專利名稱:重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物重組構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
P-葡聚糖是禾本科植物細(xì)胞壁多糖成分，它富含在大麥、黑麥、高粱、稻和小麥等作物 的胚乳細(xì)胞壁中，不同物種其含量、比例也不相同。早期研究認(rèn)為大麥P-葡聚糖中含有連續(xù) 的P-1,3鍵；但越來越多的試驗(yàn)證明，大麥P-葡聚糖分子中不存在連續(xù)的P-1,3鍵，且|3-1，3鍵和 (3-l,4鍵的分布不是隨機(jī)的。不同來源P-葡聚糖中I3-1，3鍵和I3-1,4鍵所占的比例也不盡相同，其 中卩-1,3鍵約占25% 30% (Stone, B. A., Clarke, A. E" (1992). Chemistry and Biology of 1,3-P-Glucans. La Trobe Univesity Press. Strandberg, L., Enfors， S. ， (1991). Factors influencing inclusion body formation in the production of a flised protein in Escherichia coli. Appl.Environ.Microbiol. 57, 1669-1674)。 (3-葡聚糖具有高粘度，分為水溶性和水不溶性兩種。 水溶性p-葡聚糖所占比例較大，與蛋白質(zhì)結(jié)合的P-葡聚糖大都不溶于水，其中p-l，3鍵的含量 和糖的聚合度是影響水溶性的主要素。P-葡聚糖在水中溶解成為粘性溶液，其濃度愈高，粘 度愈大。高濃度p-葡聚糖會(huì)形成網(wǎng)結(jié)構(gòu)，能夠吸收其周圍的水分子，從而降低周圍環(huán)境的物 理特性。P-葡聚糖表層帶負(fù)電荷，在溶液中極易與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。此外，p-葡聚糖還 能吸附鈣、鋅、鈉等金屬離子以及有機(jī)質(zhì)。
p-葡聚糖在實(shí)際應(yīng)用中存在一些負(fù)面影響。在制造麥芽汁過程中，由于大量高分子P-葡 聚糖存在，致使麥芽汁粘度增大，過濾困難；在發(fā)酵過程中過量的P-葡聚糖還會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié) 合，使酵母早期沉淀。在動(dòng)物飼養(yǎng)中，存在于飼料中的P-葡聚糖由于自身的種種限制因素(高 粘性、高親水性、高吸水活性及吸附性等)影響營養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的代謝，從而降低動(dòng)物 對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率。因此研究能降解葡聚糖的葡聚糖酶具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。 p-l,3-l，4-葡聚糖酶作為一類重要的p-葡聚糖酶，主要來源于微生物，目前報(bào)道了60種不同種 類的真菌能產(chǎn)生降解非淀粉多糖的酶類。在桿菌、梭菌、纖維菌、真菌中都發(fā)現(xiàn)了0-1,3-1，4-葡聚糖酶，p-l，3-l，4-葡聚糖酶也存在于植物中，但人和動(dòng)物體內(nèi)卻是缺乏的(WenT.N.,etal.A truncated Fibrobacter succingenes l，3-l,4-P-D-glucanase with improved enzymatic activity and thermotolerance.Biochemistry,2005,44:9197-9205)。同時(shí)由于天然來源的(3-葡聚糖酶產(chǎn)量小，穩(wěn)定性低，而且天然野生菌株培養(yǎng)困難，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用；因此通過基因工程手 段構(gòu)建高表達(dá)量重組工程菌越來越受到國內(nèi)外的關(guān)注。
P-l，3-l,4-葡聚糖酶應(yīng)用于啤酒工業(yè)，它可分解大麥及麥芽中的P-葡聚糖凝膠，降低麥汁 粘度，提高麥汁的過濾速度、麥汁浸出率，減少膠狀沉淀物，改善啤酒的混濁度，從而提高 產(chǎn)品質(zhì)量。(3-葡聚糖酶在啤酒工業(yè)中的應(yīng)用主要通過兩個(gè)途徑 一是添加外源P-葡聚糖酶， 劉妙蓮等(劉妙蓮，林宇野，王潔，王薇青.(3-葡聚糖酶(EC. 3.2. 1.73)的研究n.(i-葡聚 糖酶的性質(zhì)及應(yīng)用[J],食品與發(fā)酵工業(yè)，1989)將來自枯草芽孢桿菌(^^7/Mra6rito)的(3-葡聚糖酶制劑添加于麥芽汁中，降低了麥芽汁粘度，改善了啤酒質(zhì)量；二是改良釀酒酵母， 黃興奇等(黃興奇，鄭偉軍，陳永青，宋大新.P-l,3-l，4-葡聚糖酶基因亞克隆研究，西南農(nóng)業(yè) 學(xué)報(bào)，1990)將枯草芽孢桿菌C8""7/w甜6說/0中分離得到的P-l,3-l,4-葡聚糖酶基因克隆到 釀酒酵母(S.謂v她e)中，表達(dá)良好。Courtois等(Courtois,J.E., (1987). [Use of a filtration enzyme with dominant beta-glucanase activity produced by Disporotrichum dimorphosporum, in beer brewing]. Bull.Acad.Natl.Med.
71， 693-694)克隆真菌的P-葡聚糖酶基因獲得了一株酶分 解能力較高的改良酵母菌株，能使麥芽汁粘度降低，加速過濾，提高麥芽汁收率，啤酒質(zhì)量 得到明顯改善。
在飼料添加劑方面，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物能夠借助腸胃中的瘤胃微生物產(chǎn)生的P-葡聚 糖酶消化利用p-葡聚糖，而單胃動(dòng)物由于自身不具備合成(3-葡聚糖酶的微生物以及分解P-葡 聚糖的酶系，使食糜在腸道中具有較高的粘度，阻止腸道消化液與食糜的充分混合，從而阻 止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降低了飼料的轉(zhuǎn)化率，成為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，限制了大麥等作物在詞料 中的應(yīng)用(Brenes， A., Smith, M., Guenter, W" Marquardt, R. R. Effect of enzyme supplementation on the performance and digestive tract size of broiler chickens fed wheat- and barley-based diets[J]. Poult.Sci., 1993, (72): 1731-1739.)。自20世紀(jì)90年代起，人們對(duì)葡聚糖酶作為飼料添加劑做 了大量的研究。 一般地，在飼料中添加酶制劑是為了了提高飼料的飼用價(jià)值，減小營養(yǎng)成分 質(zhì)量的差異，減小糞便的粘度等。在飼養(yǎng)中添加酶制劑后發(fā)現(xiàn)，消化性能好的和差的谷物之 間飼養(yǎng)效果差異減小，在存在酶的情況下，谷物中的營養(yǎng)含量高于沒有酶存在的情況。Ji等 (Ji， F., Casper, D. P., Brown, P. K., Spangler， D. A.， Haydon， K. D.， Pettigrew， J. E. Effects of dietary supplementation of an enzyme blend on the ileal and fecal digestibility of nutrients in growing pigs [J]. J .Anim. Sci.， 2008， (86): 1533-1543)用大豆和大麥的混和詞料飼養(yǎng)豬仔，在 飼料中添加P-葡聚糖酶后，干物質(zhì)、粗蛋白和能量的消化率都直線增長(zhǎng)。當(dāng)添加葡聚糖酶含 量為0.2%時(shí)，粗蛋白的消化率從81.6%上升至88.5%，能量的消化率從85.2%升至89.5%。
4Fang等(Fang, Z. F.， Liu， Z. L.， Dai, J. J., Qian, H. Y., Qi， Z. L.， Ma, L. B., Peng， J. Effects of enzyme addition on the nutritive value of broiler diets containing hulled or dehulled Chinese double-low rapeseed meals [J]. J. Anim. Physiol. Anim.， 2008, Nutr.(Berl))改變飼料中的大麥和 玉米的比例，并在添加和不添加P-葡聚糖酶兩個(gè)水平下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究p-葡聚糖酶對(duì)火雞生長(zhǎng) 的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不添加(3-葡聚糖酶的情況下，當(dāng)大麥的含量在250 g/kg以上時(shí)，火雞的 閂增重減少。在大麥含量為250 g/kg的詞料中添加P-葡聚糖酶可以提高小雞日增重。在糊漿 飼料(其中大麥50%，玉米20%)添加(3-葡聚糖酶可使小雞的體重增加了4.5%，而且粘性 糞便次數(shù)也明顯地降低，既提高了生長(zhǎng)速率也提高了飼料的轉(zhuǎn)化率。
本申請(qǐng)人在公開號(hào)為CN101235366的發(fā)明專利申請(qǐng)中提供一種具有較高活性，適于工業(yè) 化生產(chǎn)的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-P-l， 3-1， 4-葡聚糖酶的方法。重組大腸桿菌 XM-LU (已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào) 為CGMCC No.2246)是大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的另一目的旨在應(yīng)用重組巴斯德畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-6g/發(fā)酵獲得 e -1，3-1，4-葡聚糖酶。
本發(fā)明所述重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法包括以下步驟
1) 雜合P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的獲取
從重組大腸桿菌XM-LU中提取質(zhì)粒pXMLu，以質(zhì)粒pXMLu為模板，設(shè)計(jì)引物如下 上游引物BGL1: 5，隱隱CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT—3，， 下游引物BGL2: 5，--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT—3，，
在雜合P-l,3-l,4-葡聚糖酶基因兩端分別引入Ecoi I和兩個(gè)酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增得大小
為717 bp的雜合p-l，3-l，4-葡聚糖酶基因；
2) 巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
將獲得的雜合P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因用￡COR I和iVo/ I雙酶切，將雙酶切后的雜合 p-l,3-l，4-葡聚糖酶基因與經(jīng)過I和I雙酶切的載體pPIC9K連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受 態(tài)大腸桿菌JM109，得構(gòu)建好的重組載體pPIC9K-&g/;
3) 雜合p-l，3-l，4-葡聚糖酶重組畢赤酵母的構(gòu)建及篩選
將重組載體pPIC9K-6g/線性化導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母，經(jīng)篩選得一株重組菌株，即重組畢 赤酵母工程菌，將重組畢赤酵母工程菌命名為GS115/pPIC9K-6g/。
5所述雜合p-l，3-l，4-葡聚糖酶基因來源于枯草芽孢桿菌，雜合P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因214 個(gè)氨基酸由5flcz7/iw a/^/o we/a"'e似的p-l,3-l，4-葡聚糖酶氨基端的107個(gè)氨基酸殘基和107 個(gè)來自于5ac說w《中p-葡聚糖酶碳端氨基酸殘基組成，這個(gè)重組的基因通過5flc///i aw_y/o/Z^/e/a"'m$中P-葡聚糖酶的自然啟動(dòng)子表達(dá)。
所述巴斯德畢赤酵母可采用巴斯德畢赤酵母GS115等。
所述重組畢赤酵母工程菌的應(yīng)用為以重組巴斯德畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-6g/發(fā) 酵獲得e-l,3-l,4-葡聚糖酶。
本發(fā)明利用基因工程構(gòu)建一種可高效表達(dá)卩-l,3-l，4-葡聚糖酶的重組巴斯德畢赤酵母工程 菌，其表達(dá)雜合P-l,3-l,4-葡聚糖酶活力為1125 IU/mL，蛋白表達(dá)量為1.22 g/L。
P-1,3-1,4-葡聚糖酶具有酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好及催化pH范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在酸性環(huán)境中的熱穩(wěn)定性 大大高于單一的野生型P-葡聚糖酶，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1為實(shí)施例1中雜合|3-1，3-1,4-葡聚糖酶基因6g/的PCR產(chǎn)物電泳。其中1號(hào)樣品為 DNAmarker; 2， 3， 4, 5號(hào)樣品為bgl的PCR產(chǎn)物；標(biāo)記的基因大小從上至下分別為l.OKb， 700bp， 500bp。
圖2為實(shí)施例1中酵母重組子拷貝數(shù)篩選圖。其中篩選得到11株重組菌。
圖3為實(shí)施例1中酵母重組子基因組PCR驗(yàn)證；1號(hào)樣品為DNAmarker， 2號(hào)樣品為野 生GS115基因組為模板，3~6樣品分別為以AOXl/AOX2， BGL1/BGL2， AOXl/BGL2， BGLl/AOX2為引物。標(biāo)記的基因大小從上至下分別為2.0Kb， 1.5Kb， 1.0Kb， 750bp。
圖4為實(shí)施例2中畢赤酵母重組子GS115/pPIC9K-6g/發(fā)酵過程中干重(正方形表示)， 酶活力(圓形表示)及蛋白表達(dá)量(三角形)示意圖，圖中橫座標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間Cultivationtime/h， 縱座標(biāo)分別為酵母細(xì)胞生物量(干重)Dry cell weight/g L" (■)、酶活力Enzyme activity/U ml/1 (參)和蛋白表達(dá)量Proteinconcentration/g L" (▲)。
圖5為實(shí)施例2中畢赤酵母重組子GS115/pPIC9K-6g/發(fā)酵過程中發(fā)酵液中p-l，3-l,4-葡 聚糖酶的表達(dá)量的SDS-PAGE圖。其中，樣品1為蛋白質(zhì)標(biāo)記，樣品2 8分別為誘導(dǎo)24、 36、 48、60、 72 、 84、 96小時(shí)的蛋白表達(dá)量；標(biāo)記的蛋白大小為35kDa;箭頭表示重組蛋白recombinant protein 。
圖6為實(shí)施例3中p-l,3-l，4-葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH (正方形表示)和pH穩(wěn)定性(圓 形表示)測(cè)定結(jié)果示意圖。在圖6中，橫座標(biāo)為pH值，縱座標(biāo)為相對(duì)酶活力Relative enzyme activity/%; B為pH optimum, *為stability。圖7為實(shí)施例3中P-l,3-l,4-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度(圓形表示)和熱穩(wěn)定性正方形測(cè) 定結(jié)果示意圖。在圖7中，橫座標(biāo)為溫度Temperature/°C ，縱座標(biāo)為相對(duì)酶活力Relative enzyme activity/%; 畫為temperature optimum, #為stability。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例中使用的酶和試劑限制性內(nèi)切酶(MjfI、 ￡"RI、 Sflcl)， DNA和蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)，￡ co// JM109均購自大連寶生物公司；載體pPIC9K，菌株畢赤酵母GSI15均購自 Invitrogen公司；G418，地衣多糖購于Sigma公司。
實(shí)施例中使用的主要培養(yǎng)基YPD， MD，有機(jī)培養(yǎng)基(BMGY/BMMY)，無機(jī)培養(yǎng)基 BSM，可參見畢赤酵母操作手冊(cè)。
實(shí)施例1:巴斯德畢赤酵母重組工程菌GS115/pPIC9K-6g/的制備
1) 雜合p-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的獲取
雜合P-l,3-l，4-葡聚糖酶基因來源于枯草芽孢桿菌。雜合P-l，3-l,4-葡聚糖酶基因214個(gè)氨 基酸由兩部分組成，即由Bfl"'〃w 的P-l，3-l,4-葡聚糖酶氨基端的107個(gè)氨基
酸殘基和107個(gè)來自于5mz7/m /m^era/w中P-葡聚糖酶碳端氨基酸殘基組成。這個(gè)重組的基 因通過5"c說w a/nv/o//^e/a"'ew中p-葡聚糖酶的自然啟動(dòng)子表達(dá)。表達(dá)的雜合(J-葡聚糖酶在 酸性環(huán)境中的熱穩(wěn)定性大大高于單一的野生型P-葡聚糖酶。
從重組大腸桿菌XM-LU (中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登 記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.2246)中提取質(zhì)粒pXMLu，以該質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物如下 上游弓I物BGL1: 5，-隱CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT—3' 下游引物BGL2: 5，—AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT—3' 在雜合P-l,3-l,4-葡聚糖酶基因兩端分別引入Eco及I和M^I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增條件為95°C4 min; (94 °C 1 min; 55 °C 1 min; 72 °C 1 min; 30個(gè)循環(huán))，72 °C 10 min，擴(kuò)增得到的雜合|3-1,3-1，4隱 葡聚糖酶基因大小約為717bp (見圖l)。
2) 巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
將獲得的雜合(3-l，3-l,4-葡聚糖酶基因用五coRI和iVoH進(jìn)行雙酶切，并與同樣經(jīng)過五co及 I和AAW I雙切的載體pPIC9K進(jìn)行過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，過夜培 養(yǎng)后，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)氨芐抗性和卡那霉素選擇篩選出陽性克隆。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證， 測(cè)序結(jié)果表明序列完全正確；將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體命名為pPIC9K-6g/。
3) 雜合P-l,3-l,4-葡聚糖酶重組畢赤酵母的構(gòu)建及篩選取構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pPIC9K-6g/2(^1，經(jīng)限制性內(nèi)切酶&c I，在37°C下酶切24h， 然后將酶切產(chǎn)物用無水乙醇沉淀，溶于10pl無菌水，加入8(HU畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞， 冰浴5min，在1500伏電壓(25^F)條件下電擊，迅速加入1 ml mol/L的山梨醇，于30°C倒 置培養(yǎng)2h，然后將培養(yǎng)物涂布于含抗生素G418 (0.25mg/ml)的MD平板上，30°C倒置培 養(yǎng)2 5天，直至MD上長(zhǎng)出清晰菌落。
重組菌拷貝數(shù)篩選將MD上長(zhǎng)出的菌落分別點(diǎn)接于含不同濃度G418 (0.25、 0.5、 1.0、 1.5、 1.75、 2.0、 2.25、 3.0mg/mL)的YPD培養(yǎng)基上，30。C培養(yǎng)三天，篩選出了ll株高抗性 (可在含2.0 mg/ml G418的YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng))的重組畢赤酵母，此11株重組酵母均為8 個(gè)拷貝數(shù)的重組菌(見圖2)。
將篩選得到的8個(gè)拷貝數(shù)的重組菌在YPD上過夜培養(yǎng)，提取重組菌總基因組，以A0X1: 5，—GAC TGGTTCCAATTGACA AGC—3'、 A0X2: 5，一GGC AAA TGG CAT TCT GAC ATCC-3'及BGL1和BGL2為引物，鑒定p-l，3-l,4-葡聚糖酶基因是否整合進(jìn)酵母染色體，結(jié)果 (如圖3)顯示，泳道2為以野生的GS115的基因組為模板，以AOXl/AOX2為引物得到的條帶； 泳道3-6均以重組菌的總基因組為模板，其中泳道3為以AOXl/AOX2為引物得到的條帶，泳道 4為以BGL1/BGL2為引物同樣得到的條帶，而泳道5為以A0X1/BGL2得到的條帶，泳道6為以 BGLl/AOX2得到的條帶，以上2-6泳道所得到的條帶都與預(yù)期大小一致，由此說明(3-1,3-1,4-葡聚糖酶基因已成功導(dǎo)入畢赤酵母，獲得了重組酵母工程菌。
挑取篩選出的11株重組菌，分別轉(zhuǎn)接于含25mLBMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C， 200轉(zhuǎn)/分鐘下，培養(yǎng)24小時(shí)OD=4，收集菌體重懸于10 mL的BMMY中，以1%的甲醇作 為碳源，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)P-l，3-l，4-葡聚糖酶，以地衣多糖為專一性底物，測(cè)定其酶活力，最終 從11株重組菌中篩選出了一株最優(yōu)重組菌株，將這株最優(yōu)重組菌株命名為巴斯德畢赤酵母 GS115/pPIC9K-6g/。
實(shí)施例2:利用巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-frg/發(fā)酵生產(chǎn)p-l,3-l,4-葡聚糖酶 以巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-6g/為出發(fā)菌株，接種于4瓶分別裝有50 mL BMGY 培養(yǎng)基的300mL搖瓶中，30°C， 200轉(zhuǎn)/分鐘下，培養(yǎng)24小時(shí)00=4;將此200 mL菌液接種 于已滅菌的3.6 L(含2 L BSM無機(jī)培養(yǎng)基)自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，用氨水和磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0， 啟動(dòng)發(fā)酵罐，開始進(jìn)行發(fā)酵，此時(shí)轉(zhuǎn)速恒定在800轉(zhuǎn)/分鐘；25小時(shí)后，初始BSM中的甘油 耗盡，開始進(jìn)入甘油補(bǔ)加階段，以50%的甘油，18 mL/h繼續(xù)流加4小吋，待甘油耗盡，溶 氧回升到接近100%;接著開始流加甲醇，將pH調(diào)至6.0，進(jìn)入P-l,3-l，4-葡聚糖酶的分泌表 達(dá)階段；轉(zhuǎn)速仍恒定在80O轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧設(shè)定為與甲醇流加相關(guān)聯(lián)，以甲醇的流加調(diào)控溶氧，使溶氧維持在35%。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定酶活。整個(gè)過程的最高酶活力高達(dá)1125 U/mL、蛋白 表達(dá)量為1.22g/L，酵母細(xì)胞生物量(干重)為88.5g/L (見圖4)。
SDS-PAGE蛋白檢領(lǐng)!l:在甲醇開始誘導(dǎo)表達(dá)后的，12h， 24h， 36h， 48h， 60h， 72h， 84h， 96h的發(fā)酵液，用TCA方法沉淀蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE，蛋白電泳結(jié)果(如圖5)顯示， 蛋白大小為34kDa。
實(shí)施例3: P-l,3-l,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
一. 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性測(cè)定
最適反應(yīng)pH:取稀釋100倍的酶液25ul，加入0.05mol/L，用不同pH(pH3.5， 4.0， 4.5， 5.0， 5.5， 6.0， 6.5， 7.0， 8.0)的醋酸鈉緩沖液配制的0.5%地衣多糖500ul，測(cè)定在不同pH條 件下p-l,3-l,4-葡聚糖酶的活力。以pH6.0時(shí)的相對(duì)酶活力定為100%，于50。C下測(cè)定酶活， 其結(jié)果見圖6，由圖可知，P-l，3-l,4-葡聚糖酶的最合適反應(yīng)pH為6.0。
pH穩(wěn)定性:將粗酶液置于不同pH (3.5， 4.0， 4.5， 5.0， 5.5， 6.0， 6.5， 7.0， 8.0)的緩 沖液(檸檬酸鈉緩沖液)中，5(TC放置60min，然后將pH調(diào)回6.0，在50 °C下進(jìn)行酶學(xué)反應(yīng)， 測(cè)定剩余酶活力，以相對(duì)酶活力最高的定為100Q/。。由圖6可知，pH4.0 8.0之間經(jīng)酸處理60min 后，酶活力仍達(dá)到80%以上，說明P-l,3-l,4-葡聚糖酶具有相當(dāng)好的酸堿穩(wěn)定性。
二. 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性測(cè)定
最適反應(yīng)溫度取稀釋100倍的粗酶液25ul，加入500ul 0.5%地衣多糖(用0.04mol/L， pH6.0醋酸緩沖液配制)，在不同溫度(30。C， 40°C， 45。C， 50 。C， 55 。C， 60 。C， 65 。C， 70 。C) 條件下進(jìn)行酶學(xué)反應(yīng)，測(cè)定P-l,3-l,4-葡聚糖酶活力，其結(jié)果如圖7，以相對(duì)酶活力最高者為 100%， p-l，3-l，4-葡聚糖酶活力在5(TC時(shí)，其酶活力達(dá)到最高，因此其最適反應(yīng)溫度為50。C。
熱穩(wěn)定性將酶液分別在30。C， 40°C， 50°C， 60 °C, 70 °C條件下保溫150 min，然后在 50°C， pH6.0條件下進(jìn)行酶學(xué)反應(yīng)，測(cè)定殘余酶活力以相對(duì)酶活力最高者為100%，結(jié)果如圖 7所示，酶液在30-65 。C之間保溫150 min，仍具有60%以上的酶活力，說明P-l,3-l,4-葡聚 糖酶活力具有較好的熱穩(wěn)定性。
酶學(xué)性質(zhì)分析表明雜合P-l，3-l,4-葡聚糖酶基因表達(dá)的雜合P-葡聚糖酶在酸性環(huán)境中的熱 穩(wěn)定性大大高于單一的野生型P-葡聚糖酶。
9SEQUENCE LISTING
<no>廈門大學(xué)
<120>雜合e -1，3-1，4-葡聚糖酶重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建
<130> 09N118
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< 170> Patentln version 3.3
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<212> DNA <213>引物l-BGLl
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cggaattcat gaaacgagtg ttgct 25
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<213>質(zhì)粒片斷l(xiāng)-AOXl
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<213>質(zhì)粒片斷2-AOX2<400> 4
ggcaaatggc attctgacat cc 22
權(quán)利要求
1.重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟
1)雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的獲取
從重組大腸桿菌XM-LU中提取質(zhì)粒pXMLu，以質(zhì)粒pXMLu為模板，設(shè)計(jì)引物如下
上游引物BGL15’--CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，
下游引物BGL25’--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，在雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因兩端分別引入EcoR I和Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增得大小為717bp的雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因；
2)巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
將獲得的雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I雙酶切，將雙酶切后的雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因與經(jīng)過EcoR I和Not I雙酶切的載體pPIC9K連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，得構(gòu)建好的重組載體pPIC9K-bgl；
3)雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重組畢赤酵母的構(gòu)建及篩選
將重組載體pPIC9K-bgl線性化導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母，經(jīng)篩選得一株重組菌株，即重組畢赤酵母工程菌。
2. 如權(quán)利要求
1所述的重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述雜合|3-1，3-1，4-葡聚糖酶基因來源于枯草芽孢桿菌。
3. 如權(quán)利要求
1或2所述的重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述雜合 (3-l,3-l,4-葡聚糖酶基因214個(gè)氨基酸由5ac!7/iw a附y(tǒng)/o/,Xacfera的p-l，3-l，4-葡聚糖酶氨基端 的107個(gè)氨基酸殘基和107個(gè)來自于Bacz7/^ wacerara中P-葡聚糖酶碳端氨基酸殘基組成， 重組的基因通過Bac說^ amy/o//^/e/ac/era中(3-葡聚糖酶的自然啟動(dòng)子表達(dá)。
4. 如權(quán)利要求
1所述的重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述巴斯德畢赤酵 母為巴斯德畢赤酵母GS115。
5. 以權(quán)利要求
1所述的重組巴斯德畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-6g/發(fā)酵獲得 0 -1,3-1，4-葡聚糖酶。
專利摘要
重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用，涉及一種微生物重組構(gòu)建方法及應(yīng)用。將雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶插入pPIC9K，構(gòu)建出重組載體pPIC9K-bgl，然后將重組載體pPIC9K-bgl線性化導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母，經(jīng)篩選得一株最優(yōu)重組菌株，命名為GS115/pPIC9K-bgl。所構(gòu)建的畢赤酵母工程菌表達(dá)雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力為1125IU/mL，蛋白表達(dá)量為1.22g/L。該酶具有酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好及催化pH范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在酸性環(huán)境中的熱穩(wěn)定性大大高于單一的野生型β-葡聚糖酶，其最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為50℃，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/24GKCN101684475SQ200910111908
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2009年6月2日
發(fā)明者盧英華, 敬科舉, 梁達(dá)奉, 亭 郭, 陳龍軍 申請(qǐng)人:廈門大學(xué);廣州甘蔗糖業(yè)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan