專利名稱:從含蛋白質溶液中純化蛋白質的方法
發(fā)明所屬技術領域：
本發(fā)明是一種簡單、廉價并十分有效的結晶存在于含蛋白質溶液(如發(fā)酵肉湯)中的蛋白質(特別是酶)的方法。
發(fā)明背景工業(yè)用酶通常以液體或者無定形固體形式提供。它們之所以以無定形固體而不是以結晶固體供給，主要是因為一般都認為已知的結晶酶的方法太昂貴而不能應用于工業(yè)領域。
有關酶結晶有大量文獻。由于結晶酶的技術具有很強的經驗性，因而很難對特定結晶過程的結果一概而論。
現(xiàn)在大多數已知的蛋白質結晶方法的特有的要求是純凈的、濃縮的原始溶液；長的結晶時間；大量的化學藥品，例如鹽(參見，例如，生物技術和生物工程48(1995)pp.316-323)。
已描述一種工業(yè)酶的結晶過程，其中使用了一種水溶性聚合物(如聚乙二醇)(參見WO 95/01989)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種有效、廉價的方法，通過該方法可從含蛋白質溶液中獲得晶態(tài)蛋白質，特別是晶態(tài)酶，而且該方法不需要加入大量的化學藥品(如鹽)。本發(fā)明的方法的一個重要且十分有價值的特征是它能夠從不純的含蛋白質溶液(即除了含有所研究的蛋白質之外，還含有不同的其它物質的溶液)中分離出高純度的晶態(tài)蛋白質，特別是晶態(tài)酶。不純的溶液尤指含有其它蛋白質的溶液，如來源于發(fā)酵肉湯的溶液。本發(fā)明使短結晶時間內獲得高產率成為可能，而且該方法簡單、廉價、對環(huán)境無害、適合工業(yè)需求。
如前所說，本發(fā)明提供了一種以晶態(tài)形式從含蛋白質溶液(例如包含一種以上的蛋白質溶液，如來源于發(fā)酵肉湯的溶液)純化、分離蛋白質的方法，該方法包括(a)利用結晶有效量的與水混溶的有機溶劑處理含蛋白質溶液；然后(b)以晶態(tài)形式分離所研究的蛋白質。
應該了解本發(fā)明中特別相關的含蛋白質溶液是含水溶液(即，一般來說，其中水構成基本上所有或至少大部分溶劑，興趣蛋白質溶解于該溶劑中的溶液)。
發(fā)明詳述本發(fā)明特別提供了一種結晶存在于發(fā)酵肉湯中的蛋白質(或多肽)的方法。就此而言，術語″發(fā)酵″不僅指由微生物(如細菌或真菌)引起的分解或轉化過程，而且指由于動植物來源的細胞的作用引起的相應過程。
發(fā)酵肉湯除了包含興趣蛋白質或多肽外，通常還包含如底物化合物如碳水化合物、鹽、細胞和其它代謝物(如核酸，特定的興趣蛋白質或多肽之外的蛋白質或多肽)之類的許多其它物質。
當將本發(fā)明的方法運用于發(fā)酵肉湯時，最好首先對肉湯進行一次或多次固/液分離技術處理，例如絮凝、離心、過濾或微量過濾，或者是它們之間的任意組合。
本發(fā)明的方法顯得對相對不純的溶液作用效果非常好，在使用本發(fā)明的方法之前，通常不再需要通過層析方法(例如，從溶液中分離出無關蛋白質)純化發(fā)酵肉湯(或含蛋白質溶液，通過使用固/液分離技術處理發(fā)酵肉湯獲得)。
本發(fā)明的另一方面，在用有機溶劑處理之前，濃縮含蛋白質溶液。濃縮過程適合通過一個或多個已知的步驟來完成，例如超濾(逆滲透)或蒸發(fā)。
本發(fā)明的又一方面，含蛋白質溶液要經過去除低分子量物質(例如鹽)的步驟。這樣的處理包括滲濾和透析。
雖然含蛋白質溶液的濃縮對實施本發(fā)明的方法來說不是十分重要的，但它經常是出于產量和易于操作觀點的考慮。一般地說，依據本發(fā)明，興趣蛋白質在有機溶劑處理過的含蛋白質溶液中的濃度應在0.1-25％(重量)范圍內(％w/w；基于含蛋白質溶液的重量)，最好是在0.5-15％w/w的范圍內，特別是在5-15％w/w范圍內。
如上文所說明的，本發(fā)明中優(yōu)選的蛋白質是酶，例如水解酶(EC 3)[包括蛋白酶(肽酶，EC 3.4)；羧基酯水解酶(EC3.1.1)，如脂肪酶(例如三酰甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)；糖苷酶(EC 3.2)，如淀粉酶(例如α-淀粉酶，EC 3.2.1.1，β-淀粉酶，EC 3.2.1.2及葡糖淀粉酶，EC 3.2.1.3)，纖維素酶(例如內-1，4-β-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)和木聚糖酶(例如內-1，3-β-木糖苷酶，EC 3.2.1.32)]；氧化還原酶(EC 1)[包括酚氧化酶如漆酶(EC 3.10.3.2)和按EC 1.10.3分類的其它與漆酶有關的酶；過氧化物酶(EC 1.11)，如按EC 1.11.1.7分類的那些酶]；以及異構酶(EC 5)[包括木糖異構酶(EC 5.3.1.5)]。
酶本說明書和權利要求
書中使用的酶分類號(EC號)依據國際生物化學和分子生物學聯(lián)合命名委員會的推薦的命名法(1992)(學院出版公司，1992)。
蛋白酶按照本發(fā)明的方法可使其結晶的蛋白酶(肽酶)包括利用細胞的發(fā)酵過程獲得的蛋白酶，利用的細胞如微生物細胞，尤其是細菌或者真菌。也包括利用化學方法或遺傳方法修飾的這些蛋白酶的突變體。
蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選的是堿性微生物蛋白酶或類胰島素蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是那些從芽孢桿菌得來的枯草桿菌蛋白酶，例如枯草菌素Novo，枯草菌素Carlsberg，枯草菌素309，枯草菌素147和枯草菌素168(見WO 89/06279中所述)。類胰島素蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例豬和牛的來源)和WO 89/06270中所述的鐮孢屬蛋白酶。
合適的市售蛋白酶包括以Alcalase、Savinase、Durazym、及Esperase商品名出售的蛋白酶(Novo Nordisk A/S(丹麥))；以Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase商品名出售的蛋白酶(Gist-Brocades)；以Purafect與Purafect OXP商品名出售的蛋白酶(GenencorInternational)；以及以Opticlean與Optimase商品名出售的蛋白酶(Solvay Enzymes)。
脂肪酶按照本發(fā)明的方法可使其結晶的脂肪酶包括利用細胞的發(fā)酵過程獲得的脂肪酶，利用的細胞如微生物細胞，尤其是細菌或者真菌。也包括用化學方法或遺傳方法修飾的這些脂肪酶的突變體。
合適的脂肪酶的例子，包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如，如EP 258 068和EP 305 216中所描述的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如，如EP 238 023中所描述的，假絲酵母屬(Candida)脂肪酶，如Candidaantarctica脂肪酶，例如，如EP 214761所描述的Candida antarctica脂肪酶A或者B，諸如產堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)和假產堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcalisenes)脂肪酶之類的假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如，如EP218 272中所描述的，蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶，例如，如EP331376中所描述的，Pseudomonas stutzeri脂肪酶，例如，如BP 1,372,034中所公開的，Pseudomonas fluorescens脂肪酶，芽孢桿菌屬(Bacillus)脂肪酶，例如，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)脂肪酶(Dartois等，(1993)，生物化學生物物理學報1131，253-260)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)脂肪酶(WO91/16422)。
許多克隆的脂肪酶可以是本發(fā)明的興趣酶?？寺〉闹久赴ㄓ蒠amaguchi等描述的Penicillium camembertii脂肪酶，(Yamaguchi等，(1991)，基因103，61-67)，Geotricum candidum脂肪酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化學雜志106，383-388)，以及各種諸如Rhizopusdelemar脂肪酶(Hass M.J等，(1991)，基因109，117-113)，雪白根霉(Rhizopus niveus)脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，生物科學，生物技術，生物化學56，716-719)和Rhizopus oryzae脂肪酶之類的根霉屬(Rhizopus)脂肪酶。
也可以將諸如角質酶之類的其它類型的脂解酶進行結晶，例如，如WO88/09367所描述的由門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)生成的角質酶，或者由Fusarium solani pisi生成的角質酶(例如WO 90/09446所描述的)。
尤其令人感興趣的脂肪酶是諸如M1 LipaseMT，Luma fastMT和LipomaxMT(Gist-Brocades)，LipolaseMT和Lipolase UltraMT(NovoNordisk A/S)的脂肪酶，以及脂肪酶P″Amano″(Amano藥物有限公司)。
淀粉酶按照本發(fā)明的方法可使其結晶的淀粉酶(如α-或β-淀粉酶)包括利用細胞的發(fā)酵過程獲得的淀粉酶，利用的細胞如微生物細胞，尤其是細菌或者真菌。也包括用化學方法或遺傳方法修飾的這些淀粉酶的突變體。
有關的淀粉酶包括，例如，從芽孢桿菌屬(Bacillus)獲得的α-淀粉酶，特別是在英國書No.1,296,839中更詳細描述的一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的特定菌株。市售的淀粉酶是DuramylTM，TermamylTM，F(xiàn)ungamylTM和BANTM(由Novo Nordisk A/S提供的)以及RapidaseTM和Maxamyl PTM(由Gist-Brocades提供的)。
本發(fā)明相關的興趣酶是例如從芽孢桿菌屬，熱厭氧菌屬(Thermoanaerobactor或者Thermoanaerobacterium)獲得的CGT酶(環(huán)糊精葡聚糖轉移酶，EC 2.4.1.19)。
纖維素酶在本文中，術語″纖維素酶″指的是催化纖維素向葡萄糖降解的酶-纖維二糖，纖維三糖和其它纖維低聚糖。
本發(fā)明中特別合適的纖維素酶類型是內-1，4-葡糖酶(EC 3.2.1.4)，優(yōu)選的是重組內-1，4-葡糖酶。
按照本發(fā)明適合結晶的纖維素酶包括微生物纖維素酶，特別是細菌或真菌纖維素酶。細菌纖維素酶的有關例子是這樣一些纖維素酶，它們是來源于下組細菌或者可由下組細菌產生的纖維素酶，這組細菌選自假單胞菌屬(Pseudomonas)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，纖維單胞菌屬(Cellulomonas)，梭菌屬(Clostridium)，Microspora，棲熱袍菌屬(Thermotoga)，Caldocellum以及放線菌屬(Actinomycets)如鏈霉菌屬(Streptomyces)，高溫單孢菌屬(Termomonospora)和熱酸菌屬(Acidothemus)，特別是解纖維假單胞菌(Pseudomonas cellulolyticus)，燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)，糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)，Microspora bispora，褐色高溫單孢菌(Termomonospora fusca)，Termomonospora cellulolyticum和解纖維熱酸菌(Acidothemuscellulolyticus)。
相關的纖維素酶包括這樣的酸性纖維素酶，它們來源于下組真菌或者可由下組真菌產生，這些真菌選自由木霉屬(Trichoderma)，漆斑菌屬(Myrothecium)，曲霉屬(Aspergillus)，Phanaerochaete，脈孢菌屬(Neurospora)，Neocallimastix和葡萄孢屬(Botrytis)組成的屬，特別是選自綠色木霉(Trichoderma viride)，Trichoderma reesei，Trichodermalongibrachiatum，Myrothecium verrucaria，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，Phanaerochaete chrysosporium，粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)，Neocallimastix partriciarum和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)。
另一種令人感興趣的真菌纖維素酶是中性或者堿性纖維素酶，它們來源于下組真菌或可由下組真菌產生曲霉屬(Aspergillus)，青霉屬(Penicillium)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，腐質霉屬(Humicola)，耙菌屬(Irpex)，鐮孢屬(Fusarium)，Stachybotrys，帚霉屬(Scopulariopsis)，毛殼屬(Chaetomium)，疣孢霉屬(Mycogone)，輪枝孢屬(Verticillium)，漆斑菌屬(Myrothecium)，Papulospora，粘帚霉屬(Gliocladium)，頭孢霉屬(Cephalosporium)和頂孢霉屬(Acremonium)，例如選自Humicolainsolens，尖鐮孢(Fusarium oxysporum)，嗜熱毀絲霉(Myceliopthorathermophila)，微紫青霉(Penicillium janthinellum)和Cephalosporium sp.的真菌，優(yōu)選的是選自Humicola insolens，DSM 1800，尖鐮孢，DSM2672，嗜熱毀絲霉，CBS 117.65，以及Cephalosporium sp.，RYM-202的真菌。
其它興趣纖維素酶是纖維素酶的變體，其母本酶是真菌或者細菌來源的纖維素酶，例如可由真菌腐質霉屬(Humicola)，木霉屬(Trichoderma)或者鐮孢屬(Fusarium)的菌株產生纖維素酶。
氧化還原酶按照本發(fā)明的方法適合結晶的氧化還原酶包括過氧化物酶和氧化酶，如漆酶。
過氧化物酶特別令人感興趣的顯示過氧化物酶活性的酶是那些酶分類號為EC1.11.1.7的酶，這些酶的片段也顯示過氧化物酶活性。
通過本發(fā)明的方法適合結晶的過氧化物酶，是適宜由微生物(如真菌或細菌)產生的過氧化物酶。一些優(yōu)選的真菌包括屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢菌綱(Hyphomycetes)的菌株，例如，鐮孢屬(Fusarium)，腐質霉屬(Humicola)，木霉屬(Tricoderma)，漆斑菌屬(Myrothecium)，輪枝孢屬(Verticillum)，Arthromyces，卡爾黑霉屬(Caldariomyces)，Ulocladium，Embellisia，枝孢屬(Cladosporium)或者Dreschlera，特殊是尖鐮孢(Fusarium oxysporum)vertiginous(DSM2672)，Humicola insolens，Trichoderma resii，Myrotheciumverrucana(IFO 6113)，黃萎輪枝孢(Verticillum alboatrum)，大麗花輪枝孢(Verticillum dahlie)，Arthromyces ramosus(FERM P-7754)，Caldariomyces fumaso，Ulocladium chartarum，Embellisia alli或者Dreschlera halodes。
其它優(yōu)選的真菌包括屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)，擔子菌綱(Basidiomycetes)的菌株，例如鬼傘屬(Coprinus)，展齒革菌屬(Phanerochaete)，云芝屬(Coriolus)或者栓菌屬(Trametes)，特別是灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)f.microsporus(IFO 8371)，長根鬼傘(Coprinusmacrorhizus)，Phanerochaete chrysosporium(例如NA-12)或者栓菌屬(以前稱為多孔菌屬(Polyporus))，例如雜色栓菌(Trametes versicolor)(例如PR4 28-A)。
進一步優(yōu)選的真菌包括屬于接合菌亞門(Zygomycotina)，Mycoraceae綱的菌株，例如根霉屬(Rhizopus)或者毛霉屬(Mucor)，特別是凍土毛霉(Mucor hiemalis)。
一些優(yōu)選的細菌包括放線菌目(Actinomycetales)的菌株，例如，類球形鏈霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)，熱紫鏈霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)或者輪絲鏈輪絲菌輪絲亞種(Streptoverticillum verticillium ssp.verticillium)。
其它優(yōu)選的細菌包括短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)(ATCC12905)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)，Rhodomonas palustri，乳鏈球菌(Streptococcus lactis)，Pseudomonas purrocinia(ATCC 15958)或者熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)。
進一步優(yōu)選的細菌包括屬于粘球菌屬(Myxococcus)(例如，變綠粘球菌(Myxococcus virescens))的菌株。
與本發(fā)明的方法相關的特定的興趣是重組產生的過氧化物酶，例如，來源于Coprinus sp.的過氧化物酶，特別是按照WO 92/16634的長根鬼傘(Coprinus macrorhizus)或者灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)，或者其變體，例如如WO 93/24618和WO 95/10602所描述的變體。
漆酶以及與漆酶相關的酶在本發(fā)明的上下文中，漆酶和漆酶相關的酶包括由酶分類號EC1.10.3.2所包括的任何漆酶，由酶分類號EC 1.10.3.1所包括的任何chatechol氧化酶，由酶分類號EC 1.3.3.5所包括的任何膽紅素氧化酶或者由酶分類號EC 1.14.18.1所包括的任何一元酚單加氧酶。
合適的漆酶是微生物來源的漆酶，特別是由細菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)漆酶得來的漆酶。合適的例子包括由曲霉屬，脈孢菌屬(Neurospora)(例如Neurospora crassa)，柄孢殼屬(Podospora)，葡萄孢屬(Botrytis)，金錢菌屬(Collybia)，層孔菌屬(Fomes)，香菇屬(Lentinus)，側耳屬(Pleurotus)，栓菌屬(Trametes)(例如Trametes villosa和雜色栓菌(Trametes versicolor))，絲核菌屬(Rhizoctonia)(例如立枯絲核菌(Rhizoctonia solani))，鬼傘屬(Coprinus)(例如褶紋鬼傘(Coprinus plicatilis)和灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus))，Psatyrella，毀絲霉屬(Myceliophthora)(例如Myceliophthora thermophila)，Schytalidium，多孔菌屬(Polyporus)(例如Polyporus pinsitus)，射脈菌屬(Phlebia)(例如Phlebia radita(WO 92/01046))，或者云芝屬(Coriolus)(例如毛云芝(Coriolus hirsutus)(JP 2-238885))的菌株產生的漆酶，特別是由栓菌屬(Trametes)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，Schytalidium或者多孔菌屬(Polyporus)可獲得的漆酶。
有機溶劑一般來說，適合于本發(fā)明的方法使用的與水混溶的有機溶劑是這樣一類物質，其在標準大氣壓下，溫度為25℃或在25℃左右(包括溫度大約達30℃)時是液體。水溶性聚合物，如WO 95/01989中所公開的水溶性聚合物(其中一些如聚乙二醇，其在分子量范圍的低限，在上述的溫度及壓力條件下可能為液體)，不在本文所說的與水混溶的有機溶劑范圍之內。
本發(fā)明中適合的與水混溶的溶劑包括各種低級脂族醇，特別是C1-C3脂族醇，以及低級脂族酮，特別是C3-C5酮。
優(yōu)選的與水混溶的有機溶劑是能與水以任意比例混合的溶劑。在這一范疇之內的低級脂族醇包括所有的C1-C3脂族醇(即甲醇，乙醇，1-丙醇和2-丙醇)和C4叔丁基醇(2-甲基-2-丙醇)；甲醇，乙醇及2-丙醇是特別優(yōu)選的。同樣地，優(yōu)選的C3-C5酮是丙酮(2-丙酮)。
其它與水混溶的低級脂族醇，如2-丁醇和異丁基醇(2-甲基-1-丙醇)以及與水混溶的C3-C5酮，如甲乙酮(2-丁酮)和二乙基酮(3-戊酮)，可能適合于在本發(fā)明的某些實施方案中使用。
本發(fā)明中另外一些令人感興趣的與水混溶的有機溶劑包括二醇，特別是低級脂族二醇，如乙二醇(1，2-二羥基乙烷)，1，2-丙二醇(1，2-二羥基丙烷)和1，3-丙二醇(1，3-二羥基丙烷；也稱為三亞甲基二醇)。
利用水溶性聚合物如聚乙二醇和聚丙二醇，使工業(yè)用酶從含蛋白質及各種其它物質/雜質(包括其它蛋白質)溶液中結晶出來，雖然對該方法已有所描述(參見WO 95/01989)，但本發(fā)明的發(fā)明者并不了解以前的任何公開內容是否就表明或者意味著簡單的與水混溶的有機溶劑，如乙醇及其類似物，能成功地、可靠地從不純的溶液，特別是從含其它種類蛋白質的溶液(如來源于發(fā)酵肉湯的溶液)中獲得結晶蛋白質。確實，這樣的溶劑似乎一般都被認為對水溶液中的蛋白質分子(如酶)有毒害作用(例如使其變性)。這樣，例如，在A.McPherson的一篇有關蛋白質和核酸的結晶作用的評論性文章[歐洲生物化學雜志189(1990)，pp.1-23]中，論述到(參見P.5)(附加強調)″......使常規(guī)分子結晶的普通方法，如蒸發(fā)或溶解，劇烈的溫度變化，或加入強的有機溶劑，都是不合適的并具破壞性。必須以更溫和的并受限制的技術取代它們″。
關于早期的報告中所述的利用有機溶劑作為蛋白質或者核酸的沉淀劑，后面的參考文獻進一步進行了論述(參見P.12)(附加強調)″一般來說，使用的最普通的有機溶劑是乙醇，丙酮，丁醇和其它一些普通的實驗室試劑……這里我們可能注意到，有機溶劑用于核酸結晶已屬于一般的應用，特別是對tRNA和雙鏈寡核苷酸。它們是促使晶體生長的重要手段。這部分是因為多核苷酸對有機溶劑的較強的耐性，以及它們的多陰離子表面對電解質作用的敏感度似乎要強于蛋白質。
唯一的規(guī)則是有機溶劑應在低溫下使用，在0℃或者在0℃以下，且應慢慢地加入并進行充分混合......″。
關于促進蛋白質晶體的生長，McPherson的參考文獻進一步指出(參見P.19)(附加強調)″的確，促進周期性鍵的形成是為了確保分子群能盡可能均勻地形成晶體......它不僅意味著除去污染了的、不必要的一些蛋白質，而且在靶群體中，所有個體都表現(xiàn)為物理和化學性質的絕對一致......″。
令人感到十分驚訝的是發(fā)現(xiàn)從不純的含蛋白質溶液(如來源于發(fā)酵肉湯的溶液，包含一種以上的蛋白質)中結晶出想要的蛋白質，特別是酶，可利用一種簡單的、與水混溶的有機溶劑來完成，例如乙醇，一般來說沒有什么特殊要求，例如象McPherson(loc.cit)所講述的那樣，在加入有機溶劑時在低溫下操作或采取其它特殊措施。
本發(fā)明的方法所使用的與水混溶的溶劑通常以一定量加入所研究的含蛋白質溶液中，溶劑在最終混合物中的重量濃度范圍為1-50％w/w，經常是5-50％w/w，如10-50％w/w，例如20-45％w/w。然而，在某些情況下，如當用本發(fā)明的方法使某些脂肪酶(脂解酶)結晶時，有必要使用較高的溶劑濃度，例如溶劑/含蛋白質混合溶液的對應量為90％w/w，或可能甚至更多。
依據本發(fā)明，對含蛋白質溶液加入與水混溶的有機溶劑可通過以下方式，例如不斷地逐漸地摻入溶劑；或分相同或者不同量的幾部分加入溶劑；或者一次加入全部溶劑。特別是加入溶劑方式的選擇，不僅基于興趣蛋白質或多肽的溶解性，而且基于除此之外的各種物質/雜質的溶解性。
通過例子，可以考慮這樣一種情況從一種十分不純的含蛋白質溶液，例如包含許多組分的發(fā)酵肉湯中結晶出脂肪酶。如上所述，某種程度上在包含高比例的低級醇，如乙醇的含水媒介中，脂肪酶的溶解性經常要大于其它類型的酶；而且該脂肪酶結晶作用需要的溶劑濃度十分高，以致于在濃度達到足以使其開始結晶之前，溶液中其它組分就從中分離(例如沉淀)出來。在這種情況下，為了避免固體，脂肪酶晶體和固相雜質的污染，就希望間斷地加入部分溶劑以使不需要的固相雜質分離，并隨后除去(例如過濾)。當這些雜質從溶液分離并從中除去時，進一步增加有機溶劑的濃度至足夠水平以便使所研究的酶開始結晶。
如果合適，不止一種與水混溶的有機溶劑適合于本發(fā)明的方法。這樣，例如使用結晶有效量的兩種或多種與水混溶的有機溶劑的混合物(有合適的比例)，可能引起所研究的蛋白質的結晶作用?；蛘撸缈梢詫⑦m量不同的與水混溶的有機溶劑逐步加入含蛋白質溶液。
在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，除與水混溶的有機溶劑之外，合適的鹽可加入含蛋白質溶液中。這些合適的鹽就其本身性質可促使蛋白質結晶，例如酶的結晶，這樣的鹽包括醋酸鹽，硫酸鹽(HSO4-/SO42-)，碳酸鹽(HCO3-/CO32-)和磷酸鹽(H2PO4-/HPO42-/PO43-)，例如堿金屬(如Li+，Na+或K+)鹽，堿土金屬鹽(如Ca2+鹽或Mg2+鹽)。
在本說明書中，當這樣的鹽與與水混溶的有機溶劑一道加入含蛋白質溶液時，將要加入鹽的適當的量將特別取決于加入的有機溶劑的量。這樣，例如當完成本發(fā)明的方法的一個實施方案時，其中的溶劑濃度(在含蛋白質溶液和與水混溶的有機溶劑的混合物中)在通常的濃度范圍的上限(例如在50％w/w附近)時，典型的是加入正在談論的這種類型的鹽以致于鹽濃度達到0.5-1％w/w。然而，如果使用低濃度的有機溶劑，增加鹽濃度也可能是比較適當的。
明顯地，優(yōu)選類型的與水混溶的有機溶劑在所談論蛋白質的結晶作用完成之后，一般將是能從余液中重新獲得的(例如通過蒸餾)，同時從環(huán)境和經濟的高度需求角度考慮，本發(fā)明的方法中有關再循環(huán)和再利用這樣的有機溶劑是切實可行的。
調節(jié)pH值含蛋白質溶液的pH值，通過加入與水混溶的有機溶劑來調節(jié)至一最理想值，其有利于蛋白質的結晶，且首先是有利于蛋白質的穩(wěn)定。對于一種給定蛋白質(例如酶)，最理想的pH值取決于其確切的性質，特別是可通過試驗來確定。例如典型地從pH10開始完成結晶過程，然后是pH9，pH8，pH7……等依次至pH3。如果發(fā)現(xiàn)，例如一種給定酶的最理想pH值在4和5之間，那便在這一pH范圍內再做試驗以更精確地確定最適pH值。大多數酶的最適pH值通常都在pH4-9范圍內。
在某些情況下，可能調節(jié)pH值等于所談論蛋白質的等電點(pI)，或在該值附近時比較好。這樣，在本發(fā)明的方法的某些實施方案中，就將pH值調節(jié)在(pI-1)≤pH≤(pI+1)范圍內。
在其它情況下，可能在結晶作用過程中逐漸改變pH值比較好(即使用pH梯度)，或者也可以在結晶作用過程中逐步地變化pH值。
任何合適的酸或者堿都可用來調節(jié)pH值。使用的酸可能是無機酸或有機酸。一些例子中使用的是鹽酸，硫酸，亞硝酸，磷酸，乙酸，檸檬酸和甲酸。優(yōu)選的酸是磷酸，甲酸，檸檬酸和乙酸。優(yōu)選的堿是氫氧化鈉，氫氧化鉀和氨水，特別是氫氧化鈉。
結晶作用不加入任何晶種開始結晶作用過程，在不到48小時的結晶時間內，經常是在36小時或更少時間內及在24小時或更少的時間內，利用本發(fā)明的方法結晶作用結果可能達到令人滿意的程度。依賴于實施的特定條件，包括將要結晶的蛋白質或多肽的性質和存在于含蛋白質溶液中的其它物質(雜質)的性質，在12小時或更少的時間內，甚至某些情況下在6小時或更少的時間內，結晶作用結果經常也可以達到令人滿意的程度。
溫度利用本發(fā)明的方法時，通常在0℃以上興趣蛋白質(酶)自然進行結晶作用。一般來說，從中結晶蛋白質的含蛋白質溶液，其適宜的溫度是0-40℃，優(yōu)選0-30℃，尤其典型的是5-30℃，如大約7℃到大約28℃。
如果合適的話，可使用溫度梯度。例如開始于一相對較低溫度(如0-7℃范圍內的任一溫度)，然后在合適的時間段內(如時間段為幾個小時)逐漸(或也可逐步)增加溫度至最后所要求的溫度。本發(fā)明的方法的許多實施方案中，當使用漸進或逐步的溫度增加時，最后溫度經常是在25℃左右(例如大約22℃到大約28℃)結晶后的分離本發(fā)明的方法導致蛋白質(例如酶)的結晶。分離結晶蛋白質可通過常規(guī)方法來完成，例如離心和/或過濾，也可干燥分離產物。
如果分離的蛋白質，特別是酶，隨后要成為粒狀，就適合從潮濕產物開始直接進行標準成粒過程。然后在成粒過程中進行烘干。
如果要求結晶產物純度十分高，可將本發(fā)明方法的初始結晶產物(一般具有相當高的純度)再溶解于合適的含水介質至適當濃度，并重結晶，例如通過本發(fā)明的方法。其它用于重結晶基本上純的蛋白質(例如酶)的方法，也可以使用。當然，按照需要重結晶可以重復一次或多次。
最后的結晶產物可能如以下方式進行分配和/或利用。例如，如果需要，有可能將晶體溶解于合適的介質中至適當濃度以便生成液相產物。
本發(fā)明進一步涉及到按照本發(fā)明的方法可獲得的，或已獲得的結晶蛋白質產物。
本發(fā)明的純化/結晶方法被認為不僅適用于蛋白質或多肽，而且適用于各種其它類型物質，包括寡肽和包含寡肽序列的化合物。這樣的物質包括，如某些肽激素。
下列例子將進一步說明本發(fā)明，這無意以任何方式限制本發(fā)明范圍實施例1利用乙醇的Humicola insolens纖維素酶結晶作用Humicola insolens纖維素酶(內-1，4-β-葡聚糖酶)在米曲霉中克隆。包含正談論的酶和其它發(fā)酵副產物的發(fā)酵肉湯進行轉鼓式過濾后，再進行超濾(利用Dow DDS Gr61pp膜；截斷值大約20kD)。超濾濃縮液進一步經過2倍體積的去離子水滲濾去除低分子量物質(例如鹽)。最后的溶液每升包含87克纖維素酶(溶液中干物質含量為51％w/w)，且pH值為6.7，比電導率為0.7mS/cm。
45.9g無水(99.9％)乙醇邊攪拌邊加至100g的纖維素酶溶液中，溫度保持在27℃。17小時之后，得到的晶體通過離心收獲。測定再溶解于0.1％w/w NaCl水溶液(8倍于晶體體積)的結晶產物的纖維素分解活性，基于此的產率是85.4％。
為了測定纖維素分解活性(例如，用所謂的S-CEVU單位表示)，要測定的一份后來的酶溶液(結晶產物再溶解于0.1％w/w的NaCl中)與羧甲基纖維素(CMC；酶底物)一起溫育，反應條件如下溫度 40℃(恒溫箱)pH 7.5(包含0.1％w/w PEG 6000的0.1M磷酸緩沖液)底物濃度 3.11％(在pH為7.5的緩沖液中)酶濃度范圍 0.097-0.181 S-CEVU/ml溫育時間 30分鐘底物的纖維素分解性降解導致粘度的降低，粘度用振動粘度計(Mivi3000，Sofraser，法國)測定。粘度的降低與樣品的纖維素分解活性成比例。用S-CEVU(穩(wěn)定的纖維素酶粘度單位)表示的活性測定與一種合適的Novo Nordisk A/S纖維素分解酶標準有關。
實施例2(對比例)利用PEG 300的Humicola insolens纖維素酶的結晶作用將39.6g的聚乙二醇300(PEG 300；來自BASF)邊攪拌邊加至100g如實施例1中的纖維素酶溶液中，溫度保持在27℃。20小時之后，得到的晶體通過離心收獲。測定方法如實施例1中所述，其產率是83％。
從上述例子明顯看出，使用乙醇導致的結晶產物產率要高于使用PEG 300的產率。
實施例3利用2-丙醇或丙酮的Humicola insolens纖維素酶結晶作用一批未經加工的包含H.insolens纖維素酶(內-1，4-β-葡聚糖酶)的發(fā)酵肉湯在米曲霉中克隆，用等重量的水稀釋。加入10％(w/w)氫氧化鈉水溶液調節(jié)稀釋肉湯的pH為9.5，之后進行轉鼓式過濾，然后利用Seitz EK1濾墊進行細菌過濾。
得到的濾液進行超濾(利用Dow DDS Gr6lpp膜)至干物質含量為22％w/w。超濾濃縮液進一步用3倍體積的自來水滲濾，然后在30℃、pH為5.5條件下，用3％(w/w)的PicatifTMFGV 120活性炭進行碳處理2小時。通過Seitz K900濾墊和Seitz EK1濾墊過濾除去碳。最后的濃縮液的比電導率為1.06ms/cm。
給定濃縮液(含纖維素酶溶液)的純度可通過一比值的大小來表示，該比值為濃縮液在440nm處的光密度(OD)與一升溶液中活性纖維素酶的重量(單位g)之比，即OD440/g活性纖維素酶。該值越高，純度越低。對于以上經碳處理的、過濾過的濃縮液，這一比值是21.7，可與以下的測定值比較(參見以下內容)。按照本發(fā)明的方法，分別利用2-丙醇和丙酮作為與水混溶的有機溶劑制備結晶纖維素酶，溶液中包含這些酶，測定方式相同。
為了檢驗2-丙醇和丙酮各自對興趣纖維素酶結晶作用的有效性，在調節(jié)碳處理過的，過濾過的濃縮液pH值為6.5之后，取出部分樣品。
5℃條件下，分別取出30％w/w和35％w/w量(相對濃縮液的重量)的兩種溶劑，分別加入等量的濃縮液并與之混合。保持此溫度15分鐘之后，升高溫度至28℃并保持24小時。得到的晶體懸浮液通過離心收獲，將每種晶體塊溶解在8倍體積的0.1％(w/w)氯化鈉水溶液中進行配制。測定每一溶液的纖維素酶活性(以S-CEVU計；參見實施例1)和OD440nm。結果總結在下表中
從以上的結果可明顯看出，在本發(fā)明的方法的實施方案中，利用2-丙醇或丙酮作為與水混溶的有機溶劑都獲得了高產率和高純度的結晶酶產物(在此為纖維素酶)。
權利要求
1.一種從發(fā)酵肉湯中以晶態(tài)形式純化和分離酶的方法，該方法包括(a)利用1-90％w/w的與水混溶的有機溶劑處理所說的發(fā)酵肉湯；并且(b)以晶態(tài)形式分離所研究的酶，其條件是所說的與水混溶的有機溶劑不是水溶性聚合物，其中所說的與水混溶的有機溶劑選自乙醇、2-丙醇和丙酮中任一種。
2.按照權利要求
1的方法，其中在加入所說的有機溶劑之前，先濃縮所說的發(fā)酵肉湯。
3.按照權利要求
1的方法，其中在加入所說的有機溶劑之前，所說的酶在所說的發(fā)酵肉湯中的濃度在0.1-25％w/w范圍內。
4.權利要求
3的方法，其中在加入所說的有機溶劑之前，所說的酶在所說的發(fā)酵肉湯中的濃度在0.5-15％w/w范圍內。
5.權利要求
4的方法，其中在加入所說的有機溶劑之前，所說的酶在所說的發(fā)酵肉湯中的濃度在5-15％w/w范圍內。
6.按照權利要求
1的方法，其中所說的結晶作用發(fā)生在0℃以上。
7.按照權利要求
1的方法，其中所說的酶選自由蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶和氧化還原酶組成的組。
專利摘要
一種以晶態(tài)形式從含蛋白質溶液中純化、分離蛋白質的方法，該方法包括用結晶有效量的與水混溶的有機溶劑(例如一種低級脂肪醇或酮)處理含蛋白質溶液；以晶態(tài)形式分離所研究的蛋白質。
文檔編號C12N9/00GKCN1216899SQ97193043
公開日2005年8月31日 申請日期1997年3月14日
發(fā)明者A·蘭克-馬德森, M·A·勞斯特森 申請人:諾沃奇梅茲有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan