專利名稱:海洋芽孢桿菌b-9987產脂肽類化合物及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及源于渤海潮間帶植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa)的海洋芽孢桿菌 (B. marinus)B-9987產生的具有拮抗植物病原菌活性的新的環(huán)脂肽化合物Marihysin A及 其制備方法和在農藥方面的應用。
背景技術：
由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋微生物具有不同于陸地微生物的一些獨特的 代謝途徑，因而能產生大量的結構新穎的活性代謝產物。如從海洋真菌頂頭孢霉 (Cephalosporiumacremonium)中分離并成功上市的第一個海洋新抗生素——頭孢菌素，開 創(chuàng)了開發(fā)海洋抗生素的先河。
海洋芽孢桿菌能產生許多有價值的物質。Carisse等(2003年)從堆肥中(包 括造紙廠淤泥、植物殘體等成分)分離出海洋芽孢桿菌，平板拮抗實驗和盆栽試驗均表明 其對黃瓜猝倒病菌——終極腐霉(Pythium ultimum)的生長有較強抑制作用。張海龍等 (2004年)從海洋芽孢桿菌中發(fā)現了 3個新環(huán)脂肽化合物Mixirin A-C，它們具有細胞毒 作用。Ashish等(2006年)發(fā)現海洋芽孢桿菌產的纖維素酶在pH 6和50°C時活性較好。 Noureddin等(2006年)發(fā)現海洋芽孢桿菌可以產葡萄糖_6_磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄 糖脫氫酶。田黎等O007年)報道了一株海洋芽孢桿菌B.marinus B-9987產生的3個新 的大環(huán)內酯類化合物Macrolactin 0、P和Q，研究發(fā)現，這3個新化合物對交鏈孢和稻瘟霉 具有很好的抑制活性。此外還發(fā)現，含有該類物質的海洋芽孢桿菌B.marinus B-9987發(fā)酵 濃縮液可有效抑制植物病原菌的生長。海洋芽孢桿菌因其具有抑菌作用強、抗逆性強及易 于加工成劑型等諸多優(yōu)勢，十分適合于開發(fā)成微生物農藥。發(fā)明人所在課題組成功研發(fā)的 10億CFU/g海洋芽孢桿菌可濕性粉劑作為農藥非常安全，屬微毒類農藥，初步的盆栽和田 間小區(qū)試驗結果表明該可濕性粉劑對灰霉病、白粉病、青枯病、軟腐病、早疫病、霜霉病具有 較好的防治效果(中國專利申請公開號CN101331881)。
脂肽類物質主要來源于微生物的次級代謝產物，由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈 兩部分組成，分為線性脂肽和環(huán)狀脂肽兩大類。由于其特殊的兩親分子結構造就了微生物 脂肽具有優(yōu)良的表面活性，在醫(yī)藥、食品、化妝品、生物防治、環(huán)境治理及微生物采油等領域 有重要的應用前景。
環(huán)脂肽類化合物多數具有抗菌活性，其中最為成功的例子是達托霉素，它是第一 個應用于臨床的環(huán)脂肽類抗生素，用于治療由革蘭陽性菌感染所致的并發(fā)性皮膚及皮膚結 構感染，包括甲氧西林耐藥菌金葡菌及對萬古霉素抗性的糞腸球菌，作用機制獨特。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一類重要的根際微生物，能夠促進植物 抵抗病原菌的侵染，因而被廣泛應用于植物病害的生物防治。B. subtilis能夠產生幾十 種不同結構的抗生素，其中非核糖體合成的脂肽類抗生素是其中最常見的一類，主要包括 iturin、surfactin和fengyciM個家族。脂肽類抗生素由氨基酸鏈和脂肪酸側鏈組成， 穩(wěn)定性好，對人畜無害，不污染環(huán)境，是具有重要開發(fā)價值的新型生物源農藥。國外有報道iturin成功應用于生物防治的例子(Klich MA，1994)。
Catherine等(2001年)發(fā)現脂肽類生物表面活性劑能選擇性除去土壤中的Pb、 ZruCu和Cd等金屬離子，其中Cu2+最易去除。
黃現青等(2006年)研究發(fā)現，枯草芽孢桿菌fmbj株產生的抗微生物脂肽可以直 接作用于體外抗偽狂犬病病毒(Pseudorabies viru)和豬細小病毒(Porcine parvoviru) 南京株，從而抑制其對豬腎(Porcine Kidney)細胞的感染作用。
Kim等(2007年)研究發(fā)現，環(huán)脂肽Surfactin (MW 1036)能夠抑制Lovo細胞的增 殖，誘導細胞凋亡，其作用機制可能為抑制細胞生存調節(jié)信號通路ERK和PII/Akt。
王大威等(2008年)研究發(fā)現，從大慶油田中分離到的一株枯草芽孢桿菌 (BaCillUSSUbtiliS)ZW-3產生的脂肽類生物表面活性劑具有優(yōu)良的乳化和降低油水界面 張力的能力，并可以適應油藏中復雜的環(huán)境，可提高采收率9.2%，在微生物采油中具有非 常好的應用前景。
薛春美等(2008年)報道從海洋芽孢桿菌中分離得到了 Macrolactin T和U以及 已知結構Macrolactin A、B、D、0、S，其中Macrolactin T、B、D對稻瘟病菌、番茄早疫病菌 及金黃色葡萄球菌具有拮抗作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明者經過研究發(fā)現，由海洋芽孢桿菌仉111虹1皿8)8-9987產生的1個新環(huán) 脂肽化合物Marihysin A對茄交鏈孢(Alternaria solani)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. cuberse)等植物病原菌均具有很好的抑制活性，因此可以用作農藥來防 治由這些病原菌引起的植物病害。
本發(fā)明的目的在于提供來源于海洋芽孢桿菌(B. marinus)B-9987產生的一個新 的具有應用價值的環(huán)脂肽化合物及其制備方法和應用。具體地說，本發(fā)明第一方面提供具 有新結構環(huán)脂肽化合物Marihysin A，所述化合物結構如下圖所示
權利要求
1.脂肽類化合物，所述化合物具有以下結構
2.一種制備權利要求
1所述的化合物的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)海洋芽孢桿菌(BacillusmarinuS)B-9987，得到發(fā)酵液；(2)用一種或多種選自有機溶劑萃取、酸沉淀、浸提或層析的方法從所述發(fā)酵液中分離 獲得所述化合物。
3.如權利要求
2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)包括以下一個或多個步驟(a)從所述發(fā)酵液分離得到上清液，用選自乙酸乙酯、氯仿、醋酸丁酯或正丁醇的溶劑 萃取，然后用柱層析以氯仿/甲醇梯度洗脫，收集氯仿/甲醇為2 1至0 1的洗脫部位， 用kphadex LH-20和/或HPLC制備得到權利要求
1所述的化合物；(b)從所述發(fā)酵液分離得到上清液，使上清液酸化沉淀，用無水甲醇對酸化沉淀浸提， 浸提液用柱層析以氯仿/甲醇梯度洗脫，收集氯仿/甲醇為2 1至0 1的洗脫部位，用 SephadexLH-20和/或HPLC制備得到權利要求
1所述的化合物；(c)從所述發(fā)酵液分離得到菌體，用無水甲醇浸提，浸提液用柱層析以氯仿/甲醇梯度 洗脫，收集氯仿/甲醇為2 1至0 1的洗脫部位，用kphadex LH-20和/或HPLC制備 得到權利要求
1所述的化合物。
4.如權利要求
3所述的方法，其特征在于，所述柱層析是硅膠柱層析。
5.如權利要求
3所述的方法，其特征在于，所述HPLC的制備條件均為70%甲醇溶液。
6.一種農藥組合物，其特征在于，所述組合物包含權利要求
1所述的化合物作為活性 組分，以及農藥學上可接受的載體。
7.權利要求
1所述的化合物在作為農藥中的應用。
8.如權利要求
7所述的應用，其特征在于，所述農藥用于抑制選自番茄早疫病菌 (A. solani)、甜瓜果腐病菌(F. oxysporum)、棉花黃萎病菌(V. alboatrum)、小麥赤霉病菌 (F. graminearum)、白術白絹病菌(Sclerotium sp·)、青霉病菌(Penicillium sp·)、黃瓜 灰霉病菌(B. cinerea)、番茄灰霉病菌(B. cinerea)、玉米小斑病菌(D. turcica)、水稻紋枯 病菌(R. solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)、香蕉 古萎病菌(F. oxysporum f. sp. cuberse)的植物病原菌。
9.一種防治植物病害的方法，其特征在于，將權利要求
1所述的化合物或權利要求
6所 述的農藥組合物施加到所述植物上。
10.如權利要求
9所述的方法，其特征在于，所述植物病害的病原菌選自番茄早疫病 菌(A. solani)、甜瓜果腐病菌(F. oxysporum)、棉花黃萎病菌(V. alboatrum)、小麥赤霉病頁菌(F. graminearum)、白術白絹病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌(Penicillium sp.)、黃 瓜灰霉病菌(B. cinerea)、番茄灰霉病菌(B. cinerea)、玉米小斑病菌(D. turcica)、水稻 紋枯病菌(R. solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp·)、香蕉枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cuberse)、番爺青枯病菌(R. solanacearum)、白菜軟腐病菌(E. carotovora var. carotovora)。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新的海洋芽孢桿菌B-9987產脂肽類化合物。本發(fā)明還涉及所述化合物的制備方法以及該化合物作為農藥的應用。
文檔編號C12P21/04GKCN102060914SQ200910198737
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月13日
發(fā)明者劉榮峰, 張道敬, 李元廣, 李淑蘭, 沈國敏, 田黎, 羅遠嬋, 陶黎明, 魏鴻剛 申請人:上海澤元海洋生物技術有限公司, 華東理工大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan