā)明的化合物具有與EPO相同的細胞保護功能。在延遲5天或30天之后，與模擬治療動物相比，EPO仍然能夠恢復(fù)功能，顯示出EPO對再生或恢復(fù)腦活性的能力。這樣，本發(fā)明還涉及本發(fā)明化合物在制備治療腦外傷和其它認知機能障礙的藥物組合物中的用途，包括損傷后的康復(fù)治療(例如，3天、5天、1周、1月或更久)。本發(fā)明還涉及治療損傷后認知機能障礙的方法，其通過施用有效量的本發(fā)明化合物。此處所述的本發(fā)明的任意化合物可用于本發(fā)明的這一方面。
此外，本發(fā)明的該康復(fù)性方面涉及此處的本發(fā)明的任意化合物在制備用于細胞、組織或器官機能障礙的恢復(fù)的藥物組合物中的用途，其中治療是始發(fā)之后和康復(fù)之后，該始發(fā)的創(chuàng)傷由機能障礙所致。此外，使用本發(fā)明化合物的治療可以跨越疾病或癥狀的急性期及慢性期的病程。
在具有紅細胞生成活性的化合物的實例中，該化合物可以全身給藥，每次給藥劑量為約1μg～約100μg/kg體重，優(yōu)選約5μg～50μg/kg體重，最優(yōu)選約10μg～30μg/kg體重。在化合物給藥后，該有效劑量足以使化合物的血清濃度達到大于約10000、15000或20000mU/ml血清。該血清濃度可以在給藥后約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時達到。該劑量可以根據(jù)需要重復(fù)。例如，只要臨床需要，可以每天重復(fù)給藥，或者在適當?shù)拈g隔之后，例如，每隔1～12周，但優(yōu)選的，每隔1～3周。有效量的化合物和可藥用的載體可以被包裹在單劑量管形瓶或其它容器中。然而，本發(fā)明的該化合物為非紅細胞生成的，即，它能產(chǎn)生此處所述的活性而不引起血紅蛋白濃度或血細胞比容的增加。在本發(fā)明該方法期望長期地提供的實例中，這種非紅細胞生成的化合物是特別優(yōu)選的。在另一實施方案中，本發(fā)明的化合物是以高于天然促紅細胞生成素相應(yīng)劑量(W/W)給予的，這對于最大地刺激紅細胞生成是必需的。如上所述，本發(fā)明的化合物不具有紅細胞生成活性，因此上述以單元表示的劑量對于天然促紅細胞生成素相應(yīng)劑量僅僅是示范性的；在此提供了上述摩爾當量的劑量，其適用于本發(fā)明的任意化合物。
實施例通過參考以下提供的作為本發(fā)明示范的非限制性實施例可以更好地理解本發(fā)明。以下提供的實施例目的在于更完全地說明本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。然而，它們決不是解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1氨基甲?；偌t細胞生成素的制備在本實施例中，方法的起始材料為純化的重組人EPO。
首先，為了保持低處理容積的目的，通過超濾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)到3mg/ml。通過BioMax(Millipore)以5kDa的MWCO進行超濾。
完成濃縮步驟后，將EPO溶液與pH9.0的0.5M K-硼酸鹽四水合物0.5M K-氰酸鹽的溶液混合。該溶液在32℃下孵化24小時。
通過凝膠過濾法將EPO和氰酸鹽的反應(yīng)混合物進行脫鹽。蛋白質(zhì)脫鹽至25mM Tris、50mM NaCl、pH8.5的緩沖液中。使用G-25Fine(Amersham Biosciences)樹脂。
在大約15cm高的柱子上使用90cm/h流量，應(yīng)用約20％柱體積的樣品負荷。
收集脫鹽的氨基甲酰化EPO用于進一步處理。
●在此情況下，聚合物/聚集物含量為7.3％。
下一步是通過使用陰離子交換純化步驟將聚集物和聚合物除去。使用SOURCE 30Q(Amersham Biosciences)樹脂進行純化。大約4.5mg/ml的氨基甲酰化EPO上柱。流動緩沖液A為25mM Tris、50mMNaCl、pH8.5，洗脫緩沖液B為25mM Tris、1M NaCl、pH8.5。以超過20倍柱體積0-30％執(zhí)行梯度，收集并混合氨基甲?；疎PO的主峰。
用透析/超濾正切流動過濾裝置，將純化步驟的混合物調(diào)節(jié)至濃度＞0.5mg/ml，并將緩沖液轉(zhuǎn)換為20mM枸櫞酸、100mM NaCl的緩沖液。該濃縮和緩沖液轉(zhuǎn)換是以5kDa的MWCO在0.1m2BioMax(Millipore)上進行。
使用Millipak過濾器(Millipore)，將最后純化的生物制藥的藥品經(jīng)0.22μm過濾，以除去微生物。
該方法產(chǎn)生了具有使其作為生物制藥使用的性質(zhì)的氨基甲?；疎PO；●以SEC-HPLC測定，聚合物/聚集物的含量為0.5％●以氨基酸分析儀測定，氨基甲酰化賴氨酸為100％●濃度＞0.5mg/ml使用MALDI-TOF，對肽N糖苷酶處理的蛋白質(zhì)和具有N-聚糖的蛋白質(zhì)的完整質(zhì)量的變化進行定性測定。此外，MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋圖譜分析/LC-MS/MS分析操作如下1.將CEPO和EPO在POROS R1柱(POROS R1反相柱填料，PerSeptive Biosystems(1-1259-06))上純化。該柱填料在使用前保存在供HPLC VWR 152525R的50％HiPerSolv中。將R1柱平衡并以5％甲酸(33015，Riedl de Haёn)洗。以安捷倫MALDI HCCA質(zhì)量基質(zhì)溶液(G2037A)將樣品從柱上洗脫。通過在Bruker Reflex IV MALDI-TOF儀上分析測定完整質(zhì)量。
2.以1單位的肽N糖苷酶F和肽N糖苷酶F/O-糖苷酶，將0.3pmol的CEPO和/或EPO處理過夜。使用MALDI-TOF測定總質(zhì)量。
3.CEPO和EPO(1.5pmol)在50μl 10mM DTT、50mM NH4CO3的溶液中還原，隨后在50μl 55mM碘乙酰胺、50mM NH4CO3中烷基化。在胰蛋白酶消化之前，在POROS R1柱上純化樣品。在MALDI-TOF分析(POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems(1-1159-05))之前，將一部分消化的樣品在POROS R2柱上純化。平衡R2柱，并以0.1％三氟乙酸洗脫(99+％光譜級，Aldrich 302031-100ml)。以安捷倫MALDIHCCA質(zhì)量基質(zhì)溶液(G2037A)將樣品從柱上洗脫。將胰蛋白酶消化獲得的肽混合物用肽N糖苷酶F處理，再在POROS R2柱上純化，并經(jīng)MALDI-TOF表征。
4.CEPO和EPO在DTT的溶液中還原，并與碘乙酰胺烷基化。在Glu-C消化之前，在POROS R1柱上純化樣品。在MALDI-TOF分析之前，將一部分消化的樣品在POROS R2柱上純化。將Glu-C消化獲得的肽混合物用肽N糖苷酶F處理，再在POROS R2柱上純化，并經(jīng)MALDI-TOF表征。
5.為了排除部分氨基甲?；疌E PO的可能性，將完整的EPO和CEPO用Lys-C消化。樣品用MALDI-TOF分析。
結(jié)論是該8個賴氨酸和該N-末端被氨基甲?；?。未檢測到其它氨基甲?；陌被?，開且未檢測到修飾的聚糖。
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為了確定EPO氨基甲?；某潭群途欢?、氨基甲?；膶Ｒ恍院桶被柞；恢玫蔫b定、以及由于氨基甲?；母狈磻?yīng)和純化過程的潛在的不確定修飾的出現(xiàn)率，還進行了其它研究。樣品分析是如下進行的通過去糖基化蛋白質(zhì)樣品的總質(zhì)量分析，以及通過使用內(nèi)切蛋白酶LysC和胰蛋白酶消化的肽圖及LC/MS分析對肽進行評價。
實施例2總質(zhì)量分析使用實施例1的方法，對3個氨基甲酰化的EPO樣品進行分析。在氨基甲酰化反應(yīng)后，全部的3個樣品使用陰離子交換純化，如實施例1所述。一個CEPO樣品(命名為CEPO-CMC)由CMC Biotech以1g的生產(chǎn)規(guī)模(濃度0.82mg/ml；緩沖液20mM枸櫞酸鈉、0.3mM枸櫞酸、0.1M NaCl、pH6.9-7.3)制備。其余兩個樣品命名為CEPO-1和CEPO-2，以70mg實驗室生產(chǎn)規(guī)模(濃度1.1mg/ml；緩沖液25mMTris、0.2M NaCl、pH8.3-8.7)制備。這些CEPO樣品與未修飾的或初始的EPO(濃度0.82mg/ml；緩沖液2mM枸櫞酸鈉、0.3mM枸櫞酸、0.1M NaCl、pH6.9-7.3)和模擬的CEPO(經(jīng)過不加K-氰酸鹽的氨基甲?；^程的EPO)(濃度0.38mg/ml；緩沖液20mM枸櫞酸鈉、0.3mM枸櫞酸、0.1M NaCI、pH6.9-7.3)進行比較。
ESI-質(zhì)譜法在總質(zhì)量分析之前，將樣品經(jīng)酶去糖基化。在蛋白質(zhì)濃度0.5mg/ml下，各樣品與50μg來自A.ureafaciens的重組神經(jīng)氨酸酶的N-糖苷酶F(來自Glyko的Prozyme)和O-糖苷酶孵化過夜。將每個樣品向12％的Tris-甘氨酸凝膠中加載3μg，通過SDS-PAGE檢查去糖基化反應(yīng)的完全性。各樣品的剩余物用于質(zhì)量分析。
通過加入適宜體積的鹽酸胍貯備溶液，將該去糖基化樣品導(dǎo)入4-5M的鹽酸胍濃縮液中，隨后在含有2％甲酸和40％acenitril的緩沖液中脫鹽。為了保證去糖基化EPO和CEPO質(zhì)譜分析的高回收率而加入鹽酸胍。用具有離子化ESI-納米噴霧源的Waters ESI-Q-Tof-或WatersESI-LCT-質(zhì)譜儀進行質(zhì)量測定。通過自動反褶積法并通過使用MassLynx 4.0軟件人工評價感興趣的特征峰對數(shù)據(jù)進行評價。根據(jù)在m/z光譜上記錄的信號強度，通過計算相對比，對不同的氨基甲?；疌EPO物質(zhì)的相對比進行定量。
樣品去糖基化致使N-連接糖完全除去。然而，O-連接糖的釋放不完全，特別是對于CEPO樣品。
正如所預(yù)期的，由于該氨基甲?；?，與EPO和模擬-CEPO樣品相比，CEPO樣品顯示出不同的質(zhì)譜。如表2所示，對于不同的樣品，如理論上所預(yù)期的，光譜反褶積導(dǎo)致主峰聚集。在全部的CEPO樣品中，僅發(fā)現(xiàn)高度氨基甲?；腃EPO分子，其主要異型為具有8個賴氨酸和N-末端的完全氨基甲酰化的完全氨基甲?；愋?，即，9個氨甲酰基殘基。CEPO樣品顯示出不均勻性，其含有與連接于CEPO的8、10和11個氨甲?；鶜埢鄳?yīng)的其它異型。含有8個氨甲?；鶜埢奈镔|(zhì)命名為次-氨基甲?；?，缺少至少一個氨甲?；鶜埢?。含有10和11個氨甲?；鶜埢奈镔|(zhì)命名為過-氨基甲?；?，其中額外連接的氨甲?；鶜埢鶎⒁苑翘禺愋缘姆绞脚c除賴氨酸以外的氨基酸結(jié)合。在所有樣品的光譜上有一些較小的信號，但沒有一個被認為是非-特異性地修飾的物質(zhì)。在EPO和CEPO樣品中發(fā)現(xiàn)一些較小的信號，并認為是已存在于初始EPO中的污染物。
表2總質(zhì)量分析獲得的去糖基化CEPO-和EPO-樣品的反褶積質(zhì)量
表3顯示不同異型的相對比。依據(jù)樣品的總CEPO，次-氨基甲酰化CEPO的范圍為約1.5～5.5％；并且依據(jù)樣品，過-氨基甲?；疌EPO的范圍為約11～22％。CEPO-1和CEPO-2具有相似的異型分布，而與其它兩個樣品相比，CEPO-CMC具有較少的次-氨基甲?；镔|(zhì)。不同的制備規(guī)模所得的產(chǎn)品具有不同的分布，但如表3所示，對于實驗室制備規(guī)模，可以以相似的結(jié)果重復(fù)制備。如前面討論的，對任意給定的制備規(guī)模，通過調(diào)節(jié)來自陰離子交換柱的混合物而可以調(diào)節(jié)分布。
表3中的數(shù)表示次-和過-氨基甲?；疌EPO的最小比率。其原因是，氨基甲?；某潭?8倍～11倍)可能不能指明次、完全和過-氨基甲?；疌EPO的準確程度。例如，根據(jù)質(zhì)量分析測定的含有8個氨基甲?；鶜埢腃EPO分子可能僅有7個氨基甲?；鶜埢禺愋缘嘏c賴氨酸結(jié)合，而剩余的氨基甲酰基殘基將非特異性地與另一個氨基酸連接。即使有非特異性地結(jié)合的氨基甲?；瑑H認為這種情況是次-氨基甲?；?。相反，含有10個氨基甲?；鶜埢腃EPO分子可能僅8個殘基特異性地結(jié)合，2個非特異性結(jié)合。在這種情況下，盡管全部賴氨酸沒有被氨基甲?；?，該CEPO異型只認為是過氨基甲酰化。
表3氨基甲酰化的程度和不均勻性不同氨基甲?；疌EPO物質(zhì)的相對比
*n＝2**n＝1實施例3LysC肽圖使用內(nèi)切蛋白酶LysC和胰蛋白酶裂解進行EPO和CEPO樣品的肽圖分析。所有肽圖分析均以去糖基化肽進行。完成肽的酶去糖基化，同時以內(nèi)切蛋白酶消化。
將EPO和CEPO樣品(各約150μg)變性并通過與鹽酸胍和DTT孵化而還原。游離的巰基與碘乙酸烷基化。使用單一凝膠過濾柱，將烷基化樣品脫鹽，并將緩沖液交換成適合的緩沖液。
將內(nèi)切蛋白酶、N-糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶同時加至烷基化的EPO和CEPO樣品中。樣品在37℃下孵化過夜。孵化后，各消化液約5μg用于RP-HPLC/MS分析，使用Jupiter，Phenomenix的C18 RP-柱，配合Waters的ESI-LCT。記錄220nM處的紫外信號和質(zhì)譜儀上的總離子計數(shù)(TIC)。對于所得的肽的鑒別和定量，對該TIC進行評價。由于LysC不能裂解氨基甲?；嚢彼?，可以預(yù)計，如果所有的賴氨酸被氨基甲?；?，以LysC消化將不會形成碎片，顯示了氨基甲?；膶Ｒ恍浴Ｔ诖?氨基甲?；那闆r下，將形成特異性的CEPO碎片。表4列出了LysC消化EPO、完全和過-氨基甲?；疌EPO以及次-氨基甲酰化CEPO理論上形成的碎片。
表4LysC肽圖肽/LysC消化EPO、完全或過-氨基甲?；疌EPO以及次-氨基甲?；疌EPO理論上形成的碎片的列表。
EPO
CEPO(完全氨基甲?；瓦^-氨基甲?；?
次-氨基甲?；疌EPO(8x氨基甲?；?
正如所預(yù)期的，對于用LysC消化的EPO和CEPO樣品的LysC肽圖完全不同。以LysC消化的起始EPO和模擬-CEPO得到的肽圖與預(yù)期的一樣。在兩種樣品中，全部的肽K1～K9均可以被鑒別。在EPO和模擬-CEPO中，肽K5和K1部分的以不確定的方式裂解。與初始EPO相比，在模擬-CEPO的LysC圖中，未鑒別到明顯的附加峰，也沒有峰丟失。從這些數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，即在氨基甲酰化和純化過程期間，沒有發(fā)生明顯的EPO蛋白質(zhì)的非特異性共價修飾。
CEPO樣品肽圖與初始EPO肽圖不同。其有一個單一的主峰和有一些小峰。如表5所示，對于未裂解CEPO或從LysC裂解的次-氨基甲?；疌EPO的碎片，從峰測得的質(zhì)量與預(yù)期質(zhì)量有良好的相關(guān)性。主峰(A)包含完整的、去糖基化的、完全氨基甲?；疌EPO(9x氨甲酰基)和過-氨基甲?；疌EPO(10x氨甲酰基)(表5)。4個較小峰(B-E)包含次-氨基甲酰化CEPO(8x氨甲?；?，含有次-氨基甲?；疌EPO的不同峰在某些賴氨酸上未氨基甲酰化。峰B和C含有尤其在Lys45處氨基甲酰化不足的次-氨基甲?；疌EPO，而峰D和E含有尤其在Lys97處氨基甲酰化不足的次-氨基甲?；疌EPO(表5)。
表5LysC肽圖實驗測得質(zhì)量與次-氨基甲?；疌EPO理論所得CEPO碎片的歸屬
不同的CEPO樣品峰的相對比之間有一定的差異。與CEPO-CMC相比，CEPO樣品1和2具有更多的主峰D和E，表明它們含有更多的次-氨基甲酰化CEPO物質(zhì)。
由于技術(shù)局限，與主峰一樣，對較小峰進行定量是困難的。然而，使用UV-檢測的峰面積作為不同種的相對比的原始指標，可以估計出，次-氨基甲?；疌EPO占樣品中CEPO異型的量可能小于10％，并且與CEPO-CMC相比，CEPO-1和CEPO-2有2倍量的的次-氨基甲?；愋汀Ｊ褂门c用于總質(zhì)量分析相同的方法，位于峰A中的過-氨基甲?；镔|(zhì)的測定量為CEPO-CMC中約21％，CEPO-1和CEPO-2中約12％。
總的來說，LysC肽圖數(shù)據(jù)與實施例2所述的總質(zhì)量分析相當一致。CEPO-CMC含有較少的次-氨基甲?；疌EPO異型，而CEPO-1和CEPO-2含有更多的過-氨基甲?；疌EPO異型。該肽圖還表明，賴氨酸45和賴氨酸97表示次-氨基甲?；奈恢谩?br>實施例4胰蛋白酶肽圖應(yīng)用胰蛋白酶消化樣品描述于實施例3。
用胰蛋白酶消化的EPO和模擬CEPO產(chǎn)生了預(yù)期的肽圖。在兩個樣品中，如胰蛋白酶消化所預(yù)期的，除了一些小的二-和三-肽(例如T 21)以外，大部分的肽(T1～T 21)可以被鑒別。見表6。在以LysC消化的情況下，與初始EPO相比，無明顯的附加峰，也沒有峰從模擬-CEPO中丟失。從這些數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，即在氨基甲酰化和純化過程期間，沒有非特異性的EPO蛋白質(zhì)共價修飾。
CEPO樣品的肽圖與未修飾EPO不同。胰蛋白酶通常在賴氨酸和精氨酸處裂解，這樣，可以預(yù)期，在完全氨基甲?；疎PO的情況下，僅通過精氨酸的裂解而發(fā)生碎片。因此，以胰蛋白酶獲得肽圖后，可以鑒別出特異性氨基甲?；奈恢煤头翘禺愋园被柞；碾?。假定僅在精氨酸(R)處裂解，由CEPO分子的胰蛋白酶消化的預(yù)期肽列于表6。
表6以胰蛋白酶消化EPO和CEPO的預(yù)期肽列表EPO
CEPO(假定由于完全的氨基甲?；?，僅在Arg(R)處裂解)
除了C-末端肽R13以外，如同所有CEPO樣品主峰一樣，預(yù)期由胰蛋白酶裂解的全部肽被鑒別。也沒有在初始EPO或模擬-CEPO中發(fā)現(xiàn)這種肽。僅由精氨酸特異性裂解產(chǎn)生的R1～R12峰占CEPO樣品檢測出的肽的絕大部分。此外，所有含有賴氨酸的肽幾乎僅在完全氨基甲?；问街斜粰z測出。這些數(shù)據(jù)表明在賴氨酸和N-末端的高度特異性氨基甲?；?。
除了主要的肽以外，在全部CEPO樣品中還檢測出了6個較小的肽。3個較小的肽通過質(zhì)量分析被鑒別，其為過-氨基甲?；疌EPO胰蛋白酶裂解的產(chǎn)物，其余3個由次-氨基甲?；疌EPO產(chǎn)生。
表7列表分析了在3個CEPO樣品胰蛋白酶圖中鑒別的全部肽。由完全的和特異性的氨基甲?；疎PO形成的大量的肽R1～R12為正體字母，正確的氨基甲?；疎PO另以粗體表示。極有可能由次-氨基甲酰化CEPO裂解形成的肽以斜體表示，由過-氨基甲?；疌EPO裂解形成的肽以下劃線表示。
表7胰蛋白酶肽圖CEPO的胰蛋白酶肽圖鑒別的肽列表
*-與TIC中總數(shù)目相關(guān)的強度1-人工評價測得；信號證實為特異性的參照表7，較小峰T9和T10分別含有肽R6_a1和R6_b1，極有可能來自次-氨基甲?；疌EPO分子的裂解，其在Lys97未氨基甲?；Ｈ绻鸏ys45氨基酸未氨基甲?；瘎t形成肽R4_b1+1xcarb。在CEPG-1和CEPO-2樣品中的肽R6_a1(峰T9)比CEPO-CMC中的量更大，表明前者有雙倍量的次-氨基甲?；疌EPO。在所有CEPO樣品中，肽R6_b1和R4_b1+1xcarb具有相等的量。
由于技術(shù)局限，從這些數(shù)據(jù)計算次-氨基甲酰化CEPO的相對含量是困難的。然而，將所有觀察結(jié)果放在一起，可估算出次-氨基甲酰化物質(zhì)為約10％，它是從總質(zhì)量分析和LysC肽圖推論的。
由于含有一個額外的氨甲酰基殘基即過-氨基甲?；疌EPO，與其它肽共同被洗脫的另外3個較小的肽通過質(zhì)量來說明。肽R10_2xcarb和R7_1xcarb檢測出痕量，而R12_3xcarb測出具有明顯的信號強度。如同CEPO-1和CEPO-2，CEPO-CMC具有2倍高的過-氨基甲?；疌EPO物質(zhì)的含量。這與由總質(zhì)量分析所得的結(jié)果一致。從這些數(shù)據(jù)還可以推斷，EPO的151-62的氨基酸序列是一個非特定的氨基甲?；奈恢?。
此外，與次-氨基甲?；亩吭蛳嗤^-氨基甲?；镔|(zhì)的定量也是困難的。然而，假定肽的離子化效率是相似的，僅在氨基甲酰化程度方面不同，通過R12-衍生物的相對離子數(shù)，可以計算出約3-7％的CEPO是過-氨基甲?；镔|(zhì)。其低于通過總質(zhì)量分析計算的過-氨基甲酰化異型的量。
根據(jù)EPO和CEPO的總質(zhì)量分析和肽圖數(shù)據(jù)，大體上可以得出以下結(jié)論。
根據(jù)總質(zhì)量分析，CEPO樣品呈現(xiàn)相當高程度的氨基甲?；?。約全部分子的95-98％完全氨基甲酰化，并含有至少9個氨甲?；鶜埢?見表3)。LysC和胰蛋白酶圖譜證實了在特定位置的高度氨基甲?；?，并且極有可能超過95％的CEPO分子是在8賴氨酸和N-末端完全氨基甲?；?。
該數(shù)據(jù)還顯示發(fā)現(xiàn)4個CEPO的異型。在CEPO樣品分析中發(fā)現(xiàn)具有8、9、10和11個氨甲?；鶜埢奈镔|(zhì)，9氨甲?；愋蜑閮?yōu)勢種(dominant species)。小部分CEPO分子含有8個氨甲?；鶜埢?，而不是9個，并認為是次-氨基甲酰化。對于CEPO-1和CEPO-2，這些異型約為總體的5％，對于CEPO-CMC，該異型約為總CEPO分子的1.5％。
CEPO分子的更重要部分是過-氨基甲?；?，即，含有10或11個氨甲?；鶜埢＿^-氨基甲?；疌EPO范圍為，從CEPO-1和CEPO-2的約11％，至CEPO-CMC的約22％。
由肽圖的數(shù)據(jù)說明在8賴氨酸和N-末端氨基甲酰化的高度專一性。此外，肽圖一般性地證明了總質(zhì)量分析的結(jié)果。在全部賴氨酸和N-末端，至少約90-95％的CEPO分子顯示被氨甲?；鶜埢禺愋缘匦揎棥Ｈ欢?，該數(shù)據(jù)還顯示了次-和過-氨基甲?；疌EPO物質(zhì)。由于某些技術(shù)限制，次-氨基甲?；镔|(zhì)的準確比率是難以測定的，但是估計其范圍高達約10％，這與在總質(zhì)量分析中測得的數(shù)一致。此外，在EPO上的兩個不同的位置，Lys45和Lys97被認為是極有可能發(fā)生氨基甲?；蛔愕囊粋€。
在兩套肽圖中還發(fā)現(xiàn)了過-氨基甲?；镔|(zhì)。此外，由于技術(shù)的限制，過-氨基甲?；镔|(zhì)的準確量是難以測定的。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，可以推測，在肽圖中可檢測出太少的過-氨基甲酰化物質(zhì)。與總質(zhì)量分析相比，過-氨基甲?；镔|(zhì)僅有三分之一到二分之一的量通過肽圖被鑒定。該偏差的合理解釋是，并非全部的過-氨基甲?；囊匀炕蛞赃m宜量被鑒定。在LysC譜圖中，檢測出顯著量的含有10個氨甲?；鶜埢奈戳呀釩EPO物質(zhì)，而且在胰蛋白酶圖譜中檢測出三個肽，其包含一個額外的氨甲?；鶜埢?。其中兩個碎片僅檢測出痕量。接近于C-末端的第三個肽，CEPO肽氨基酸152-162，顯示其占過-氨基甲?；娜种?，并且可能是EPO中一個非特異性氨基甲?；奈恢谩?br>在CEPO樣品或在模擬CEPO樣品中，通過任何分析過程，未檢測出顯著量的其它非特異性(與氨甲?；鶡o關(guān))修飾。
權(quán)利要求
1.一種制備通過ESI-質(zhì)譜法測定具有小于約40％的聚集蛋白質(zhì)和小于約40％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括，在一定溫度、pH下和一定時間內(nèi)，將一定量的促紅細胞生成素與一定量的氰酸鹽接觸，上述條件足以使促紅細胞生成素的賴氨酸上的氨基和N-末端氨基酸變成至少約90％的氨基甲酰化。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細胞生成素。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％的聚集蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％的聚集蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％的聚集蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-和次-氨基甲酰化蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
8.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
9.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-氨基甲酰化蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
11.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
12.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約0.05mg/ml～約10mg/ml。
13.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約2mg/ml～約5mg/ml。
14.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約10M。
15.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約2M。
16.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的溫度是約0℃～約60℃。
17.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的溫度是約30℃～約34℃。
18.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的pH是約7約11。
19.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的pH是約8約10。
20.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的時間是約10分鐘～約30天。
21.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的時間是約1小時～約5天。
22.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)是在緩沖液的存在下與氰酸鹽接觸。
23.權(quán)利要求
22的方法，其中所述的緩沖液是硼酸鹽。
24.權(quán)利要求
22的方法，其中所述的緩沖液的濃度是約0.05M～約2M。
25.權(quán)利要求
22的方法，其中所述的緩沖液的濃度是約0.1M～約1M。
26.權(quán)利要求
22的方法，其中所述的緩沖液的濃度是約0.5M。
27.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約0.05mg/ml～約10mg/ml，所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約10M，所述的溫度是約0℃～約60℃，所述的pH是約7約11，并且所述的時間是約10分鐘～30天。
28.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約2mg/ml～約5mg/ml，所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約2M，所述的溫度是約30℃～約34℃，所述的pH是約8約10，并且所述的時間是約1小時～5天。
29.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約3mg/ml，所述的氰酸鹽的濃度是約0.5M，所述的溫度是約32℃，所述的pH是約9.0，并且所述的時間是約24小時。
30.一種制備通過ESI-質(zhì)譜法測定具有小于約3％的聚集蛋白質(zhì)和小于約40％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)的方法，包括使用陰離子交換、陽離子交換、疏水交換色譜、反相色譜、親合色譜或分子排阻色譜純化所述的氨基甲?；偌t細胞生成素。
31.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細胞生成素。
32.權(quán)利要求
30的方法，其中至少約90％的促紅細胞生成素的賴氨酸和N-末端氨基酸上的胺基殘基被氨基甲酰化。
33.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約2.5％的聚集蛋白質(zhì)。
34.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有約0.5％或更少的聚集蛋白質(zhì)。
35.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
36.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
37.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
38.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
39.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
40.權(quán)利要求
30的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
41.一種制備通過ESI-質(zhì)譜法測定具有小于約3％的聚集蛋白質(zhì)和小于約40％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)在一定溫度、pH下和一定時間內(nèi)，將一定量的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)與一定量的氰酸鹽接觸，上述條件足以使促紅細胞生成素的賴氨酸上的氨基殘基和N-末端氨基酸的至少約90％變成氨基甲?；?；和(b)使用陰離子交換、陽離子交換、疏水交換色譜、反相色譜、親合色譜或分子排阻色譜純化所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)。
42.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細胞生成素。
43.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約2.5％的聚集蛋白質(zhì)。
44.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有約0.50％或更少的聚集蛋白質(zhì)。
45.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
46.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
47.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
48.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
49.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
50.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
5 1.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約0.05mg/ml～約10mg/ml。
52.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約2mg/ml～約5mg/ml。
53.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約3mg/ml。
54.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約10M。
55.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約2M。
56.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的氰酸鹽的濃度是約0.5M。
57.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的溫度是約0℃～約60℃。
58.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的溫度是約30℃～約34℃。
59.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的溫度是約32℃。
60.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的pH是約7約11。
61.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的pH是約8～約10。
62.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的pH是約9。
63.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的時間是約10分鐘～約30天。
64.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的時間是約1小時～約5天。
65.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的時間是約24小時。
66.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)是在緩沖液的存在下與氰酸鹽接觸。
67.權(quán)利要求
66的方法，其中所述的緩沖液是硼酸鹽。
68.權(quán)利要求
66的方法，其中所述的緩沖液的濃度是約0.05M～約2M。
69.權(quán)利要求
66的方法，其中所述的緩沖液的濃度是約0.1M～約1M。
70.權(quán)利要求
66的方法，其中所述的緩沖液的濃度是約0.5M。
71.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約0.05mg/ml～約10mg/ml，所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約10M，所述的溫度是約0℃～約60℃，所述的pH是約7約11，并且所述的時間是約10分鐘～30天。
72.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約2mg/ml～約5mg/ml，所述的氰酸鹽的濃度是約0.05M～約2M，所述的溫度是約30℃～約34℃，所述的pH是約8約10，并且所述的時間是約1小時～5天。
73.權(quán)利要求
41的方法，其中所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約3mg/ml，所述的氰酸鹽的濃度是約0.5M，所述的溫度是約32℃，所述的pH是約9.0，并且所述的時間是約24小時。
74.氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，通過ESI-質(zhì)譜法測定，其具有賴氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少約90％的氨基甲酰化，小于約3％的聚集蛋白質(zhì)以及小于約40％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
75.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其中所述的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細胞生成素。
76.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約2.5％的聚集蛋白質(zhì)。
77.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有約0.5％或更少的聚集蛋白質(zhì)。
78.權(quán)利要求
74的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)，其中所述的聚集蛋白質(zhì)的量是通過SEC-HPLC測定。
79.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約30％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
80.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約20％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
81.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約10％重量的過-和次-氨基甲酰化蛋白質(zhì)。
82.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約30％的過-氨基甲酰化蛋白質(zhì)。
83.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約20％的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
84.權(quán)利要求
74的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約10％的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
85.一種化合物，包括氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有賴氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少約90％的氨基甲?；?，小于約40％的聚集蛋白質(zhì)和一定量的氰酸鹽。
86.權(quán)利要求
85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細胞生成素。
87.權(quán)利要求
85的化合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％的聚集蛋白質(zhì)。
88.權(quán)利要求
85的化合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％的聚集蛋白質(zhì)。
89.權(quán)利要求
85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約15％的聚集蛋白質(zhì)。
90.權(quán)利要求
85的化合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％的聚集蛋白質(zhì)。
91.權(quán)利要求
85的化合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有約7％或更少的聚集蛋白質(zhì)。
92.權(quán)利要求
85的化合物，其中所述的聚集蛋白質(zhì)的量是通過SEC-HPLC測定。
93.一種氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)，通過ESI-質(zhì)譜法測定，其具有賴氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少約90％的氨基甲酰化，小于約3％的聚集蛋白質(zhì)和小于約40％重量的過-和次-氨基甲酰化蛋白質(zhì)，其為包括以下步驟的方法的產(chǎn)品(a)在一定溫度、pH下和一定時間內(nèi)，將一定量的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)與一定量的氰酸鹽接觸，上述條件足以使促紅細胞生成素的賴氨酸氨基殘基和N-末端氨基酸的至少約90％變成氨基甲?；?；和(b)使用陰離子交換、陽離子交換、疏水交換色譜、反相色譜、親合色譜或分子排阻色譜純化所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)。
94.權(quán)利要求
93的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)，其中所述的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細胞生成素。
95.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約2.5％的聚集蛋白質(zhì)。
96.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有約0.5％或更少的聚集蛋白質(zhì)。
97.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其中所述的聚集蛋白質(zhì)的量是通過SEC-HPLC測定。
98.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約30％重量的過-和次-氨基甲酰化蛋白質(zhì)。
99.權(quán)利要求
93的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約20％重量的過-和次-氨基甲酰化蛋白質(zhì)。
100.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約10％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
101.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約200％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
102.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約10％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
103.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有小于約5％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
104.權(quán)利要求
93的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其中所述的方法包括，所述的與氰酸鹽接觸的促紅細胞生成素蛋白質(zhì)的濃度是約3mg/ml，所述的氰酸鹽的濃度是約0.5M，所述的溫度是約32℃，所述的pH是約9.0，并且所述的時間是約24小時。
105.一種藥物組合物，包括治療有效量的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)，其具有賴氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少約90％的氨基甲?；?，小于約3％的聚集蛋白質(zhì)以及小于約40％重量的過-和次-氨基甲酰化蛋白質(zhì)，和可藥用的載體。
106.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細胞生成素。
107.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約2.5％的聚集蛋白質(zhì)。
108.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有約0.5％或更少的聚集蛋白質(zhì)。
109.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲酰化促紅細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
110.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
111.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于10％重量的過-和次-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
112.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約30％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
113.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約20％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
114.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約10％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
115.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的氨基甲?；偌t細胞生成素蛋白質(zhì)具有小于約5％重量的過-氨基甲?；鞍踪|(zhì)。
116.權(quán)利要求
105的藥物組合物，其中所述的載體是稀釋劑、輔助劑或賦形劑。
117.一種治療慢性癥狀或疾病的方法，包括給予權(quán)利要求
105的藥物組合物。
118.一種治療亞慢性癥狀或疾病的方法，包括給予權(quán)利要求
105的藥物組合物。
119.一種治療急性癥狀或疾病的方法，包括給予權(quán)利要求
105的藥物組合物。
120.一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病的方法，包括給予權(quán)利要求
105的藥物組合物。
121.權(quán)利要求
120的方法，其中所述的疾病是休克、局部缺血事件、脊髓損傷、外傷性腦損傷、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、阿耳茨海默氏病、精神分裂癥或化學(xué)治療誘發(fā)的神經(jīng)病。
122.根據(jù)權(quán)利要求
74的化合物在制備包含所述化合物的藥物組合物中的用途，用于治療慢性癥狀或疾病。
123.根據(jù)權(quán)利要求
74的化合物在制備包含所述化合物的藥物組合物中的用途，用于治療亞慢性癥狀或疾病。
124.根據(jù)權(quán)利要求
74的化合物在制備包含所述化合物的藥物組合物中的用途，用于治療急性癥狀或疾病。
125.根據(jù)權(quán)利要求
74的化合物在制備包含所述化合物的藥物組合物中的用途，用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。
126.根據(jù)權(quán)利要求
125的用途，其中所述的疾病是休克、局部缺血事件、脊髓損傷、外傷性腦損傷、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、阿耳茨海默氏病、精神分裂癥或化學(xué)治療誘發(fā)的神經(jīng)病。
專利摘要
本發(fā)明公開了制備新型的氨基甲?；偌t細胞生成素的方法，和包含該新型的氨基甲?；偌t細胞生成素的組合物和包含它的藥物組合物及其用途。
文檔編號A61K38/18GK1997665SQ200580022740
公開日2007年7月11日 申請日期2005年7月7日
發(fā)明者S·克里斯坦森, L·福爾達杰, J·瓦爾布喬恩, M·H·圖森, A·H·佩德森, M·芒克 申請人:H.隆德貝克有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan<