專利名稱:雙水相萃取法提取紅霉素的方法
本發(fā)明涉及抗生素的提取方法,尤其涉及雙水相萃取法(ATPE)提取紅霉素的方法。
雙水相就是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽類溶于同一溶液,由于聚合物溶液間或聚合物與無機(jī)鹽溶液間具有不相容性,使得當(dāng)聚合物或無機(jī)鹽的濃度達(dá)到一定值以上時(shí),就會(huì)分成互不相溶的兩相系統(tǒng),由于其共同溶劑是水,就稱此系統(tǒng)為雙水相系統(tǒng)。一般認(rèn)為憎水性差異是產(chǎn)生相分離的主要推動(dòng)力。由于聚合物分子的空間位阻作用,相互間無法滲透,具有強(qiáng)烈的相分離傾向,混合時(shí)濃度達(dá)到一定時(shí),就不能形成單相溶液。常見的用于生物物質(zhì)分離的聚合物/聚合物系統(tǒng),有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖,聚合物/無機(jī)鹽系統(tǒng)有PEG/磷酸鹽,PEG/硫酸銨等。過去應(yīng)用價(jià)格高昂的葡聚糖大大限制了ATPE技術(shù)的工業(yè)規(guī)?;倪M(jìn)程。
在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi),總以為雙水相萃取法(ATPE)只能用于生物大分子的分離,并認(rèn)為生物小分子物質(zhì)在雙水相系統(tǒng)(ATPS)中應(yīng)趨于均勻分配。然而,自九十年代以來,國(guó)際上的研究結(jié)果和我們實(shí)驗(yàn)室的工作表明,用ATPE技術(shù)提取生物小分子,如氨基酸等也可取得較理想的效果。將ATPE技術(shù)提取生物小分子是一個(gè)嶄新的、有著應(yīng)用前景的領(lǐng)域,在一定程度上代表了ATPE技術(shù)的一種新發(fā)展趨勢(shì)。
自五十年代發(fā)現(xiàn)紅霉素以來,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,紅霉素的生產(chǎn)已經(jīng)走上了規(guī)?;牡缆?。目前主要的分離工藝有溶媒萃取法、離子交換法及大孔樹脂吸附法等。國(guó)內(nèi)普遍采用的為溶媒萃取法,溶媒萃取法又有溶媒反復(fù)萃取、溶媒萃取結(jié)合中間鹽沉淀以及薄膜濃縮結(jié)合溶媒萃取三條途徑。以上工藝中,以乳酸鹽沉淀法得到的成品質(zhì)量最好,收率也較高,國(guó)內(nèi)平均收率在72%左右,國(guó)外在80%左右。
在實(shí)際生產(chǎn)中,以上的提取工藝中都有一定的局限性。
用溶媒萃取和乳酸鹽中間鹽轉(zhuǎn)移法存在以下問題1.成本高,溶媒消耗量大,約為8kg/十億單位。大孔樹脂吸附法的溶媒消耗有所降低,但仍需3~4kg/十億單位。由于國(guó)內(nèi)工藝成本高,難以與國(guó)際市場(chǎng)上同類產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng),1990年開始有相當(dāng)數(shù)量的紅霉素進(jìn)口,沖擊了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)。
2.醋酸丁酯不僅價(jià)格貴,而且易燃、易爆,車間要求嚴(yán)格,勞保費(fèi)用高。同時(shí)溶媒回收耗能大,廢液處理量大。
3.由于發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量高,萃取過程易發(fā)生乳化現(xiàn)象,因此需要高速離心萃取機(jī),投資大、設(shè)備的運(yùn)行、維修保養(yǎng)要求高、操作能耗大。
離子交換法由于發(fā)酵液中存在大量無機(jī)鹽離子而影響吸附率,并且樹脂在每次吸附后都需用酸堿處理,使之活化。
大孔樹脂吸附法中洗脫劑一般為醋酸丁酯,由于其與水互不相溶,不利于吸附操作和吸附劑的再生。
上述幾種提取方法中,有一個(gè)共同的程序是,都必須對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理,以除去蛋白質(zhì)、菌絲體等雜質(zhì),減少后續(xù)操作的乳化現(xiàn)象。預(yù)處理步驟分為加鹽、調(diào)pH和板框過濾等。對(duì)板框過濾,需選用適合的有機(jī)絮凝劑,過濾時(shí)要加助濾劑,并且板框過濾操作勞動(dòng)強(qiáng)度大、周期長(zhǎng)。這些步驟既費(fèi)時(shí)、又費(fèi)力、占用場(chǎng)地也較大,是整個(gè)工藝中較為薄弱的環(huán)節(jié)之一。
本發(fā)明的目的是提供一種方法簡(jiǎn)單、易于掌握、不受環(huán)境影響、見效快的雙水相萃取法提取紅霉素的方法。
為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采取下列措施,它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發(fā)酵液,發(fā)酵液濃度為3000~10000u/ml,加入分子量為1000~8000環(huán)氧乙烷—環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物130~190ml,K2HPO4·3H2O晶體300~420g,攪拌至溶解,室溫下靜置0.1~24小時(shí)以上,至分相徹底,紅霉素進(jìn)入上相中;b.醋酸丁酯反萃取上相250~370ml,加入31~310ml醋酸丁酯,用5~15%的NaOH調(diào)節(jié)pH為9.0~11.0,系統(tǒng)升溫至20~50℃,靜止3~27小時(shí)分相或離心分相,紅霉素進(jìn)入上相中;c.成鹽取酯相155ml,加入總體積0.8%~4%的NaCl于30~60℃水浴攪拌30分鐘,降至室溫,靜置1.5~4.5小時(shí),吸去水層,過濾除不溶性雜質(zhì);在攪拌下,緩緩加入預(yù)先稀釋在醋酸丁酯中的20%乳酸稀釋液,加入量按乳酸∶紅霉素=1∶(4~6)w/w計(jì)算,加完時(shí)pH應(yīng)為5~7,繼續(xù)攪拌20分鐘以上,過濾,待完全濾完后,再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1~3次,在35~55℃溫度下干燥4~12小時(shí),得紅霉素乳酸鹽;d.將計(jì)量的蒸餾水,丙酮混合,攪拌下加入紅霉素乳酸鹽,其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)=1∶(30~50)∶(3~5),過濾后,濾液用5~15%Na2CO3溶液,調(diào)節(jié)pH至9~11攪拌10~50分鐘,升溫至40~70℃趁熱抽濾,得紅霉素堿濕品;濕品于30~60℃,500~750mmHg,真空干燥12~36小時(shí),得成品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)①分相迅速在實(shí)驗(yàn)中觀察到,采用ATPE處理發(fā)酵液,約30分鐘左右即可分相,且無乳化層,處理時(shí)間較傳統(tǒng)預(yù)處理時(shí)間短,縮短了整個(gè)工藝周期。
②過程集成雙水相萃取既達(dá)到了預(yù)處理的目的,又濃縮了料液。表現(xiàn)為,大量的蛋白質(zhì)、菌絲體在下相(富鹽相)中沉淀下來,紅霉素進(jìn)入上相,上相體積較發(fā)酵液大為減少,濃縮倍數(shù)達(dá)到了4以上,充分體現(xiàn)了雙水相技術(shù)適用于生物產(chǎn)品粗分離的特點(diǎn)。
同時(shí),由下相經(jīng)過離心分離后,得到蛋白質(zhì)等副產(chǎn)品,可直接作為飼料,而傳統(tǒng)預(yù)處理中,由于使用了ZnSO4,沉淀下來的蛋白質(zhì)用作飼料會(huì)產(chǎn)生Zn2+中毒現(xiàn)象,需進(jìn)一步處理。
③節(jié)省溶媒采用薄膜濃縮工藝,將預(yù)處理過的發(fā)酵液濃縮到原體積的1/2.5-1/3后,再用醋酸丁酯反萃,醋酸丁酯用量比溶媒法節(jié)省30%,本法的濃縮倍數(shù)達(dá)到了4以上,因此有理由相信,此工藝也可大大節(jié)省溶媒用量。
④方法簡(jiǎn)單,易于掌握,不受環(huán)境影響,見效快。
下面結(jié)合實(shí)施例作詳細(xì)說明雙水相萃取法提取紅霉素的方法的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發(fā)酵液,發(fā)酵液濃度為3500~8500u/ml,加入分子量為1000~8000環(huán)氧乙烷—環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物155~170ml,K2HPO4·3H2O晶體340~380g,攪拌至溶解,室溫下靜置0.5~6小時(shí)以上,至分相徹底,紅霉素進(jìn)入上相中;b.醋酸丁酯反萃取上相290~330ml,加入62~93ml醋酸丁酯,用8~12%的NaOH調(diào)節(jié)pH為9.5~10.5,系統(tǒng)升溫至30~35℃,靜止8~16小時(shí)分相或離心分相,紅霉素進(jìn)入上相中;c.成鹽取酯相155ml,加入總體積1.5%~2.5%的NaCl于40~50℃水浴攪拌30分鐘,降至室溫,靜置2.5~3.5小時(shí),吸去水層,過濾除不溶性雜質(zhì);在攪拌下,緩緩加入預(yù)先稀釋在醋酸丁酯中的20%乳酸稀釋液,加入量按乳酸∶紅霉素=1∶(4.8~5.2)w/w計(jì)算,加完時(shí)pH應(yīng)為5.5~6.5,繼續(xù)攪拌20分鐘以上,過濾,待完全濾完后,再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1~3次,在40~50℃溫度下干燥5~7小時(shí),得紅霉素乳酸鹽;d將計(jì)量的蒸餾水,丙酮混合,攪拌下加入紅霉素乳酸鹽,其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)=1∶(35~45)∶(3.5~4.5),過濾后,濾液用8~12%Na2CO3溶液,調(diào)節(jié)pH至9.5~10.5攪拌25~35分鐘,升溫至50~60℃,趁熱抽濾,得紅霉素堿濕品;濕品于40~50℃,670~730mmHg,真空干燥20~28小時(shí),得成品。
本發(fā)明的基礎(chǔ)在于發(fā)現(xiàn)紅霉素在EOPO/K2HP04系統(tǒng)中分配的極大不對(duì)稱性表1給出了紅霉素在EOPO(1∶1)(4200)/K2HPO4ATPS的分配數(shù)據(jù)。紅霉素是強(qiáng)憎水性物質(zhì),根據(jù)相似相溶原則,紅霉素對(duì)EOPO具有某種親和性,使紅霉素能較易溶解在富含EOPO的上相中。而紅霉素發(fā)酵液中的雜質(zhì),如還原糖分配在下相,幾乎不影響紅霉素的分配和回收雜蛋白的分配系數(shù)在2-5左右,紅霉素對(duì)雜蛋白的分離因子約在10以上。紅霉素的萃取率在77.82-96.17%之間,收率在64.40-87.63%之間。
表3.1紅霉素純品在EOPO(1∶1)(4200)/K2HP04雙水相系統(tǒng)中的分配序 總組成 上相組成 下相組成 TLL 相體積 萃取率 收率號(hào) %wt %wt %wt %wt 上相 下相 相比 K G % %EOPO 鹽 EOPO 鹽 EOPO 鹽 ml ml1 13.50 6.00 30.56 1.71 1.03 9.11 30.44 4.00 5.30 0.75 4.65 3.49 77.82 64.402 14.52 7.00 33.00 1.48 0.53 11.12 33.87 4.00 5.20 0.77 6.56 0.51 83.46 66 763 15.49 7.99 40.37 1.08 0.28 12.53 41.69 4.00 5.20 0.77 10.30 7.93 88.85 76.74 16.51 8.99 43.41 0.86 0.21 14.45 45.29 3.60 5.60 0.64 39.10 25.05 96.17 87.63表中TLL=(Wt,1-Wb,1)2+(Wt,2-Wb,2)2]]>相比 R=Vt/Vb分配系數(shù)K=Ct/Cb分配率G G=K(Vt/Vb)萃取率 n=mt/mt+mb=RK/(1+RK)收率 Yt=mt/mtotal式中Vt,Vb-上相,下相的體積;Ct,Cb-紅霉素在上,下相中的濃度;Mt,Mb-紅霉素在上,下相中的質(zhì)量;Mtotal-系統(tǒng)中紅霉素的總量。
實(shí)施例雙水相萃取法提取紅霉素的方法的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發(fā)酵液,發(fā)酵液濃度為3921u/ml,加入分子量為1000~8000環(huán)氧乙烷—環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物162ml,K2HPO4·3H2O晶體360g,攪拌至溶解,室溫下靜置2小時(shí)以上,至分相徹底,紅霉素進(jìn)入上相中;b.醋酸丁酯反萃取上相310ml,加入70ml醋酸丁酯,用10%的NaOH調(diào)節(jié)pH為10,系統(tǒng)升溫至32℃,靜止12小時(shí)分相或離心分相,紅霉素進(jìn)入上相中;c.成鹽取酯相155ml,加入總體積1.5%~2.5%的NaCl于45℃水浴攪拌30分鐘,降至室溫,靜置2.5~3.5小時(shí),吸去水層,過濾除不溶性雜質(zhì);在攪拌下,緩緩加入預(yù)先稀釋在醋酸丁酯中的20%乳酸稀釋液,加入量按乳酸∶紅霉素=1∶5w/w計(jì)算,加完時(shí)pH應(yīng)為6.0,繼續(xù)攪拌20分鐘以上,過濾,待完全濾完后,再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1~3次,在45℃溫度下干燥6小時(shí),得紅霉素乳酸鹽;d.將計(jì)量的蒸餾水,丙酮混合,攪拌下加入紅霉素乳酸鹽,其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)=1∶40∶4,過濾后,濾液用10%Na2CO3溶液,調(diào)節(jié)pH至10.0,攪拌30分鐘,升溫至55℃趁熱抽濾,得紅霉素堿濕品;濕品于45℃,700mmHg,真空干燥24小時(shí),得成品。生物效價(jià)920u/mg,總收率71.2%。
權(quán)利要求
1.一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法,其特征在于它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發(fā)酵液,發(fā)酵液濃度為3000~10000u/ml,加入分子量為1000~8000的環(huán)氧乙烷—環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物130~190ml,K2HPO4·3H2O晶體300~420g,攪拌至溶解,室溫下靜置0.1~24小時(shí)以上,至分相徹底,紅霉素進(jìn)入上相中;b.醋酸丁酯反萃取上相250~370ml,加入31~310ml醋酸丁酯,用5~15%的NaOH調(diào)節(jié)pH為9.0~11.0,系統(tǒng)升溫至20~50℃,靜止3~27小時(shí)分相或離心分相,紅霉素進(jìn)入上相中;c.成鹽取酯相155ml,加入總體積0.8%~4%的NaCl于30~60℃水浴攪拌30分鐘,降至室溫,靜置1.5~4.5小時(shí),吸去水層,過濾除不溶性雜質(zhì);在攪拌下,緩緩加入預(yù)先稀釋在醋酸丁酯中的20%乳酸稀釋液,加入量按乳酸∶紅霉素=1∶4~6w/w計(jì)算,加完時(shí)pH應(yīng)為5~7,繼續(xù)攪拌20分鐘以上,過濾,待完全濾完后,再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1~3次,在35~55℃溫度下干燥4~12小時(shí),得紅霉素乳酸鹽;d.將計(jì)量的蒸餾水,丙酮混合,攪拌下加入紅霉素乳酸鹽,其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)=1∶30~50∶3~5,過濾后,濾液用5~15%Na2CO3溶液,調(diào)節(jié)pH至9~11,攪拌10~50分鐘,升溫至40~70℃趁熱抽濾,得紅霉素堿濕品;濕品于30~60℃,500~750mmHg,真空干燥12~36小時(shí),得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法,其特征在于它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發(fā)酵液,發(fā)酵液濃度為3500~8500u/ml,加入分子量為1000~8000環(huán)氧乙烷—環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物155~170ml,K2HPO4·3H2O晶體340~380g,攪拌至溶解,室溫下靜置0.5~6小時(shí)以上,至分相徹底,紅霉素進(jìn)入上相中;b.醋酸丁酯反萃取上相290~330ml,加入62~93ml醋酸丁酯,用8~12%的NaOH調(diào)節(jié)pH為9.5~10.5,系統(tǒng)升溫至30~35℃,靜止8~16小時(shí)分相或離心分相,紅霉素進(jìn)入上相中;c成鹽取酯相155ml,加入總體積1.5%~2.5%的NaCl于40~50℃水浴攪拌30分鐘,降至室溫,靜置2.5~3.5小時(shí),吸去水層,過濾除不溶性雜質(zhì);在攪拌下,緩緩加入預(yù)先稀釋在醋酸丁酯中的20%乳酸稀釋液,加入量按乳酸∶紅霉素=1∶4.8~5.2w/w計(jì)算,加完時(shí)pH應(yīng)為5.5~6.5,繼續(xù)攪拌20分鐘以上過濾,待完全濾完后,再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1~3次,在40~50℃溫度下干燥5~7小時(shí),得紅霉素乳酸鹽;d.將計(jì)量的蒸餾水,丙酮混合,攪拌下加入紅霉素乳酸鹽,其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)=1∶35~45∶3.5~4.5,過濾后,濾液用8~12%Na2CO3溶液,調(diào)節(jié)pH至9.5~10.5,攪拌25~35分鐘,升溫至50~60℃趁熱抽濾,得紅霉素堿濕品;濕品于40~50℃,670~730mmHg,真空干燥20~28小時(shí),得成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法,其特征在于它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發(fā)酵液,發(fā)酵液濃度為3921u/ml,加入分子量為1000~8000環(huán)氧乙烷—環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物162ml,K2HPO4·3H2O晶體360g,攪拌至溶解,室溫下靜置2小時(shí)以上,至分相徹底,紅霉素進(jìn)入上相中;b.醋酸丁酯反萃取上相310ml,加入70ml醋酸丁酯,用10%的NaOH調(diào)節(jié)pH為10,系統(tǒng)升溫至32℃,靜止12小時(shí)分相或離心分相,紅霉素進(jìn)入上相中,c.成鹽取酯相155ml,加入總體積1.5%~2.5%的NaCl于45℃水浴攪拌30分鐘,降至室溫,靜置2.5~3.5小時(shí),吸去水層,過濾除不溶性雜質(zhì);在攪拌下,緩緩加入預(yù)先稀釋在醋酸丁酯中的20%乳酸稀釋液,加入量按乳酸∶紅霉素=1∶5w/w計(jì)算,加完時(shí)pH應(yīng)為6.0,繼續(xù)攪拌20分鐘以上,過濾,待完全濾完后,再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1~3次,在45℃溫度下干燥6小時(shí),得紅霉素乳酸鹽;d.將計(jì)量的蒸餾水,丙酮混合,攪拌下加入紅霉素乳酸鹽,其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)=1∶40∶4,過濾后,濾液用10%Na2CO3溶液,調(diào)節(jié)pH至10.0,攪拌30分鐘,升溫至55℃趁熱抽濾,得紅霉素堿濕品;濕品于45℃,700mmHg,真空干燥24小時(shí),得成品。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種雙水相萃取法提取紅霉毒的方法。它是向紅霉素發(fā)酵液中加入一定量的環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物(EOPO)及K
文檔編號(hào)C07H17/08GKCN1054131SQ98104898
公開日2000年7月5日 申請(qǐng)日期1998年4月8日
發(fā)明者朱自強(qiáng), 李勉, 王軼雄, 關(guān)怡新, 姚善涇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (6),