專利名稱：:用于預(yù)防核酸擴(kuò)增技術(shù)中遺留污染的改良方法用于預(yù)防核酸擴(kuò)增技術(shù)中遺留污染的改良方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及核酸擴(kuò)增的方法，更具體的，涉及核酸擴(kuò)增中遺留污染的控制。發(fā)明背景聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)能特異擴(kuò)增少至單拷貝的靶核酸序列。已證實(shí)PCR的高敏感性和特異性在需要檢測少量靶核酸的診斷學(xué)、法醫(yī)學(xué)和其他應(yīng)用中很有價(jià)值。不幸地，PCR測定的所述高靈敏度使其易受污染和假陽性結(jié)果的影響。在法醫(yī)學(xué)和疾病篩查(例如HIV檢測)中，假陽性結(jié)果可能帶來破壞性的后果。假陽性結(jié)果的最通常來源是"遺留污染"，其中先前測定中的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)污染后續(xù)的PCR測定。污染物可由技術(shù)人員、儀器甚至經(jīng)氣霧劑傳播。在一個"陰性"的樣本中(無靶核酸存在)，污染物造成了假陽性結(jié)果。在一個"陽性"的樣本中(存在靶核酸)，污染物與真實(shí)的靶標(biāo)共擴(kuò)增。該共擴(kuò)增會歪曲定量測定(其中必須確定真實(shí)耙標(biāo)的確切量)的結(jié)果。預(yù)防遺留擴(kuò)增的廣泛且有效的途徑包括使用尿嘧啶DNA糖基化酶，尤其是UNG(EC3.2.2.3)。這些酶類識別單鏈或雙鏈DNA中存在的尿嘧啶，并切割尿嘧啶石威基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵，留下脫堿基位點(diǎn)。例如參見美國專利號6,713,294。尿嘧啶-DNA糖基化酶，縮寫為"UDG"或"UNG"，包括線粒體UNG1、核UNG2、SMUG1(單鏈選擇性尿嘧啶-DNA糖基化酶)、TDG(TU錯配DNA糖基化酶)、MBD4(帶曱基結(jié)合區(qū)域的尿嘧啶-DNA糖基化酶)和其他原核和真核酶類(參見KrokanH.E.等"t/ra"7z>2D假—occw廳ewce,cowse《wewces，W，Oncogene(2002)21:8935-9232)。尿嘧啶-DNA糖基化酶是預(yù)防由于胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶導(dǎo)致的G至A的轉(zhuǎn)換突變等等的DNA修復(fù)酶類。如果胞嘧啶(C)脫氨基為尿嘧啶(U)并且DNA經(jīng)歷復(fù)制的話，A將摻入U(xiǎn)的對面(先前G位于C的對面)。如果尿嘧啶堿基在復(fù)制前被糖基化酶切除，脫堿基位點(diǎn)由小補(bǔ)綴或大補(bǔ)綴DNA修復(fù)途徑修復(fù)，包括核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶活性。除了DNA損傷修復(fù)外，DNA糖基化酶活性在體細(xì)胞突變中起作用，包括抗體親和力成熟過程中的免疫球蛋白類轉(zhuǎn)變和體細(xì)胞高度突變。參見BransteitterR.等，"F/rWJ/Z)flj^7m'(y^o妙e-譜"c/ze(iaw"70(^y，，，J.Bio.Chem.(2007)281:16833-16836。優(yōu)化用于控制擴(kuò)增反應(yīng)中遺留污染的尿嘧啶-N-DNA糖基化酶(UNG)的制備已公開于諸如美國專利號6,187,575中。UNG預(yù)防遺留污染的用途也已被描述，參見Longo等"t/wo/wrac〃DA^g(ycos^/flseZocow"o/ca^rj-ove;-cowfam/w""ow/"polymerasec/a/w"ac"o""(1990)Gene,93:125-128。使用UNG控制遺留污染方法的現(xiàn)有技術(shù)描述于美國專利號6,287,823和6,518,026以及美國公開號2003/0077637中。通常，該方法包括2步。首先，PCR測定必須包括dUTP，從而潛在的遺留污染物擴(kuò)增子含有尿嘧啶。該方法包括在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP部分或全部取代dTTP。可選^^地(或另外地)，可將一個或更多個尿嘧咬摻入擴(kuò)增引物中。然而應(yīng)當(dāng)注意的是，如果引物中的尿嘧啶離5，端太近，該方法預(yù)防隨后擴(kuò)增的效力將下降。使用dUTP并不干擾PCR測定。盡管用尿嘧啶代替了胸腺嘧啶，當(dāng)產(chǎn)生含尿嘧啶的擴(kuò)增子后，可通過標(biāo)準(zhǔn)方法對其檢測和分析。下一步，將尿嘧啶-N-DNA糖基化酶加入到隨后的PCR中，方便地，UNG在含有所有PCR成分的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中是活性的。這使得能夠向組合PCR反應(yīng)物或甚至PCR主混合物中加入U(xiǎn)NG。在熱循環(huán)開始前，反應(yīng)混合物在為PCR主混合物背景中的UNG活性優(yōu)化的溫度(約50。C)或UNG為活性的溫度范圍內(nèi)孵育。如果來自先前反應(yīng)的含尿嘧啶污染物存在，UNG將切除尿嘧啶，留下脫堿基位點(diǎn)。已知含脫堿基位點(diǎn)的DNA在高溫和高pH條件下不穩(wěn)定。當(dāng)熱循環(huán)開始時(shí)，這些DNA降解。高溫也失活了UNG酶，允許產(chǎn)生新的含尿嘧咬的DNA擴(kuò)增子。用UNG處理后，脫堿基DNA必須在脫石咸基位點(diǎn)有效切割如果不被切除，脫堿基DNA成為隨后擴(kuò)增中聚合酶的模板。例如，已知ragDNA聚合酶通過在缺失石咸基的對面摻入腺普繞過脫堿基位點(diǎn)。該聚合酶產(chǎn)生的單個旁路產(chǎn)生了用于隨后擴(kuò)增的完美模板(參見Sikorsky，J.A.等,"ZWJdamageret/wcesr"《po^ymenxsey<^/"_y扁//折ca"'owc/ewc,,Biochem.Biophys.Res.Commun.(2007)355:431-437或Kobayashi,A.等."7Vove/尸C7-medZa"(iww^2gewew、"顯/dowa/ra《房^/o/，er騰，，，J.Biotech.(2005)116:227-232)。因此，在脫堿基位點(diǎn)有效切割DNA的能力對于基于UNG的預(yù)防遺留污染方法的完全成功是必需的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及^f吏用DNA糖基化酶的改良的遺留污染控制的方法。發(fā)明人確定成功消除遺留污染的限制因素是有效降解脫堿基DNA。已接受的觀點(diǎn)是限制步驟是酶消化產(chǎn)生脫堿基DNA。而下一步脫堿基DNA的非酶降解被認(rèn)為是簡單、有效和不需要改進(jìn)的?，F(xiàn)有的改進(jìn)污染控制方法的努力集中于加入更多的糖基化酶以增加孵育時(shí)間。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有的觀點(diǎn)相反，酶步驟是非常有效的。同時(shí)，非酶降解步驟效率不夠，可能成為持續(xù)污染源。如果污染物在PCR的起始循環(huán)不被降解，其通過聚合酶被拷貝，不再被消除。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過提供降解或利于樣品中脫堿基DNA降解的試劑顯著地改善污染控制。最有效的這類試劑是那些與隨后擴(kuò)增相容的試劑。在一些例子中，所述樣品與聚胺接觸。在某些實(shí)施方案中，所述聚胺是亞精胺、精胺或嵌入劑胺。在高溫和高pH下，聚胺在不抑制PCR的情況下顯著地改善了脫石咸基DNA的降解。在其他實(shí)施方案中，所述樣品與酶接觸，催化脫堿基DNA骨架的切割。公開了使用這些和類似試劑的組合物和方法。附圖簡述圖1A和B顯示了在不存在或存在增加濃度的精胺的情況下，具有脫堿基位點(diǎn)的寡核苷酸的降解產(chǎn)物的HPLC色譜圖譜。圖IA顯示了50。C下的降解，圖1B顯示了50。C后進(jìn)行2分鐘的95。C加熱峰(heatspike)的降解。圖2A和B顯示了在不存在或存在精胺的情況下，不同數(shù)量DNA和RNA耙標(biāo)的擴(kuò)增結(jié)果。圖2A顯示了用或不用lOOitiM精胺時(shí)不同數(shù)量的HCVDNA輸入拷貝的擴(kuò)增。圖2B顯示了在50pM精胺存在下不同數(shù)量的HCVDNA輸入拷貝的擴(kuò)增。圖3顯示了單獨(dú)使用dUTP或dUTP和dTTP組合擴(kuò)增耙序列的結(jié)果。圖4顯示了用增加量的UNG預(yù)處理后的擴(kuò)增結(jié)果。圖5顯示了用或不用UNG預(yù)處理含有dU和dU/dT的序列擴(kuò)增的結(jié)果。圖6顯示了在精胺存在下，用UNG預(yù)處理后擴(kuò)增的結(jié)果。圖7顯示了在不同溫度下，用UNG預(yù)處理后擴(kuò)增的結(jié)果。定義為了便于理解本發(fā)明公開的內(nèi)容，下列定義可能是有幫助的。本文中，術(shù)語"聚胺"表示具有超過一個氨基的有機(jī)化合物或該種化合物的鹽。聚胺非限制性地包括二胺、三胺、四胺以及具體為亞精胺、并青胺、腐胺、胍和二亞乙基三胺。本文中，術(shù)語"擴(kuò)增子"表示DNA分子群，其由模板擴(kuò)增產(chǎn)生，例如通過PCR。本文中，術(shù)語"靶序列"表示特別感興趣的核酸序列，其可能存在于樣品中。本文中，術(shù)語"脫堿基DNA"或"具有脫堿基位點(diǎn)的DNA"指單鏈或雙鏈的DNA分子，其含有至少一個脫堿基核苷酸(有時(shí)稱為"脫堿基位點(diǎn)")。"脫堿基核苷酸"是在脫氧核糖的l，位缺乏堿基的核苷酸。本文中，術(shù)語"AP核酸內(nèi)切酶"或"AP裂解酶"表示能夠打破核酸的磷酸二酯骨架的酶。該術(shù)語包括能夠在脫石咸基位點(diǎn)5'端和3'端打破骨架的酶類。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及控制或減少核酸擴(kuò)增反應(yīng)遺留污染的改良方法，其使用具有DNA糖基化酶活性的酶。作為例子，本發(fā)明使用DNA糖基化酶或尿嘧啶-DNA糖基化酶。所述方法通常始于產(chǎn)生含有稀有堿基的擴(kuò)增子。作為例子，本發(fā)明使用尿嘧啶。這可以通過在dUTP存在下進(jìn)行核酸擴(kuò)增、向擴(kuò)增引物中摻入脫氧尿普或?qū)NA中的胞嘧啶脫氨基完成。第一步擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生含有尿嘧啶的擴(kuò)增子后，任何后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)均用具有尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶(例如UNG酶)預(yù)處理。如果存在來自先前擴(kuò)增的污染擴(kuò)增子，UNG將切割所述擴(kuò)增子中的尿嘧啶，產(chǎn)生脫堿基位點(diǎn)。雖然尿嘧。定和UNG最常用于控制污染，應(yīng)當(dāng)注意以同樣方式起作用的備選酶/底物系統(tǒng)也是可用的。本領(lǐng)域已知特異性DNA修復(fù)酶類識別并從DNA中切除不同的非天然堿基，剩下脫堿基位點(diǎn)。這種非天然堿基和特異性酶的組合可用于控制遺留污染，只要聚合酶能夠?qū)⒃摲翘烊粔A基摻入潛在污染擴(kuò)增子，或替代地，潛在污染擴(kuò)增子可被以某種方式處理以產(chǎn)生非天然堿基。這類酶/底物對的例子包括MutY或MutM和8-氧代鳥苷，hOGGl和8-氧代鳥苷，人MBD4和尿苷，大腸桿菌(五.co/Z)EndoVIII和胸腺嘧。定乙二醇或其他氧化的嘧咬類和大量的其他類似的對，例如在Hitomi等.(2007)DNARepair6:410-428中所描述的。依照傳統(tǒng)的方法，用UNG醉育后，下一步驟是使反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)包括起始的加熱或"變性步驟"。該起始加熱步驟被認(rèn)為足以使脫堿基DNA降解，因?yàn)橐阎搲A基DNA在高溫高pH條件下不穩(wěn)定。如果該方法不能消除污染(sterilization),從業(yè)者會懷疑使用UNG的酶步驟的失敗。通常認(rèn)為酶類對反應(yīng)條件敏感。從最適條件最微小的偏差就可使酶失去大量或全部活性。因此當(dāng)某一方法失敗時(shí)，酶通常是最先受到懷疑的。另一方面，認(rèn)為非酶化學(xué)反應(yīng)更為有效(robust)。例^口，Kleiboeker("Qwaw"Yadvec/"ec"'owo//Aeej^e"o/a，/zyca"'owreverse/rawscr^"ow尸C7"，VirologyJournal(2005)2:29))報(bào)道了消除多種模板的不良結(jié)果。為改善效率，Kleiboeker教導(dǎo)增加UNG的量、孵育的時(shí)間和升高孵育的溫度。然而，已知過量UNG的存在對于PCR是有害的。盡管UNG最后被熱滅活，其在熱循環(huán)中長時(shí)間保留了的基本活性。由于溫度周期性的接近于最佳的50°C(PCR退火步驟中)，UNG具有部分活性，開始消化新產(chǎn)生的含尿嘧啶8擴(kuò)增子。因此不能加入更多量的UNG。令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)UNG并非消除污染方法失敗的原因。與預(yù)期相反，消除污染方法中的限制因素不是酶步驟，而是隨后的鏈切割步驟。通過用HPLC分析UNG方法的中間產(chǎn)物，本發(fā)明人確定UNG將DNA中超過95。/。的尿嘧咬轉(zhuǎn)化為脫堿基位點(diǎn)。然而，所得的脫堿基DNA僅有6%在50°C下被切割，僅有約10%在95°C下被切割。因此發(fā)明人開發(fā)了UNG消除污染方法的有效改進(jìn)，包括添加利于脫堿基DNA降解的試劑。特別有效的改進(jìn)包括不干擾后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的此類試劑。在一個實(shí)施方案中，此類促脫石咸基DNA降解試劑是聚胺。一般而言，聚胺是線性的烴分子，包括至少兩個氨基，每端一個氨基。某些線性聚胺被非線性或環(huán)狀部分取代。除了末端的氨基外，某些聚胺還在鏈內(nèi)具有一個或更多個內(nèi)部氨基。在某些實(shí)施方案中，聚胺具有這樣的結(jié)構(gòu)其中相鄰的氨基被三個碳原子相互隔開。大量聚胺的比較分析揭示該結(jié)構(gòu)能最佳切割脫堿基位點(diǎn)，參見Steullet等."C/eavageo/*Z">s7'c/w/erca/^oraw/we-,"Bioorg,Medic.Chem.1999(7)，2531-2540。不論聚胺中原子的總數(shù)和氨基的總數(shù)，該法則均適用。有效的聚胺例子包括亞精胺，(NH2)(CH2)3(NH)(CH2)4(NH2);精胺，(NH2)(CH2)3(NH)(CH2)4(NH)(CH2)3(NH2);和三亞曱基二胺，(NH2)(CH2)3(NH2)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明向反應(yīng)中加入一種或更多種聚胺，至濃度為O，OlmM至1mM之間。在某些實(shí)施方案中所述聚胺是嵌入劑胺。該類聚胺具有嵌入部分，能嵌入核酸中的堿基對或堿基之間。聚胺上嵌入部分的例子包括芳烴和聚芳烴(例如萘和蒽醌)。在某些實(shí)施方案中，嵌入劑部分本身也可被一個或更多個聚胺側(cè)鏈所取代，嵌入劑胺通常在降解脫堿基核酸方面比線性胺類更有效。不受特定理論的限制，可認(rèn)為該效應(yīng)可能是源于嵌入作用，其使得聚胺分子的活性部分接近其靶脫堿基位占已知聚胺能改善多種包括核酸的酶反應(yīng)效率。例如，已發(fā)現(xiàn)一種或更多種聚胺(乙二胺、三亞曱基二胺、亞精胺和精胺)有時(shí)能夠改善使用不純樣品(例如血液和植物或動物組織)的PCR擴(kuò)增效率(參見日本申請公開JP11113573、JP2001008680、JP8009997和JP6277061的英文摘要)。一般而言，已發(fā)現(xiàn)多種聚胺在輔助酶反應(yīng)方面的能力非常相似。美國專利號6,413,747"五w/mwcemew/"wc/ez'cfl，/;yca"'owZ/ea^W"Zowo/a/o(yam/W公開了9種不同的聚胺的使用，每種均能增加PCR的效率。另一個研究組發(fā)現(xiàn)聚胺在增加效率的同時(shí)降低了使用從冰凍大麥種子中提取的DNA所進(jìn)行PCR的特異'l"生，參見AhokasH.和M.J.Erkkila"/"fer/erewce0/尸CAam;/zyca"o"Ae;o(yam^ze51,s/ermZwes/^rmWW，(1993)PCRMethodsAppl.,3:65-68。該研究組發(fā)現(xiàn)，將反應(yīng)中聚胺的濃度從0.6mM增加至0.8mM導(dǎo)致同一才莫板-引物組合出現(xiàn)了4種額外的PCR產(chǎn)物。不受特定理論的限制，根據(jù)已有的數(shù)據(jù)可認(rèn)為聚胺改進(jìn)了損傷DNA的擴(kuò)增?？赡芫郯吩鰪?qiáng)了聚合酶繞過DNA損傷位點(diǎn)(例如脫堿基位點(diǎn))的能力。根據(jù)該思路，可以預(yù)期PCR過程中聚胺以同種方式允許UNG消化的污染物在降解之前擴(kuò)增。這樣就可得出聚胺將抵抗基于UNG的預(yù)防遺留污染的方法，進(jìn)而不能與該方法結(jié)合使用的結(jié)論。相反，已發(fā)現(xiàn)聚胺實(shí)際上通過增強(qiáng)在脫堿基位點(diǎn)DNA的降解改進(jìn)了基于UNG的污染控制。根據(jù)本發(fā)明，包含促脫堿基DNA降解試劑(例如聚胺)的樣品溶液優(yōu)選在適于引起具有至少一個脫堿基位點(diǎn)的各自DNA降解的條件下孵育，更優(yōu)選在30°C至95°C的溫度范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，成功除去遺留污染物與所述要消除的擴(kuò)增子堿基組成有關(guān)。在dUTP存在下，待拷貝鏈的低脫氧腺苷成分導(dǎo)致了擴(kuò)增產(chǎn)物中低脫氧尿苷成分。因此UNG處理后，此類擴(kuò)增產(chǎn)物將具有最少的脫堿基位點(diǎn)，并經(jīng)歷最少的骨架斷裂。還應(yīng)當(dāng)理解的是，如果尿苷不對稱地分布于擴(kuò)增子的兩條鏈中，尿苷很少的鏈將在消除污染過程中幸存，并保證了整個污染擴(kuò)增子的幸存。在以下的實(shí)施例中，使用具有不同數(shù)目和比例胸苷的靶標(biāo)。如表1所示，靶鏈的dT(dU)含量范圍為15%至35%。選擇靶序列靶2用于下述的實(shí)施例。該靶序列在雙鏈形式中具有最低絕對數(shù)量的胸普(66)，在單鏈形式(正向鏈)中具有最低絕對和相對的胸苷含量?！?卿^#靶耙1輩巴2靶3耙4靶5內(nèi)部對照大小，bp154141157132241124總dTs79(25%)66(23%)79(25%)72(27%)95(20%)61(25%)正向鏈dTs32(21%)22(15%)47(30%)46(35%)51(21%)32(26%)反向鏈dTs47(31%)44(31%)32(20%)26(20%)44(18%)29(23%)雖然用尿嘧啶替換所有的胸苷保證了UNG對于擴(kuò)增子的最大活性，可能需要產(chǎn)生具有胸苷和尿嘧啶混合物的擴(kuò)增子。這是因?yàn)樵S多本領(lǐng)域已知的DNA聚合酶對dUTP作為底物具有更低的偏好性。如下述實(shí)施例中所示，在dUTP單獨(dú)存在下的擴(kuò)增效率通常要比在dUTP和dTTP均存在下低。應(yīng)當(dāng)理解，效率的差異根據(jù)不同的靶序列和反應(yīng)混合物中dTTP和dUTP的量而不同。因此對于某些靶序列，推薦向反應(yīng)混合物中加入不同量的dTTP。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)中dTTP:dUTP的摩爾比是l:10。在某些實(shí)施方案中，dUTP的濃度高于dATP、dCTP和dGTP。在一個實(shí)施例中，擴(kuò)增反應(yīng)中核苷酸的濃度可為各0.3mM的dATP、dCTP和dGTP，0.5mMdUTP和0.05mMdTTP。在其他實(shí)施例中，有助于脫i咸基DNA降解的試劑為酶類，例如核酸內(nèi)切酶IV、核酸外切酶in或AP裂解酶。試*盒本發(fā)明還提供了用于應(yīng)用本發(fā)明方法的試劑盒。該試劑盒包括本文中所述一種或更多種試劑，具有DNA糖基化酶活性的試劑和能夠降解脫堿基DNA的試劑。任選地，所述試劑盒可包括紙質(zhì)或電子的使用說明。在某些實(shí)施例中，所述試劑盒可包括適于輔助脫石咸基DNA非酶降解的聚胺。在其他實(shí)施例中，所述試劑盒可包括能降解脫堿基DNA的酶。試劑盒中的其他試劑可包括用于擴(kuò)增核酸的試劑。這些試劑非限制性地包括一種或更多種寡核苷酸引物、核酸聚合酶、緩沖劑、鹽類和三磷酸核香以及具有DNA糖基化酶活性(例如尿嘧啶-N-糖基化酶活性)的酶。三磷酸核苷包括dATP、dCTP、dGTP，以及dUTP和dTTP中的一種或更多種?？杉尤肓硪贿m當(dāng)?shù)姆浅Ｒ?guī)三磷酸核苷代替dUTP。如果使用另一非常規(guī)三磷酸核苷，常規(guī)三磷酸核苷的組成將因此改變。試劑盒中的其他試劑可以是用于檢測擴(kuò)增的核酸的試劑。這些試劑非限制性地包括一種或更多種標(biāo)記的探針，例如放射性或熒光標(biāo)記探針、TaqManTM探針和其他實(shí)時(shí)PCR探針。本發(fā)明還提供了反應(yīng)混合物。典型的反應(yīng)混合物包括用于擴(kuò)增核酸的成分，以及一種或更多種利于產(chǎn)生和降解脫石咸基DNA的試劑。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物將包含用于檢測核酸的試劑。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物將包含用于預(yù)防另外的遺留污染的試劑。示范性的反應(yīng)混合物包含一種或更多種寡核苷酸引物、核酸聚合酶、緩沖劑、鹽類、三磷酸核苷和具有DNA糖基化酶活性(例如尿嘧。定-N-糖基化酶活性)的酶。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物還包括聚胺。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物還包括能切割脫堿基DNA的酶。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物還包含一種或更多種標(biāo)記探針。應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明的范圍包括任何易受遺留污染影響的擴(kuò)增方法。這些擴(kuò)增方法非限制性地包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)PCR、終點(diǎn)PCR、不對稱PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)?！蹲瘫嬉韵聦?shí)施例說明了本發(fā)明的方法《滋辨J撈麼;^^才應(yīng)喊差農(nóng)^在溶液中孵育含脫氧尿嘧啶的DNA寡核苷酸SEQIDNO:1:5，畫TTTGCATGGCTGCUTGATGTCCCCCCACT-3'所述溶液通過混合10pL整分部分的100|LiM溶液與10pL才莫擬RT-PCR主混合物溶液制備。該模擬主混合物溶液含有50-mM兩性離子緩沖劑(tricine)(pH8.3)，90mM乙酸鉀，dATP、dCTP和dGTP各200iliM，400iliMdUTP，4mM乙酸錳，5%DMSO和5%甘油。此外，所述反應(yīng)混合物含有2.5|LiL水或適當(dāng)濃度的精胺溶液，以及2iliL的4單位/)tiL的UNG。在50°C孵育30分鐘，有或者沒有另外的在95。C下2分鐘的加熱峰(heatspike)步驟。使用電噴霧電離源的Agilent1100MSD檢測系統(tǒng)通過HPLC-MS分析反應(yīng)。質(zhì)鐠(MS)數(shù)據(jù)(未顯示)清楚地表明在所有的條件下尿嘧啶被完全去除(至檢測方法的極限)。HPLC結(jié)果如圖1A和1B所示。圖1A顯示在100pM、1mM和10mM精胺存在下，在50。C的降解。在100pM時(shí)，仍可檢測到全長的寡核苷酸。圖1B顯示了在95。C下暴露2分鐘后，同樣在100iiM、lmM和10mM精胺存在下的降解。在95°C，甚至在100(iM也^r測不到全長的寡核苷酸。結(jié)果表明，隨著精胺量的增加，全長寡核苷酸更為有效地降解成片段。在較高溫度下，所述效果在更低的精胺濃度下即可獲得。然而，結(jié)果顯示單獨(dú)的較高溫度對于引起脫堿基DNA降解是不夠的?！?2對于DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增241-bp的DNA模板(靶5,用于雙鏈DNA的20%dT)。反應(yīng)混合物含有40個單位的Z05DNA聚合酶，50mM兩性離子緩沖劑(pH8.3),90mM乙酸鉀，dATP、dCTP和dGTP各200(iM，400nMdUTP，上游和下游引物各O.l4mM乙酸錳，5。/oDMSO和5o/o甘油，2pMSYTO-16嵌入染料以及任選的100精胺。擴(kuò)增在RocheLightCycler480儀中進(jìn)行，采用以下溫度分布50。C5分(UNG步驟)，兩個循環(huán)的94°C15秒(變性)和59°C40秒(退火和延伸)，48個循環(huán)的91°C(變性)和59°C40秒(退火和延伸)。在最后48個循環(huán)的退火/延伸步驟中采用分別用于激發(fā)和發(fā)射的483nm/533nm濾波器組合收集熒光數(shù)據(jù)。結(jié)果示于圖2A和表2A。實(shí)線簇表示不含精胺的擴(kuò)增反應(yīng)，一式三份。虛線簇表示在精胺存在下的擴(kuò)增反應(yīng)，一式三份。這些結(jié)果顯示擴(kuò)增未被精胺顯著抑制。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>對于RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增0-106個拷貝的靶5的RNA等價(jià)物。反應(yīng)混合物和溫度分布與DNA沖莫板相同，除了加入逆轉(zhuǎn)錄酶以及在起始的UNG步驟后，反應(yīng)物在66。C下孵育30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄)。結(jié)果示于圖2B和表2B。像圖2A—樣，實(shí)線簇表示不含精胺的擴(kuò)增反應(yīng)，一式三份。虛線簇表示在精胺存在下的擴(kuò)增反應(yīng)，一式三份。這些結(jié)果顯示RT-PCR未被精胺顯著抑制。不存在4'存在7卯兆7>f70、M44'M6#^W<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>^滋辨3農(nóng)存4df/r尸4'存4</t/77>^rfrrp邀合'，兆7"^^,^放,。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以擴(kuò)增100,000拷貝的141-ntRNA模板(表l中的耙2)。該靶的dU含量很低。相應(yīng)的雙鏈DNA具有23%dT(表1)。當(dāng)擴(kuò)增在dTTP和dUTP存在下進(jìn)行時(shí)，DNA擴(kuò)增子的dU含量會更低。反應(yīng)混合物包括0.5M甜菜;威，pH6.3;68mM乙酸鉀，pH7.0;2.8%甘油；3mM乙酸錳，pH6.1;0.07%疊氮化鈉；5%DMSO;50mM兩性離子緩沖劑，pH8.3;dATP、dCTP和dGTP各0.3mM;0.5mMdUTP;以及明示時(shí)0.05mMdTTP;40單位的Z05DNA聚合酶；0.2]aM適配體，正向和反向引物各0.2|aM以及O.l(iM探針。溫度分布為94。C30秒，58°C30分(逆轉(zhuǎn)錄)，5個循環(huán)的95°C15秒和59。C21秒，另外52個循環(huán)的91°C15秒和52°C33秒，隨后72。C5分鐘，最后40。C2分鐘。結(jié)果示于圖3和表3。在該試驗(yàn)中，在dUTP存在下的擴(kuò)增大約與在dUTP和dTTP存在下的擴(kuò)增效率相同。^3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*5個試驗(yàn)的平均值《滋辨4脊>d7T^7)孩,^參#在本例中，如實(shí)施例3中所述的使用含0.5mMdUTP和0.05mMTTP的核苷酸混合物產(chǎn)生的靶2擴(kuò)增子作為擴(kuò)增的靶(23%總dU+T)。擴(kuò)增子采用QIAQUICKPCR純化試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)純化，并通過分光光度法定量。擴(kuò)增采用摻入健康供體人血漿的1000或10,000拷貝的擴(kuò)增子進(jìn)行，用COBASAmpliPrep儀(RocheMolecularSystems,Pleasanton,CA)處理。反應(yīng)在增加量的UNG存在或不存在情況下進(jìn)行。RT-PCR擴(kuò)增采用實(shí)施例3中所述的引物和靶序列、試劑和溫度分布進(jìn)行，除了加入標(biāo)定量的UNG。擴(kuò)增和檢測在COBASTaqMan儀中進(jìn)行，采用以下溫度分布50。C2分鐘(UNG步驟)，94°C30秒，58°C30分鐘(RT步驟)，5個循環(huán)的95。C15秒(變性)和59°C21秒(退火和延伸)，55個循環(huán)的91°C15秒(變性)和52。C33秒(退火和延伸)。結(jié)果示于圖4和表4。如圖4和表4中的數(shù)據(jù)顯示，dU很少的擴(kuò)增子在甚至60單位/100的UNG(6倍推薦量)處理中幸存下來。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*每個值均為2次單獨(dú)試驗(yàn)的平均值《滋辨5,,g艦理者含才rft//wy^T在本例中，UNG預(yù)處理和實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增按照實(shí)施例4中所述進(jìn)行。結(jié)果示于圖5和表5。這些結(jié)果表明同時(shí)具有dT和dU的擴(kuò)增子更為持久，即，比僅含dU的擴(kuò)增子更難于消除。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*每個值均為2次單獨(dú)試驗(yàn)的平均值**表示單獨(dú)的值，兩次試驗(yàn)中的另一個具有ND結(jié)果***ND—未4全測到,滋辨6^匿g艦理者^^廢顛t^增在本例中，如實(shí)施例4中所述在用UNG預(yù)處理后擴(kuò)增含有dT和16dU的靶，除了擴(kuò)增反應(yīng)混合物還含有100pM精胺。結(jié)果示于圖6和表6。與表5相比，數(shù)據(jù)顯示在控制污染方面1000倍或更多的改善?！?<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>***ND-未4企測到根據(jù)特定的實(shí)施例，本發(fā)明已被詳細(xì)的描述，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可進(jìn)行多種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此本發(fā)明的范圍不應(yīng)當(dāng)受此處描述的任何實(shí)施例的限制，而由下列權(quán)利要求確定。SEQIDNO1:人工序列5，隱TTTGCATGGCTGCUTGATGTCCCCCCACT國3，序列表〈110〉F.Hoffmann-LaRocheAG〈120〉用于預(yù)防核酸擴(kuò)增技術(shù)中遺留污染的改良方法<130〉24623-KOE〈160〉1<170〉Patentlnversion3.5<210〉1<211>29<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉含脫氧尿噴啶的DNA寡核苷酸<400>1tttgcatggctgcutgatgtccccccact權(quán)利要求1.減少核酸溶液遺留污染的方法，包括步驟a.提供樣品溶液；b.在適于產(chǎn)生具有至少一個脫堿基位點(diǎn)的DNA的條件下孵育所述溶液；c.提供至少一種促脫堿基DNA降解的試劑；d.在適于使所述具有至少一個脫堿基位點(diǎn)的DNA降解的條件下孵育所述樣品溶液。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述適于產(chǎn)生具有至少一個脫堿基位點(diǎn)的DNA的條件包括存在具有DNA糖基化酶活性的酶。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述DNA糖基化酶活性是尿嘧啶-N-DNA糖基化酶活性。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述促脫石威基DNA降解的試劑是聚胺或酶。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述聚胺是嵌入劑聚胺。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述聚胺選自亞精胺、精胺、三亞乙基四胺和三亞曱基二胺。7.權(quán)利要求l的方法，還包括核酸擴(kuò)增的步驟。8.預(yù)防核酸溶液遺留污染的反應(yīng)混合物，包含適于產(chǎn)生具有至少一個脫堿基位點(diǎn)的DNA的試劑，以及促脫堿基DNA降解的試劑。9.權(quán)利要求8的反應(yīng)混合物，其中所述適于產(chǎn)生具有至少一個脫堿基位點(diǎn)的DNA的試劑具有尿嘧啶-N-DNA糖基化酶活性。10.權(quán)利要求8的反應(yīng)混合物，其中所述適于產(chǎn)生具有至少一個脫石咸基位點(diǎn)的DNA的試劑是酶。11.權(quán)利要求10的反應(yīng)混合物，還包括用于擴(kuò)增核酸的試劑，其中所述試劑包括dTTP和dUTP中的一種或更多種。12.權(quán)利要求8的反應(yīng)混合物，其中所述促脫堿基DNA降解的試劑是聚胺。13.用于實(shí)施預(yù)防核酸溶液遺留污染的方法的試劑盒，包括a)具有DNA糖基化酶活性的試劑；b)能降解脫石威基DNA的試劑。14.權(quán)利要求13的試劑盒，還包括用于擴(kuò)增核酸的試劑。15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述用于擴(kuò)增核酸的試劑包括dTTP和dUTP中的一種或更多種。專利摘要改良的預(yù)防擴(kuò)增反應(yīng)中遺留污染的方法，包括用尿嘧啶-N-DNA糖基化酶處理含尿嘧啶DNA，在聚胺(例如亞精胺、精胺等)存在下加熱DNA?？蛇x擇地，用尿嘧啶-N-DNA糖基化酶處理后，反應(yīng)物進(jìn)一步與具有AP裂解酶活性的酶孵育。文檔編號C12P19/34GKCN101613730SQ200910146289公開日2009年12月30日申請日期2009年6月26日發(fā)明者A·古普塔,J·蒙蒂爾,R·博亨茲基,S·G·威爾申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan