專利名稱:利用屎腸球菌分步發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物生產(chǎn)，氨基丁酸的方法，特別是利用屎腸球菌(五M&raCOCC"S
/^c/"w)深層發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
y-氨基丁酸(y-Aminobutyric acid, GABA)，又叫氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天 然氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理功能，如 降低血壓、利尿、鎮(zhèn)痛安神、改善腦機(jī)能、增進(jìn)腦活力、促進(jìn)長(zhǎng)期記憶、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、改 善更年期綜合癥等。當(dāng)大腦長(zhǎng)期缺乏GABA將會(huì)導(dǎo)致癲癇、帕金森等疾病。同時(shí)GABA還 與腦衰老有關(guān)，其缺乏將導(dǎo)致老年人"耳不聰、目不明"。另外，GABA能促進(jìn)精子的穿卵 能力，提高受精率，用于掩飾或降低具有不愉快味道的物質(zhì)的不愉快風(fēng)味印象的用途以及可 以提高飼料利用率和日增重。Y-氨基丁酸正被廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥、食品保健、化工及農(nóng)業(yè)等 行業(yè)。GABA的生產(chǎn)主要可以通過化學(xué)合成和生物合成兩條途徑?；瘜W(xué)合成反應(yīng)條件劇烈， 采用的化學(xué)溶劑具有毒性和腐蝕性，副產(chǎn)物多，缺乏安全性，主要應(yīng)用于化工行業(yè)；生物合 成法較化學(xué)合成法具有條件溫和、環(huán)境污染相對(duì)較低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。另外，由于微生物 具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)條件較簡(jiǎn)單、代謝過程特殊和分布廣等特點(diǎn)，因此利用微生物生產(chǎn) GABA，不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。
目前已經(jīng)有一些利用不同種屬的微生物生產(chǎn)GABA的報(bào)道。
陸兆新、楊勝遠(yuǎn)等在中國(guó)專利(專利號(hào)ZL 200510040758. 9)中公開了一種Y-氨基丁酸的 生產(chǎn)方法，它是以唾液鏈球菌嗜熱亞種(5Yr印tococciAS "e/wo/ /u'7us)為菌種，作用于谷 氨酸、谷氨酸鹽、含谷氨酸或谷氨酸鹽的物質(zhì)，使谷氨酸的Q-羧基發(fā)生脫羧作用，從而生
成y-氨基丁酸。
吳天祥等在中國(guó)專利(公開號(hào)CN101240301)中公開了固態(tài)發(fā)酵制備Y-氨基丁酸的方法， 包括如下步驟首先以腐乳為原料篩選出紅曲霉菌種；接著將紅曲霉MP1104菌種置于斜面 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，使菌種活化；然后發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，在溫度30'C、轉(zhuǎn)速150r/min 下將活化菌種搖床培養(yǎng)2d，制備發(fā)酵種子，優(yōu)選固態(tài)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基；最后將菌種在上一 步驟中優(yōu)選的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)生產(chǎn)GABA。該方法以大米為發(fā)酵原料，以紅曲霉 為菌種，具有食用安全性，可以作為保健食品直接食用；該方法的GABA產(chǎn)量和純度均高， 在最佳發(fā)酵條件與培養(yǎng)基下，GABA產(chǎn)量由初始的0.21mg/g可達(dá)到0.35mg/g，最終產(chǎn)品的純 度可以達(dá)到45%。
焦慶才等在中國(guó)專利(專利號(hào)ZL 200410064813. 3)中公開一種Y -氨基丁酸的酶法轉(zhuǎn)化制 備方法，該制備方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸兩種混合酸性氨基酸作為原料，將具有高活力L-谷氨酸脫羧酶的埃希氏菌^&c力eWc力ia AS 1. 505的菌體細(xì)胞與含有L-谷氮酸和
L-天冬氨酸混合物的轉(zhuǎn)化液混合，28-45'C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，然后用等電點(diǎn)結(jié)晶法或等電點(diǎn)結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的Y-氨基丁酸和L-天冬氨酸。該方法解決了兩種酸性混合氨基酸高效分離的難題，得到了附加值較高的Y-氨基丁酸，并具有原料價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
梅樂和等在中國(guó)專利(專利號(hào)ZL 200510049187. 5)中公開了一種生物合成Y-氨基丁酸的方法，其特征在于保藏編號(hào)為CGMCC NO. 1306的短乳桿菌(ZactoZ7acj77"s 6reWs),經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基或MRS種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 30小時(shí)后，以0. 5% 5%的接種量接種于GYP或MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25t; 35。C下靜置培養(yǎng)48h 120h,即得含菌體的發(fā)酵液，菌體離心分離收集；離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.25 2g濕菌體，懸浮于15 50mL的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為5raM 60mM，反應(yīng)1 10小時(shí)，反應(yīng)液離心即得含y -氨基丁酸的溶液。梅樂和等在中國(guó)專利(專利號(hào)ZL 200510049187.5)中還公開了一種控制pH發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法。其特征在于保藏編號(hào)為CGMCC NO. 1306的短乳桿菌Uacto力acil/"s Z re^5"),經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 35小時(shí)后，以5~10%的接種量接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液量為1 3L,攪拌轉(zhuǎn)速為50 150r/min，在3(TC下靜置培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行pH控制發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)約25 40小時(shí)，待菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，pH值回升后，連續(xù)流加l 3mol/L的鹽酸，發(fā)酵培養(yǎng)基pH控制在5. 0 5. 6，繼續(xù)培養(yǎng)約40 60h，即得含Y-氨基丁酸的發(fā)酵液。
郭曉風(fēng)等在中國(guó)專利(專利公開號(hào)CN101102683)中公開了一種涉及含有Y-氨基丁酸的食品的生產(chǎn)方法，其包括使酵母或其處理物作用于糖和/或糖代謝中間體，或者是作用于糖或糖代謝中間體和谷氨酸或其鹽，其中，上述酵母具有在糖或糖代謝中間體存在下通過發(fā)酵反應(yīng)生產(chǎn)Y-氨基丁酸的能力。
蔣冬花等在中國(guó)專利(專利公開號(hào)CN101302480)中公開了一種高產(chǎn)y -氨基丁酸紅色紅曲霉Mr-5菌株及其篩選方法和用途。該發(fā)明的高產(chǎn)GABA紅色紅曲霉(船/7asc^/Y/力eT"Mr-5)菌株，其保藏編號(hào)為CCTCC NO: M208043,保藏地為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。另外還公開了上述的紅色紅曲霉Mr-5菌株的篩選方法以及用途和用于Y-氨基丁酸的合成的方法，采用生物法合成Y-氨基丁酸的方法所得的發(fā)酵液中含6 9g/L的Y-氨基丁酸。
崔曉俊等在中國(guó)專利(專利公開號(hào)CN101311273)中公開了一種生物合成的Y-氨基丁酸制劑的方法，該產(chǎn)品按重量百分比含有5%至60%的Y-氨基丁酸。上述的生物合成的Y-氨基丁酸制劑的制備方法按以下步驟進(jìn)行首先將乳酸鏈球菌種接種到250mL由葡萄糖、玉米漿粉、脫脂豆粕粉、味精組成的發(fā)酵種子培養(yǎng)基，形成發(fā)酵液，將發(fā)酵液引入高速離心機(jī)中離心形成清液，將清液在40'C下，加入250mg/L殼聚糖，攪拌絮凝，將經(jīng)絮凝的待濾發(fā)酵液通過板框過濾機(jī)，得到濾清液，濾清液經(jīng)陽離子樹脂交換床進(jìn)行離子交換，待離子交換樹脂飽和后，去離子水洗脫，將谷氨酸全部洗脫，然后用氨水洗脫提取Y-氨基丁酸。
曹郁生等在中國(guó)專利(專利公開號(hào)CN101333508)中公開了一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的短乳
4桿菌，其特征和工藝方法步驟為經(jīng)鑒定為""oA3cj7Aas 6rew^(短乳桿菌)，國(guó)家菌種 保藏號(hào)Zacto力acj77"s &rew/sCCTCCM 208054。將保藏于MRS瓊脂斜面的短乳桿菌，轉(zhuǎn)接 于MRS液體培養(yǎng)基，經(jīng)活化后，以2-5呢的接種量接種于MRSG液體培養(yǎng)基，于25_30°C培養(yǎng) 60-90h,發(fā)酵液中的y-氨基丁酸達(dá)到50-145mM。曹郁生等還在中國(guó)專利(專利公開號(hào) CN101333548)中公開了一種利用短乳桿菌制備y-氨基丁酸的方法，其工藝方法步驟為 l.利用MRS液體培養(yǎng)基將短乳桿菌活化后，以5呢的接種量接種于MRSG發(fā)酵培養(yǎng)基，34'C培 養(yǎng)40-60h， 4t:離心收集菌體；2.利用無菌生理鹽水洗滌2次后懸于含10-100mM谷氨酸鈉、 pH 5.2的醋酸緩沖液中，34'C反應(yīng)l 8h，離心后即為含y-氨基丁酸的溶液。
趙景聯(lián)等在文摘(生物工程學(xué)報(bào)，1989,5(2): 124-128)中報(bào)道了用海藻酸鈣包埋法將 大腸桿菌細(xì)胞制成固定化細(xì)胞，與1%谷氨酸溶液進(jìn)行間歇反應(yīng)、連續(xù)攪拌式反應(yīng)及連續(xù)柱式 反應(yīng)生產(chǎn)GABA。間歇反應(yīng)5h轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 100%;連續(xù)攪拌式反應(yīng)在三角瓶反應(yīng)器中進(jìn)行， 以6ml/h的流速輸入底物溶液和輸出反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率達(dá)85%;連續(xù)柱式反應(yīng)器中進(jìn)行，控制 流速12ml/h，轉(zhuǎn)化率達(dá)95%。
章汝平等在文摘(長(zhǎng)沙電力學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998， 13(4): 433-435)中報(bào)道了 用海藻酸鈣包埋法將大腸桿菌細(xì)胞制成固定化細(xì)胞，對(duì)后道味精母液提取谷氨酸后的廢液進(jìn) 行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA，獲得了 GABA含量達(dá)到了 98.94%,收率為49. 65%。
Kono I等在文摘(&'osc/. 5j'otec/ / o7,&'oci e瓜，2000， 64(3) :617-619)中介紹了對(duì) Koji制作中GABA的變化，GABA含量達(dá)到了 120u g/g 。
Wang JJ等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol, 2003,30: 669-676)中報(bào)道了利用 Mwascws pw7^reus NTU 601進(jìn)行固體發(fā)酵，GABA含量達(dá)到了 5004mg/kg。
Su YC等在文摘(//"d Wcro6io/ 5/"ec力"W, 2003,30(1): 41-46)中報(bào)道了采用 jDU/7wreus CCRC31615進(jìn)行固體發(fā)酵，GABA含量達(dá)到了 1200mg/kg。
Nomura M等在文摘(/"ai/y 5b丄，1998， 81:1486-1491)中介紹了從生產(chǎn)奶酪的菌株中 分離到一株"ctococci/s 7ac"s01-7，用于奶酪生產(chǎn)，奶酪的GABA的含量達(dá)到了 383mg/kg。
許建軍在其博士學(xué)位論文(江南大學(xué)，2004年2月)中報(bào)道了從乳酸菌中篩選到了高產(chǎn) GABA的Za"ococcus 7ac"s菌株，25L罐發(fā)酵72h，發(fā)酵液的GABA達(dá)到了 250mg/100nil 。
劉清等在文摘(氨基酸和生物資源，2004， 26(1): 40-43)中也對(duì)高產(chǎn)GABA乳酸菌篩選 和發(fā)酵條件進(jìn)行了報(bào)道，發(fā)酵液中的GABA達(dá)到3. lg/1。
Yokoyama S等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(1): 95-97)中報(bào)道了利用AactoAaci〃"s 6rew's IF0-12005對(duì)酒糟進(jìn)行發(fā)酵，GABA的含量達(dá) 到了 10.18mM，通過離心、絮凝、脫色和脫臭處理獲得了較好的GABA溶液，可用于食品強(qiáng) 化GABA。
愛宕世高等在文摘(食品i科學(xué)，2001，No.8, 81-85)中報(bào)道了采用Zactotew7/〃s W朋^/7/7z 利用含有米糠抽提液的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)GABA，在干粉含量達(dá)到了 5%。
Komatsuzaki N等在文摘(尸oc^始'cro6/oA 《y, 2005,22:497-504)中報(bào)道了從日本傳 統(tǒng)發(fā)酵食品中分離到了 Zacto&3c/77ys/^racsse/用于GABA生產(chǎn)，GABA濃度達(dá)到了 302mM。Takahashi T等在文摘 (J"。wv7aJ o/" 5/osci朋ce朋<^ ^z.oe/ ^7'/ eerj7 g， 2004,97(6): 412-418)中報(bào)道篩選到了 Sacc力aro/nyces carew'siae UT-1的GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫 氫酶缺陷突變型菌株GAB7-1和GAB7-2，其發(fā)酵液,中GABA濃度分別達(dá)到了 0. 4mM和0. 42mM， 較野生株分別提高了 2. 0和2. 1倍。
Ijsseldijk等在美國(guó)專利(United States Patent, US5472718A)中公開了利用含有保 加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的酸奶加入到牛奶中，生產(chǎn)奶酪，所獲得的奶酪具有較大的多孔 性結(jié)構(gòu)，質(zhì)地大大改善，并在其中檢測(cè)到了微量GABA。
有關(guān)屎腸球菌CE""^/wo"fw/fle""m)的報(bào)道方面，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0114138公開了 一種經(jīng)分離篩選的屎腸球菌(CCTCCNO:M99016)及其應(yīng)用。經(jīng)培養(yǎng)基選擇、糞便(豬) 樣品采集、接種及培養(yǎng)篩選，其特征是分別經(jīng)膽汁耐受性、耐酸性、安全性篩選、檢測(cè)獲 得能應(yīng)用于制造畜禽胃腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的特殊屎腸球菌純培養(yǎng)物。并在此基礎(chǔ)上，制成仔 豬生態(tài)調(diào)節(jié)膏劑、畜禽伺料添加劑等。但目前尚未見有利用屎腸球菌分步發(fā)酵生產(chǎn)y-氨基 丁酸的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供利用屎腸球菌為菌種，分步控制發(fā)酵條件以解決細(xì)胞繁殖與發(fā)酵 產(chǎn)物累積的發(fā)酵條件不一致的矛盾，深層發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，可以生產(chǎn)高含量的Y-氨基丁酸，大大降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝，屬于生物工程領(lǐng)域。
本發(fā)明人經(jīng)過對(duì)大量微生物菌株進(jìn)行篩選，自行從傳統(tǒng)泡菜中分離篩選到了具有很高谷 氨酸脫羧酶活性的菌株，經(jīng)過鑒定該菌株為屎腸球菌(E"fcwcoccw/aec/"w)。再?gòu)奈⑸锞?種保藏中心經(jīng)過購(gòu)買屎腸球菌(E"&racocc附/flec/"m)進(jìn)行試驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)購(gòu)買的屎腸球菌 (E"feracocc"s/flec/t/m)都具有較高的谷氨酸脫羧酶活性。通過進(jìn)一步研究確定了通過生物工 程技術(shù)，以屎腸球菌為菌種，采取細(xì)胞培養(yǎng)與發(fā)酵累積產(chǎn)物進(jìn)行分歩控制的發(fā)酵技術(shù)，獲得 了高GABA含量(10-20g/L)的發(fā)酵醪。
本發(fā)明的獲得的Y-氨基丁酸的分子量為103.1，結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 6</formula>
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的通過以屎腸球菌(五"/eracocc附/耽c/"m)為菌種，通過逐級(jí)活化和 放大，接入發(fā)酵罐進(jìn)行分步控制發(fā)酵條件，使高谷氨酸脫羧酶活力細(xì)胞獲得最大限度的增殖， 然后在適宜發(fā)酵條件下作用于外源谷氨酸或谷氨酸鈉，深層發(fā)酵生產(chǎn)高含量Y-氨基丁酸。
Y-氨基丁酸的生產(chǎn)方法有如下形式
1、 菌種屎腸球菌(fiVltoW。CC"s/m /"附》
2、 培養(yǎng)基
MRS培養(yǎng)基蛋白胨10g/L,牛肉膏10 g/L，酵母浸膏5 g/L， lUiPO, 2 g/L，檸檬酸二 銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖20 g/L， MgS(X 7H20 0. 58 g/L, MnS(X H20 0.19 g/L,吐 溫80 lml,調(diào)節(jié)pH7. 0, 12rC滅菌15min。MRS固體培養(yǎng)基蛋白胨10g/L,牛肉膏10 g/L，酵母浸膏5 g/L， K2HP04 2 g/L，擰檬 酸二銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖20 g/L， MgSC^ 7H20 0. 58 g/L， MnS(X H20 0. 19 g/L， 吐溫80 lml，調(diào)節(jié)pH7. 0，瓊脂IO g/L。 121。C滅菌15min。
TYG培養(yǎng)基胰蛋白胨5g/L，酵母浸膏5g/L，葡萄糖10 g/L，乙酸鈉5 g/L,調(diào)節(jié)pH7. 0， 12rC滅菌15min。
改良PD培養(yǎng)基馬鈴薯200 g于1L水中煮沸30min，紗布過濾去渣。在清液中加入葡 萄糖20 g/L，檸檬酸二銨2 g/L,乙酸鈉5 g/L，調(diào)節(jié)pH7.0， 121。C滅菌15min。
3、發(fā)酵方法以屎腸球菌為生產(chǎn)菌種，先進(jìn)行活化，后接入種子培養(yǎng)基，于30 37'C, 100 180rpm攪拌培養(yǎng)12 24h，將種子液按4一10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 37'C， 100 180rpm攪拌下通過控制pH6. 0 7. 0培養(yǎng)24~36h,再解除pH控制繼續(xù)發(fā)酵12 18h， 然后按15 40g/L的終濃度的比率加入谷氨酸或谷氨酸鈉，通過控制pH值在3.0 5. 0于 35 45。C繼續(xù)發(fā)酵24 96h，從而獲得？氨基丁酸發(fā)酵醪。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、 本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)是通過分步控制發(fā)酵條件，通過外加谷氨酸或谷氨酸鈉底物，發(fā) 酵生產(chǎn)GABA。該發(fā)明解決了屎腸球菌的細(xì)胞繁殖與發(fā)酵產(chǎn)物累積的發(fā)酵條件不一致的矛 盾。發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，操作方便，GABA產(chǎn)量高。
2、 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)屎腸球菌具有很高的谷氨酸脫羧酶活性，利用其作為菌種，分步控制 發(fā)酵條件，可以通過深層發(fā)酵生產(chǎn)高含量的？氨基丁酸發(fā)酵醪(最高濃度可達(dá)20g/L)，可 以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，可提高設(shè)備的利用率。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
將屎腸球菌保藏菌種采用MRS斜面進(jìn)行活化，接入MRS或TYG或改良PD種子培養(yǎng) 基，于30 37"C， 100 180rpm攪拌培養(yǎng)12 24h,然后按4—10%接入MRS或TYG或改 良PD發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 37°C ， 100 180rpm攪拌下通過流加lmol/L NaOH控制pH6.0 7.0培養(yǎng)24h，然后解除pH控制，繼續(xù)發(fā)酵12 18h，按15 40g/L的終濃度的比率加入谷 氨酸或谷氨酸鈉，于35 45'C， pH3.0~5. 0繼續(xù)發(fā)酵24 96h，從而獲得y-氨基丁酸含量 為10 20g/L的發(fā)酵醪。
實(shí)施例2:
以屎腸球菌為生產(chǎn)菌種，先采用MRS斜面進(jìn)行活化，再以三角瓶MRS液體培養(yǎng)基于 30 37°C, lOOrpm搖床培養(yǎng)12h進(jìn)行活化，然后按4 —10%的接種量接入MRS或TYG或 改良PD種子培養(yǎng)基，于30 37°C， 100 180rpm攪拌培養(yǎng)12 24h，然后按4—10%接入 MRS或TYG或改良PD發(fā)酵培養(yǎng)基，于30~37°C ， 100 180rpm攪拌下通過流加lmol/L NaOH 控制pH6.0 7.0培養(yǎng)24h，然后解除pH控制，繼續(xù)發(fā)酵12 18h,按15 40g/L的終濃度 的比率加入谷氨酸或谷氨酸鈉，通過流加NaOH和HC1控制pH值在3.0~5. 0于35 45'C繼 續(xù)發(fā)酵24 96h，從而獲得Y-氨基丁酸含量為10 20g/L的發(fā)酵醪。經(jīng)過滅菌排放，即可進(jìn) 行GABA提取和精制。實(shí)施例3:
以屎腸球菌為生產(chǎn)菌種，先采用MRS斜面進(jìn)行活化，再以三角瓶MRS液體培養(yǎng)基于 30 37°C， 100rpm搖床培養(yǎng)12h進(jìn)行活化，然后按4 —10%的接種量接入MRS或TYC或 改良PD種子培養(yǎng)基，于30 37'C， 100 180rpm攪拌培養(yǎng)12 24h，然后按4—10%接入 MRS或TYG或改良PD發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 37°C ， 100 180rpm攪拌下通過流加lmol/L NaOH 控制pH6.0 7. 0培養(yǎng)24 36h，按15 40g/L的終濃度的比率加入谷氨酸或谷氨酸鈉，通 過流加NaOH和HC1控制pH值在3.0 5. 0于35 45'C繼續(xù)發(fā)酵24 96h，從而獲得y-氨基 丁酸含量為10 20g/L的發(fā)酵醪。
實(shí)施例4:
以屎腸球菌為生產(chǎn)菌種，先釆用MRS斜面進(jìn)行活化，再以三角瓶MRS液體培養(yǎng)基于 30 37°C， 100rpm搖床培養(yǎng)12 24h進(jìn)行活化，然后按4 — 10%的接種量接入MRS或TYG 或改良PD種子培養(yǎng)基，于30 37。C, 100 180rpm攪拌培養(yǎng)12h，然后按4_10%接入MRS 或TYG或改良PD發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 37°C， 100 180rpm攪拌下通過流加lmol/L NaOH 控制pH6.0 7.0培養(yǎng)24h，然后解除pH控制，繼續(xù)發(fā)酵12 18h，按15 40g/L的終濃度 的比率加入谷氨酸或谷氨酸鈉，通過流加NaOH和HC1控制pH值在3.0 5. 0于35 45'C繼 續(xù)發(fā)酵24 96h，從而獲得Y-氨基丁酸含量為10 20g/L的發(fā)酵醪。經(jīng)過滅菌排放，即可進(jìn) 行GABA提取和精制。
實(shí)施例5:
以屎腸球菌為生產(chǎn)菌種，先采用MRS斜面進(jìn)行活化，再以三角瓶MRS液體培養(yǎng)基于 30 37°C， 100rpm搖床培養(yǎng)12 24h進(jìn)行活化，然后按4 — 10%的接種量接入MRS或TYG 或改良PD種子培養(yǎng)基，于30 37°C， 100 180rpm攪拌培養(yǎng)12 24h,然后按4 —10%接 入MRS或TYG或改良PD發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 37'C， pH6.0~7. 0， 100 180rpm攪拌下 培養(yǎng)24h，然后解除pH控制，繼續(xù)發(fā)酵12 18h，按15 40g/L的終濃度的比率加入谷氨酸 或谷氨酸鈉，然后控制pH值在3,0 5.0于35 45'C繼續(xù)發(fā)酵24 96h，從而獲得Y-氨基丁 酸含量為10 20g/L的發(fā)酵醪。經(jīng)過滅菌排放，即可進(jìn)行GABA提取和精制。
實(shí)施例6:
以屎腸球菌為生產(chǎn)菌種，先采用MRS斜面進(jìn)行活化，接入MRS或TYG或改良PD種 子培養(yǎng)基，于30 37'C, pH6.0 7.0， 100 180rpm攪拌培養(yǎng)12h,然后按4一10%接入 MRS或TYG或改良PD發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 37'C， pH6.0~7. 0, 100 180rpm攪拌下培養(yǎng) 24h，然后解除pH控制，繼續(xù)發(fā)酵12 18h，按15 40g/L的終濃度的比率加入谷氨酸或谷 氨酸鈉，然后控制pH值在3.0 5. 0于35 45'C繼續(xù)發(fā)酵24 96h，從而獲得，氨基丁酸含 量為10 20g/L的發(fā)酵醪。經(jīng)過滅菌排放，即可進(jìn)行GABA提取和精制。
權(quán)利要求
1.一種分步控制發(fā)酵條件深層發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，其特征為以屎腸球菌(Enterococcus faecium)為菌種，經(jīng)活化后接入種子培養(yǎng)基，于30～37℃，100～180rpm攪拌培養(yǎng)12～24h，將種子液按4～10％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30～37℃，100～180rpm攪拌下通過控制pH6.0～7.0培養(yǎng)24～36h，再解除pH控制繼續(xù)發(fā)酵12～18h，然后按15～40g/L的終濃度的比率加入谷氨酸或谷氨酸鈉，通過控制pH值在3.0～5.0于35～45℃繼續(xù)發(fā)酵24～96h，從而獲得γ-氨基丁酸發(fā)酵醪。
2、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的分步控制發(fā)酵條件深層發(fā)酵生產(chǎn)，氨基丁酸的方法，其特征為 培養(yǎng)基是MRS培養(yǎng)基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的分步控制發(fā)酵條件深層發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征為 培養(yǎng)基是TYG培養(yǎng)基。
4、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的分步控制發(fā)酵條件深層發(fā)酵生產(chǎn)？氨基丁酸的方法，其特征為 培養(yǎng)基是改良PD培養(yǎng)基。
專利摘要
本發(fā)明闡述了一種分步控制發(fā)酵條件深層發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，它是以屎腸球菌(Enterococcus faecium)為菌種，通過分步控制深層發(fā)酵的pH值和溫度條件，通過外源補(bǔ)加谷氨酸或谷氨酸鈉，發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸，發(fā)酵醪中γ-氨基丁酸濃度達(dá)到10～20g/L。該方法具有簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝、產(chǎn)率和設(shè)備的利用率高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P13/00GKCN101538595SQ200910114018
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月28日
發(fā)明者云 李, 楊勝遠(yuǎn), 錦 韋 申請(qǐng)人:韓山師范學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan