專利名稱:生產(chǎn)l－氨基酸的方法和新型基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，具體地說(shuō)涉及生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸的方法，以及涉及用于所述方法的微生物和新型基因。L-賴氨酸廣泛用作動(dòng)物飼料添加劑等，而L-谷氨酸廣泛用作調(diào)味品的原料等。
而且，已經(jīng)公開了采用重組DNA技術(shù)增強(qiáng)L-氨基酸生物合成酶，從而提高L-氨基酸生產(chǎn)能力的各種技術(shù)。例如，對(duì)于具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌，已經(jīng)知道可以通過(guò)導(dǎo)入不同所述基因提高所述細(xì)菌的生產(chǎn)能力，其中所述基因?yàn)榫幋a其L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制作用已脫敏的天冬氨酸激酶基因(突變型lysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapB)、二氫吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysA)和二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(WO96/40934)、lysA和ddh(日本專利公開(kokai)號(hào)9-322774)、lysC、lysA和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因)(ppc)(日本專利公開號(hào)10-165180)、突變型轉(zhuǎn)氨酶基因(aspC)(日本專利公開號(hào)10-215883)。
而且，對(duì)于埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌，已經(jīng)知道通過(guò)依次增強(qiáng)dapA、突變型lysC、dapB和二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(或四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶基因(dapD)和琥珀酰二氨基庚二酸脫酰酶基因(dapE))(WO 95/16042)，提高L-賴氨酸的生產(chǎn)能力。順便提出在WO95/16042中，錯(cuò)誤地將四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶描述為琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶。
還報(bào)道了導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的編碼檸檬酸合酶的基因有效提高棒狀桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌的L-谷氨酸生產(chǎn)能力(日本特許公報(bào)號(hào)7-121228)。另外，日本專利公開號(hào)61-268185公開了具有包含來(lái)自棒狀桿菌的谷氨酸脫氫酶基因的重組DNA的細(xì)胞。日本專利公開號(hào)63-214189還公開了通過(guò)增強(qiáng)谷氨酸脫氫酶基因、異檸檬酸脫氫酶基因、烏頭酸水合酶基因和檸檬酸合酶基因提高L-谷氨酸生產(chǎn)能力的技術(shù)。
然而，沒有報(bào)道棒狀桿菌編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的結(jié)構(gòu)，迄今為止也不了解利用編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因培育棒狀桿菌。
另外，仍不了解棒狀桿菌例如短桿菌屬細(xì)菌的編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明發(fā)明者進(jìn)行了不懈研究。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)，如果將編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)氚魻顥U菌中以增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性，就能夠提高L-賴氨酸或L-谷氨酸的產(chǎn)量。他們還成功地分離出編碼乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因。因此他們完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供(1)胞內(nèi)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)并且能夠產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀桿菌。
(2)按照(1)的棒狀桿菌，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸。
(3)按照(1)的棒狀桿菌，其中所述果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性是因?yàn)樗黾?xì)菌細(xì)胞中編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因拷貝數(shù)增加而增強(qiáng)。
(4)按照(3)的棒狀桿菌，其中所述編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因得自埃希氏菌屬細(xì)菌。
(5)按照(3)的棒狀桿菌，其中所述編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因得自棒狀桿菌。
(6)一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，該方法包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)按照(1)至(5)任一項(xiàng)的棒狀桿菌，在培養(yǎng)液中產(chǎn)生并積累L-氨基酸，并從培養(yǎng)物中收集L-氨基酸。
(7)按照(6)的方法，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸。
(8)按照(6)或(7)的方法，其中所述培養(yǎng)基包含作為碳源的果糖。
(9)編碼下面(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)的DNA(A)具有序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有存在一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒置的序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白質(zhì)，而且該蛋白質(zhì)具有果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。
(10)按照(9)的DNA，所述DNA是下面(a)或(b)定義的DNA(a)包含序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸號(hào)為881-2499的核苷酸序列的DNA，(b)在嚴(yán)格條件下與序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸號(hào)為881-2499的核苷酸序列或者由所述核苷酸序列制備的探針雜交并編碼具有果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
下面將詳細(xì)解釋本發(fā)明。(1)本發(fā)明的棒狀桿菌本發(fā)明的棒狀桿菌是具有L-氨基酸生產(chǎn)能力和胞內(nèi)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)的棒狀桿菌。所述L-氨基酸可以是L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸等。其中優(yōu)選L-賴氨酸和L-谷氨酸。盡管下面主要用具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力或L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌解釋本發(fā)明的實(shí)施方案，但是本發(fā)明可同樣用于任何L-氨基酸，只要需要L-氨基酸的合適生物合成系統(tǒng)位于果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的下游。
本發(fā)明所指的棒狀桿菌包括Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology(第8版，第599頁(yè)(1974))中定義的一組微生物，它們是不能產(chǎn)生孢子的需氧、革蘭氏陽(yáng)性非抗酸桿菌。包括迄今分類為短桿菌屬、但是目前歸入棒狀桿菌屬(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))的細(xì)菌，還包括屬于與棒狀桿菌屬緊密相關(guān)的短桿菌屬或微桿菌屬細(xì)菌。適合用于生產(chǎn)L-賴氨酸或L-谷氨酸的棒狀桿菌菌株實(shí)例包括例如以下菌株嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC 13870(Corynebacteriumacetoacidophilum ATCC 13870)；醋谷棒狀桿菌ATCC 15806(Corynebacterium acetoglutamicumATCC 15806)；美棒狀桿菌ATCC 15991(Corynebacterium callunae ATCC15991)；谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)；(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC 14020(Brevibacterium divaricatumATCC 14020)；(乳發(fā)酵短桿菌)ATCC 13869(Brevibacterium lactofermentumATCC 13869)；(百合花棒狀桿菌)ATCC 15990(Corynebacterium lilium ATCC15990)；(黃色短桿菌)ATCC 14067(Brevibacterium flavum ATCC14067)；Corynebacterium melassecola ATCC 17965；解糖短桿菌ATCC 14066(Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066)；Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；玫瑰色短桿菌ATCC 13825(Brevibacterium roseum ATCC13825)；生硫短桿菌ATCC 19240(Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240)；嗜氨微桿菌ATCC 15354(Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354)；Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)。
為了獲得這些菌株，例如可以由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美國(guó))提供。就是說(shuō)，每種菌株都有登記號(hào)，人們可以利用登記號(hào)要求供給每種菌株。對(duì)應(yīng)于所述菌株的登記號(hào)顯示在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄上。而且，根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，將AJ12340菌株保藏在作為國(guó)際保藏單位的國(guó)立生命科學(xué)和人體科學(xué)技術(shù)研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of IndustrialScience and Technology，Ministry of International Trade and Industry，1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postal code305-8566)。
除了前面提到的菌株之外，也可以將來(lái)自這些細(xì)菌菌株并能夠產(chǎn)生L-氨基酸例如L-賴氨酸或L-谷氨酸的突變株用于本發(fā)明。這種人工突變株實(shí)例包括抗S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(此后縮寫為“AEC”)的突變株(例如乳發(fā)酵短桿菌AJ11082(NRRL B-11470)，參閱日本專利公告(KoKoKu)號(hào)56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437和7-112438)，其生長(zhǎng)需要氨基酸例如L-高絲氨酸的突變株(日本專利公告號(hào)48-28078和56-6499)，抗AEC而且還需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸的突變株(美國(guó)專利號(hào)3,708,395和3,825,472)，抗DL-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺、α-氨基-十二烷基內(nèi)酰胺、天冬氨酸類似物、磺胺藥物、醌式和N-十二烷基亮氨酸的L-賴氨酸生產(chǎn)突變株，抗草酰乙酸脫羧酶或呼吸道酶抑制劑的L-賴氨酸生產(chǎn)突變株(日本專利公開號(hào)50-53588、50-31093、52-102498、53-9394、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995、56-39778，日本專利公告號(hào)53-43591和53-1833)，需要肌醇或乙酸的L-賴氨酸生產(chǎn)突變株(日本專利公開號(hào)55-9784和56-8692)，對(duì)氟代丙酮酸或34℃或更高溫度敏感的L-賴氨酸生產(chǎn)突變株(日本專利公開號(hào)55-9783和53-86090)，抗乙二醇的短桿菌屬或棒狀桿菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)突變株(美國(guó)專利號(hào)4,411,997)等。
此外，作為具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌還可列舉嗜乙酰乙酸棒狀桿菌AJ12318(FERM BP-1172)(參閱美國(guó)專利號(hào)5,188,949)等，作為具有L-異亮氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌還可列舉黃色短桿菌AJ12149(FERM BP-759)(參閱美國(guó)專利號(hào)4,656,135)。(2)增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性為了增強(qiáng)棒狀桿菌細(xì)胞中的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，可以通過(guò)將編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因片段和在所述細(xì)菌中起作用的載體(優(yōu)選多拷貝載體)連接制備重組DNA，然后將其導(dǎo)入能夠產(chǎn)生L-賴氨酸或L-谷氨酸的棒狀桿菌中以使其轉(zhuǎn)化。從而增加所述轉(zhuǎn)化株細(xì)胞中編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的拷貝數(shù)，因此增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。在大腸桿菌中，果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶由fruA基因編碼。
盡管果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因優(yōu)選來(lái)自棒狀桿菌的基因，但是也可以使用來(lái)自其他生物例如埃希氏菌屬細(xì)菌的任何這樣的基因。
已經(jīng)闡明了大腸桿菌fruA基因的核苷酸序列(Genbank/EMBL/DDBJ編號(hào)M23196)，因此可以通過(guò)采用基于所述核苷酸序列制備的引物(例如，在序列表中表示為SEQ ID NO1和2的引物)和大腸桿菌染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參閱White，T.J.等人，Trends Genet.5，185(1989))，獲得fruA基因。
此外，也可以如下獲得棒狀桿菌(例如乳發(fā)酵短桿菌)的fruA基因的部分序列選擇與由已知fruA基因(例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌、生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)和野油菜黃單胞菌(Xanthomonsa compestris)的fruA基因)預(yù)測(cè)的氨基酸序列具有高同源性的區(qū)段，根據(jù)該區(qū)段氨基酸序列制備用于PCR的引物，最后采用乳發(fā)酵短桿菌作為模板進(jìn)行PCR。作為上述引物的實(shí)例，可以列舉表示為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的寡核苷酸。
然后，利用如上所述獲得的fruA基因部分序列，通過(guò)反向PCR(Genetics，120，621-623(1988))的方法、利用LA-PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)的方法等獲得fruA基因的5’未知區(qū)段和3’未知區(qū)段。當(dāng)使用LA-PCR體外克隆試劑盒時(shí)，可以通過(guò)例如第一PCR采用表示為SEQ ID NO5和9的引物進(jìn)行而第二PCR采用表示為SEQID NO6和10的引物進(jìn)行，獲得fruA基因的3’未知區(qū)段。進(jìn)一步，可以通過(guò)例如第一PCR采用表示為SEQ ID NO7和9的引物而第二PCR采用表示為SEQ ID NO8和10的引物進(jìn)行，獲得fruA基因的5’未知區(qū)段。包含如上所述獲得的全長(zhǎng)fruA基因的DNA片段的核苷酸序列表示為SEQ ID NO13。而且，從上述核苷酸序列推導(dǎo)的可讀框翻譯的氨基酸序列表示為SEQ ID NO14。
而且，因?yàn)楸景l(fā)明闡明了乳發(fā)酵短桿菌的fruA基因及其側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列，所以可以采用基于上述側(cè)翼區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸通過(guò)PCR獲得包含全長(zhǎng)fruA基因的DNA片段。
也可以通過(guò)相似方法獲得其他細(xì)菌編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因。
本發(fā)明的fruA基因可以是編碼在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)存在一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒置的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，前提是所述編碼蛋白質(zhì)的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性不降低。盡管“幾個(gè)”氨基酸的數(shù)目在本文中根據(jù)氨基酸殘基在所述蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的位置和類型而不同，但是它可以具體為2-200個(gè)，優(yōu)選2-50個(gè)，更優(yōu)選2-20個(gè)。
例如利用定點(diǎn)誘變方法修飾fruA核苷酸序列，從而應(yīng)該在具體位點(diǎn)發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒置，可以獲得編碼與上述果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶大體相同的蛋白質(zhì)的DNA。也可以用常規(guī)已知誘變處理獲得如上所述修飾DNA。所述誘變處理包括處理DNA后用羥胺等體外誘變處理的方法和處理包含DNA的微生物(例如埃希氏菌屬細(xì)菌)后用紫外線照射或采用通常用于誘變處理的誘變劑例如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸進(jìn)行誘變處理的方法。
可以在合適的細(xì)胞中表達(dá)具有如上所述的突變的DNA并檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的活性，從而確認(rèn)編碼與果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶大體上相同的蛋白質(zhì)的DNA。也可以從編碼突變果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的DNA或含有該DNA的細(xì)胞分離下述DNA獲得編碼與果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶大體相同的蛋白質(zhì)的DNA在嚴(yán)格條件下，與具有含例如對(duì)應(yīng)于序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸號(hào)為881-2944的核苷酸序列或其部分的探針雜交的DNA，而且該DNA編碼具有果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。“嚴(yán)格條件”在本文中是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件。用任何數(shù)值都難以清楚表達(dá)這樣的條件。然而，典型嚴(yán)格條件例如為高同源性DNA(例如同源性高于50％的DNA)彼此雜交而同源性低于50％的DNA則彼此間不雜交的條件?；蛘叩湫蛧?yán)格條件例如為DNA在相當(dāng)于DNA雜交一般洗滌條件(即1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS)的鹽濃度下于60℃彼此雜交的條件。
也可以使用SEQ ID NO13核苷酸序列的部分序列作為探針。可以采用基于SEQ ID NO13的核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物，而包含SEQ ID NO13的核苷酸序列的DNA片段作為模板，通過(guò)PCR制備所述探針。當(dāng)使用長(zhǎng)度約300bp的DNA片段作為探針時(shí)，雜交洗滌條件由例如50℃、2×SSC和0.1％SDS組成。
在如上所述條件下可雜交的基因包括在所述基因中含有終止密碼子的基因和由于活性中心突變而沒有活性的基因。然而，通過(guò)將每個(gè)基因與市售活性表達(dá)載體連接并采用Mori，M.& Shiio，I.，Agric.Biol.Chem.，51，129-138頁(yè)(1987)中描述的方法檢測(cè)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，可以容易區(qū)別上述基因。
編碼與果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶大體上相同的蛋白質(zhì)的DNA的具體實(shí)例包括編碼與SEQ ID NO14所示的氨基酸序列的同源性優(yōu)選為55％或更高，更優(yōu)選為60％或更高，更優(yōu)選為80％或更高并具有果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
例如應(yīng)用Saito和Mirua的方法(參閱H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；Text for Bioengineering Experiments，Society for Bioscience and Bioengineering(日本)主編，第97-98頁(yè)，Baifukan，1992)等可以從DNA供體細(xì)菌制備染色體DNA。
如果通過(guò)PCR方法擴(kuò)增的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因與能在大腸桿菌和/或棒狀桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA連接制得重組DNA，并將重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌中，則后繼步驟就變得容易了。作為所述載體能在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制，優(yōu)選質(zhì)粒載體，尤其是可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的載體，所述載體的實(shí)例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等。
能在棒狀桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體實(shí)例包括pAM330(參閱日本專利公開號(hào)58-67699)、pHM1519(參閱日本專利公開號(hào)58-77895)等。而且，如果從這些載體中取出能夠產(chǎn)生在棒狀桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的DNA片段，然后將其插入到上述的大腸桿菌載體中，則它們可以用作在大腸桿菌和棒狀桿菌中均可自主復(fù)制的所謂的穿梭載體。這種穿梭載體的實(shí)例包括下面列舉的穿梭載體。還分別指出了包含各種載體的微生物，以及在圓括號(hào)中列出了它們?cè)趪?guó)際保藏中心的保藏號(hào)。pAJ655 大腸桿菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒狀桿菌SR8201(ATCC 39135)pAJ1844 大腸桿菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒狀桿菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611 大腸桿菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148 谷氨酸棒狀桿菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440 枯草芽孢桿菌AJ11901(FERM BP-140)pHC4 大腸桿菌AJ12617(FERM BP-3532)為了通過(guò)將編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因和可以在棒狀桿菌細(xì)胞中起作用的載體連接制備重組DNA，用對(duì)應(yīng)于編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因末端的限制酶消化所述載體。通常采用連接酶例如T4DAN連接酶進(jìn)行連接。
為了將如上所述制備的重組DNA導(dǎo)入到微生物中，可以應(yīng)用任何迄今報(bào)道的已知轉(zhuǎn)化方法。例如，可以應(yīng)用氯化鈣處理接受細(xì)胞以提高對(duì)DNA通透性的方法，已經(jīng)有關(guān)于大腸桿菌K-12的報(bào)道(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))；以及用生長(zhǎng)期細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞然后導(dǎo)入所述DNA的方法，已經(jīng)有關(guān)于枯草芽孢桿菌的報(bào)道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.，Gene，1，153(1977))。除此之外，也可以應(yīng)用如下方法使DNA接受細(xì)胞成為容易攝入重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，然后將所述重組DNA導(dǎo)入所述細(xì)胞，已知該方法適用于枯草桿菌、放線菌和酵母(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。在本發(fā)明列舉的實(shí)施例中使用的轉(zhuǎn)化方法是電脈沖法(參閱日本專利公開號(hào)2-207791)。
也可以通過(guò)在宿主染色體DNA中導(dǎo)入多個(gè)拷貝編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，從而增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。為了在屬于棒狀桿菌的微生物染色體DNA中導(dǎo)入多個(gè)拷貝編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，采用在所述染色體DNA中存在多拷貝的序列作為靶序列進(jìn)行同源重組。關(guān)于在所述染色體DNA中存在多拷貝的序列，可以使用存在于轉(zhuǎn)座因子末端的重復(fù)DNA或反向重復(fù)序列。此外，如日本專利公開號(hào)2-109985所公開內(nèi)容，也可以將編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)朕D(zhuǎn)座子，使其轉(zhuǎn)移從而將多拷貝所述基因?qū)肴旧wDNA中。按照任何一種上述方法，因?yàn)檗D(zhuǎn)化體菌株中的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因拷貝數(shù)增加而增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。
除了基于上述基因性增強(qiáng)之外，也可以用更強(qiáng)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列替換表達(dá)調(diào)節(jié)序列染色體DNA或質(zhì)粒上的表達(dá)序列例如果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因啟動(dòng)子(見日本專利公開號(hào)1-215280)。例如，已知lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體的PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子等是強(qiáng)啟動(dòng)子。取代這些啟動(dòng)子可增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，因此增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。
在本發(fā)明的棒狀桿菌中，除了果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)之外，也可以通過(guò)增強(qiáng)涉及另一種氨基酸生物合成途徑或糖酵解系統(tǒng)中的另一種酶的基因而增強(qiáng)所述酶的活性。例如，可以用于生產(chǎn)L-賴氨酸的基因?qū)嵗ň幋a天冬氨酸激酶α-亞基蛋白或β-亞基蛋白的基因(其中L-賴氨酸和L-蘇氨酸對(duì)所述天冬氨酸激酶α-亞基蛋白或β-亞基蛋白的協(xié)同反饋抑制作用被脫敏)(國(guó)際專利公開號(hào)WO94/25605)、得自棒狀桿菌的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(日本專利公開號(hào)60-87788)、得自棒狀桿菌的編碼野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的基因(日本專利公告號(hào)6-55149)等。
進(jìn)而可以用于生產(chǎn)L-谷氨酸的基因?qū)嵗ü劝彼崦摎涿富?GDH，日本專利公開號(hào)61-268185)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶(日本專利公開號(hào)62-166890和63-214189)、烏頭酸水合酶(日本專利公開號(hào)62-294086)、檸檬酸合酶、丙酮酸羧化酶(日本專利公開號(hào)60-87788和62-55089)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶(日本專利公開號(hào)63-102692)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶等。
此外，可以使從L-氨基酸生物合成途徑分支催化產(chǎn)生需要L-氨基酸以外的化合物的反應(yīng)的酶活性減弱或缺失。例如，從L-賴氨酸生物合成途徑分支催化生成L-賴氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶實(shí)例包括高絲氨酸脫氫酶(參閱WO95/23864)。另外，從L-谷氨酸生物合成途徑分支催化生成L-谷氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶實(shí)例包括α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、L-吡咯啉脫氫酶等。
而且，通過(guò)對(duì)具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌賦予對(duì)生物素作用抑制物質(zhì)(例如表面活性劑)的溫度敏感型突變，可以在包含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中在沒有生物素作用抑制物質(zhì)的情況下產(chǎn)生L-谷氨酸(參閱WO96/06180)。作為這種棒狀桿菌的實(shí)例，可以提到WO96/06180中公開的乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在國(guó)立生命科學(xué)和人體科學(xué)技術(shù)研究所(Naional Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan，postal code305-8566)，保藏號(hào)為FERM P-14501，然后在1995年8月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約條款將其轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERM BP-5189。
此外，通過(guò)對(duì)具有L-賴氨酸和L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌賦予對(duì)生物素作用抑制物質(zhì)例如表面活性劑的溫度敏感型突變，可以在包含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中在沒有生物素作用抑制物質(zhì)的情況下同時(shí)產(chǎn)生L-賴氨酸和L-谷氨酸(參閱WO96/06180)。作為這種棒狀桿菌的實(shí)例，可以提到WO96/06180中公開的乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ12933菌株。AJ12933菌株于1994年6月3日保藏在國(guó)立生命科學(xué)和人體科學(xué)技術(shù)研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of IndustrialScience and Technology，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan，postal code305-8566)，保藏號(hào)為FERM P-14348，然后在1995年8月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約條款將轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERM BP-5188。(3)生產(chǎn)L-氨基酸如果在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)和L-氨基酸生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌，則L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累。例如，如果在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)和L-賴氨酸生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌，則L-賴氨酸在培養(yǎng)基中積累。此外，如果在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)和L-谷氨酸生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌，則L-谷氨酸在培養(yǎng)基中積累。
而且，如果在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)和L-賴氨酸及L-谷氨酸生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌，則L-賴氨酸和L-谷氨酸在培養(yǎng)基中積累。當(dāng)L-賴氨酸和L-谷氨酸同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，L賴氨酸生產(chǎn)菌可以在谷氨酸生產(chǎn)條件下培養(yǎng)，或者混合培養(yǎng)具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌和具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌(日本專利公開號(hào)5-3793)。
用于采用本發(fā)明微生物生產(chǎn)L-氨基酸例如L-賴氨酸和L-谷氨酸的培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基，它包含碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子和其他需要的有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作為碳源，可使用烴類例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、赤糖糊和淀粉水解物；醇類例如乙醇和肌醇；或者有機(jī)酸例如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸。在本發(fā)明中，尤其優(yōu)選其中的果糖。通常在采用棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸時(shí)，如果培養(yǎng)基采用果糖作為碳源，L-氨基酸產(chǎn)量往往降低。然而，用于本發(fā)明的微生物在包含果糖作為碳源的培養(yǎng)基中高效生產(chǎn)L-氨基酸。在L-賴氨酸生產(chǎn)中這種作用尤其明顯。
作為氮源，可以使用無(wú)機(jī)銨鹽或有機(jī)銨鹽，例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨、氨，有機(jī)氮例如蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿和大豆水解物、氨氣、氨水等。
作為無(wú)機(jī)離子(或其來(lái)源)，加入少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。關(guān)于有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最好根據(jù)要求加入適量需要物質(zhì)例如維生素B1、酵母提取物等。
優(yōu)選在振搖、攪拌通氣等達(dá)到需氧條件下培養(yǎng)16-72小時(shí)。在培養(yǎng)過(guò)程中，控制培養(yǎng)基溫度為30℃-45℃，控制pH值為5-9。為調(diào)節(jié)這樣的pH值，可以使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸性物質(zhì)/堿性物質(zhì)、氨氣等。
可以采用與普通L-氨基酸生產(chǎn)方法相同的方法從發(fā)酵液中收集L-氨基酸。例如，通?？梢酝ㄟ^(guò)結(jié)合常規(guī)技術(shù)進(jìn)行L-賴氨酸收集，例如，利用離子交換樹脂的方法、結(jié)晶等。而且，也可以用常規(guī)方法收集L-谷氨酸，例如利用離子交換樹脂的方法、結(jié)晶等進(jìn)行。具體而言，L-谷氨酸可以吸附在陽(yáng)離子交換樹脂上，因此將其分離，或通過(guò)中和結(jié)晶。當(dāng)同時(shí)生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸并以混合物使用時(shí)，不必分開這兩種氨基酸。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式下面參考以下實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。實(shí)施例1構(gòu)建導(dǎo)入fruA基因的棒狀桿菌(1)克隆大腸桿菌JM109菌株fruA基因已經(jīng)闡明了大腸桿菌fruA基因的核苷酸序列(Genbank/EMBL/DDBJ編號(hào)M23196)。根據(jù)報(bào)道的核苷酸序列合成序列表中表示為SEQ ID NO1和2的引物，并利用大腸桿菌JM109菌株染色體DNA作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
在所合成的引物中，SEQ ID NO1核苷酸序列對(duì)應(yīng)于Genbank/EMBL/DDBJ編號(hào)M23196的fruA基因核苷酸序列中從第1到第24位核苷酸的序列，SEQ ID NO2核苷酸序列對(duì)應(yīng)于相同核苷酸序列第2000到第1977位核苷酸的序列。
通過(guò)常規(guī)方法制備大腸桿菌JM109菌株的染色體DNA(Text forBioengineering Experiments，Society for Bioscience andBioengineering(日本)主編，第97-98頁(yè)，Baifukan，1992)。PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件見“Forefront of PCR”第185頁(yè)(Takeo Sekiya等人編制，Kyoritsu Shuppan，1989)。
用常規(guī)方法純化產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，然后采用連接試劑盒(TakaraShuzo)將其與SmaI消化的質(zhì)粒pHC4連接，最后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)的感受態(tài)細(xì)胞。將所述細(xì)胞接種在包含30μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基(10g/L細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、5g/L細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物、5g/L NaCl、15g/L瓊脂、pH7.2)上，培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取形成的白色菌落，將其分離為單一菌落以獲得轉(zhuǎn)化體菌株。從獲得的轉(zhuǎn)化體菌株中提取質(zhì)粒，獲得包含與所述載體連接的fruA基因的質(zhì)粒pHC4fru。
含有pHC4的大腸桿菌(Escherichia coli)的私人編號(hào)為AJ12617，于1991年4月24日保藏在國(guó)立生命科學(xué)和人體科學(xué)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postalcode305-8566)，保藏號(hào)為FERM P-12215。然后，在1991年8月26日根據(jù)布達(dá)佩斯條約條款把它轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERMBP-3532。
然后，為了證明所克隆的DNA片段編碼的蛋白質(zhì)具有果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，通過(guò)Mori，M.& Shiio，I.，Agric.Biol.Chem.，51，129-138(1987)中描述的方法檢測(cè)JM109菌株以及含有pHC4fru的JM109菌株的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果證實(shí)，與不含有pHC4fru的JM109菌株相比，含有pHC4fru的JM109菌株的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性高出約11倍，因此證實(shí)表達(dá)了fruA基因。
(2)將pHC4fru導(dǎo)入棒狀桿菌L-谷氨酸生產(chǎn)菌株并生產(chǎn)L-谷氨酸用質(zhì)粒pHC4fru通過(guò)電脈沖法(參閱日本專利公開號(hào)2-207791)轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌AJ13029，以獲得轉(zhuǎn)化體菌株。采用所獲得的轉(zhuǎn)化體菌株AJ13029/pHC4fru如下培養(yǎng)生產(chǎn)L-谷氨酸。將在含有5μg/ml氯霉素的CM2B平皿培養(yǎng)基上培養(yǎng)之后獲得的AJ13029/pHC4fru菌株細(xì)胞接種到包含5μg/ml氯霉素的具有以下組分的L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，在31.5℃下振搖培養(yǎng)至培養(yǎng)基中的糖耗盡。將所獲得的培養(yǎng)物以5％的量接入到具有相同組合物的培養(yǎng)基中，并在37℃搖動(dòng)培養(yǎng)至培養(yǎng)基中的糖耗盡。作為對(duì)照，用能夠在棒狀桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的先前獲得的質(zhì)粒pHC4通過(guò)電脈沖法轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌AJ13029菌株，用與上述相同的方法培養(yǎng)。
將以下成分溶解(1L)，用KOH調(diào)節(jié)pH至8.0，在115℃滅菌15分鐘。果糖 150gKH2PO42gMgSO4·7H2O 1.5gFeSO4·7H2O 15mgMnSO4·4H2O 15mg大豆蛋白水解液 50mL生物素 2mg鹽酸硫胺素 3mg完成培養(yǎng)后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn)的BiotechAnalyer AS-210檢測(cè)培養(yǎng)液中積累的L-谷氨酸量。結(jié)果見表1。
表1


(3)將pHC4fru導(dǎo)入棒狀桿菌L-賴氨酸生產(chǎn)菌株并生產(chǎn)L-賴氨酸用質(zhì)粒pHC4fru通過(guò)電脈沖法(參閱日本專利公開號(hào)2-207791)轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌AJ11082菌株，以獲得轉(zhuǎn)化體菌株。采用所獲得的轉(zhuǎn)化體菌株AJ11082/pHC4fru如下培養(yǎng)生產(chǎn)L-賴氨酸。將在含有5μg/ml氯霉素的CM2B平皿培養(yǎng)基上培養(yǎng)之后獲得的AJ11082/pHC4fru菌株細(xì)胞接種到包含5μg/ml氯霉素的具有以下組成的L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，在31.5℃下振搖培養(yǎng)至培養(yǎng)基中的糖耗盡。作為對(duì)照，用能夠在棒狀桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的先前獲得的質(zhì)粒pHC4通過(guò)電脈沖法轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌AJ11082菌株，用與上述相同的方法培養(yǎng)。
1981年1月31，將乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)AJ11082保藏在國(guó)際保藏單位農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，1815 N.UniversityStreet，Peoria，Illinois 61604美國(guó))，保藏號(hào)為NRRL B-11470。
將以下成分溶解(1L)，用KOH調(diào)節(jié)pH至8.0，在115℃滅菌15分鐘，然后添加獨(dú)立于熱滅菌的碳酸鈣。果糖 100g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O 1g生物素 500μg硫胺 2000μgFeSO4·7H2O 0.01gMnSO4·4H2O 0.01g煙堿 5mg蛋白水解物(大豆乳) 30mL碳酸鈣 50g完成培養(yǎng)后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn)的BiotechAnalyer AS-210檢測(cè)培養(yǎng)液中積累的L-賴氨酸量。結(jié)果見表2。
表2


(4)將pHC4fru導(dǎo)入棒狀桿菌L-賴氨酸和L-谷氨酸生產(chǎn)菌株中并同時(shí)生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸用質(zhì)粒pHC4fru通過(guò)電脈沖法(參閱日本專利公開號(hào)2-207791)轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌AJ12993菌株，以獲得轉(zhuǎn)化體菌株。采用所獲得的轉(zhuǎn)化體菌株AJ12993/pHC4fru如下培養(yǎng)生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸。將在含有5μg/ml氯霉素的CM2B平皿培養(yǎng)基上培養(yǎng)之后獲得的AJ12993/pHC4fru菌株細(xì)胞接種到包含5μg/ml氯霉素的上述L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，在31.5℃下培養(yǎng)。從培養(yǎng)開始12小時(shí)后，培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換為34℃，進(jìn)一步繼續(xù)振搖培養(yǎng)直到培養(yǎng)基中的糖耗盡。作為對(duì)照，用能夠在棒狀桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的先前獲得的質(zhì)粒pHC4通過(guò)電脈沖法轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌AJ12993菌株，用與上述相同的方法培養(yǎng)。
完成培養(yǎng)后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn)的BiotechAnalyer AS-210檢測(cè)培養(yǎng)液中積累的L-賴氨酸和L-谷氨酸的量。結(jié)果見表3。
表3


實(shí)施例2分離乳發(fā)酵短桿菌fruA基因(1)獲得乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的fruA基因部分片段選擇在枯草桿菌、大腸桿菌、生殖道支原體和野油菜黃單胞菌的FruA氨基酸序列中具有高度同源性的區(qū)段，根據(jù)該區(qū)段氨基酸序列推導(dǎo)核苷酸序列，合成表示為SEQ ID NO3和4的寡核苷酸。另外采用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced Genetic Technologies公司)制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌株的染色體DNA。加入無(wú)菌水至0.5μg的染色體DNA、每種寡核苷酸20pmol、4μl dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各2.5mM)、5μl 10x ExTaq緩沖液(Takara Shuzo)和1U ExTaq(Takara Shuzo)中，制備總體積為50μl的PCR反應(yīng)混合物。對(duì)這種反應(yīng)混合物，使用Thermal Cycler TP 240(Takara Shuzo)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR，每個(gè)循環(huán)為98℃變性10秒、45℃退火30秒和72℃延伸90秒，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)混合物含有大約1.2kb的電泳帶。
采用Original TA Cloning Kit(Invitrogen)將所述反應(yīng)產(chǎn)物與pCR2.1(Invitrogen)連接。連接后，用所述連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)的感受態(tài)細(xì)胞，然后平板接種在包含10μg/mlIPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25μg/ml卡那霉素的L培養(yǎng)基(10g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨、5g/L細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物、5g/L NaCl、15g/L瓊脂，pH7.2)上，培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取形成的白色菌落，分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體菌株。
采用堿法(Text for Bioengineering Experiments，Society forBioscience and Bioengineering(日本)主編，第105頁(yè)，Baifukan，1992)由獲得的轉(zhuǎn)化體菌株制備質(zhì)粒，采用表示為SEQ ID NO5和6的寡核苷酸通過(guò)Sanger方法(J.Mol.Biol.，143，161(1980))測(cè)定插入片段兩端的核苷酸序列。具體而言，使用Big Dye Terminator Sequencing Kid(Applied Biosystems)進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，采用Genetic Analyzer ABI310(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。將所測(cè)定的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，并將它與從枯草桿菌、大腸桿菌、生殖道支原體和野油菜黃單胞菌的fruA基因推導(dǎo)的氨基酸序列比較。結(jié)果證實(shí)具有高度同源性，從而確定所克隆的片段是來(lái)自乳發(fā)酵短桿菌的fru4基因。
(2)測(cè)定乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869fruA基因的完整核苷酸序列上述(1)制備的包含于質(zhì)粒中的片段是frua基因的部分片段，因此還需要測(cè)定全長(zhǎng)fruA基因的核苷酸序列。盡管用于測(cè)定已知區(qū)段側(cè)翼的未知核苷酸序列的方法有反向PCR(Genetics，120，621-623(1998))、利用LA-PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)的方法等，然而在本實(shí)施例中采用LA-PCR體外克隆試劑盒測(cè)定未知序列。具體而言，基于上述(1)測(cè)定的核苷酸序列合成表示為SEQ ID NO7、8、9和10的寡核苷酸，按照LA-PCR體外克隆試劑盒的方法進(jìn)行測(cè)定。
對(duì)于fruA基因部分片段的3’未知區(qū)段，用HindIII處理乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，使其與所述試劑盒包含的HindIII接頭連接，然后第一PCR采用SEQ ID NO7和11寡核苷酸進(jìn)行，第二PCR采用SEQ ID NO8和12寡核苷酸進(jìn)行。當(dāng)對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，觀察到大約700 bp的電泳帶。采用Suprecver.2(Takara Shuzo)提純?cè)撾娪編?，采用SEQ ID NO8和12的寡核苷酸以與(1)描述的相同方法測(cè)定包含于700bp PCR產(chǎn)物中的fruA基因核苷酸序列。
對(duì)于fruA基因部分片段的5’未知區(qū)段，用BamHI處理乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，將其與所述試劑盒包含的Sau3AI接頭連接，然后第一PCR采用SEQ ID NO9和11的寡核苷酸進(jìn)行，第二PCR采用SEQ ID NO10和12寡核苷酸進(jìn)行。當(dāng)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，觀察到大約1500bp的電泳帶。采用Suprec ver.2(Takara Shuzo)提純?cè)撾娪編?，采用SEQ ID NO10和12寡核苷酸通過(guò)與(1)中描述的相同方法測(cè)定包含于該1500bp PCR產(chǎn)物中fruA基因核苷酸序列。
關(guān)于上述測(cè)定的核苷酸序列，包含fruA基因的大約3380bp的核苷酸序列在序列表中表示為SEQ ID NO13。通過(guò)翻譯從上述核苷酸序列推導(dǎo)的可讀框而獲得的氨基酸序列表示為SEQ ID NO14。也就是說(shuō)，序列表中SEQ ID NO14氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)是乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌株的FruA。另外，眾所周知，蛋白質(zhì)N-末端的蛋氨酸殘基作為起始密碼子啟始于ATG，因此它與蛋白質(zhì)正常功能無(wú)關(guān)，在許多情況下翻譯之后通過(guò)肽酶作用除去。前面提到的蛋白質(zhì)也可能除去該蛋氨酸殘基。
比較上述核苷酸序列和氨基酸序列與已知序列的同源性。所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)是GeneBank和SWISS-PROT。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，序列表中表示為SEQ ID NO13的DNA是棒狀桿菌屬細(xì)菌的新型基因，與已經(jīng)報(bào)道的fruA基因具有同源性。
作為編碼氨基酸，表示為SEQ ID NO13的DNA與枯草桿菌、大腸桿菌、生殖道支原體和野油菜黃單胞菌fruA的同源性分別為42.1％、51.0％、37.4％和45.5％。采用Genetyx-Mac計(jì)算機(jī)程序(SoftwareDevelopment，東京)分析所述核苷酸序列和氨基酸序列。按照Lipman和Peason的方法(Science，227，1435-1441，1985)進(jìn)行同源性分析。
工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明可以提高棒狀桿菌的L-氨基酸例如L-賴氨酸或L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。按照本發(fā)明還提供得自乳發(fā)酵短桿菌的新型果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。該基因可優(yōu)選培育適合生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀桿菌。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>生產(chǎn)L-氨基酸的方法和新型基因<130>B699MSOP1116<141>2000-12-22<150>JP 11-368096<151>1999-12-24<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于擴(kuò)增大腸桿菌fru基因的引物<400>1agctgttgca gccctggcgg taag 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于擴(kuò)增大腸桿菌fru基因的引物<400>2aacaataaaa aagggcagaa aata 24<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆fruA的引物1<220><221>misc feature<222>(18)<223>n＝a或g或c或t<400>3tgcccwaccg gyatygcnca caccttcatg gc 32<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆fruA的引物2<220><221>misc feature<222>(3，15)<223>n＝a或g或c或t<400>4gcngcgaasg gratngcrcc ytc 23<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于測(cè)序的引物M13-20<400>5gtaaaacgac ggccag 16<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于測(cè)序的引物M13RV<400>6caggaaacag ctatgac 17<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物F3-1<400>7gctaccctgc tgcgcaagaa gctgttcacc 30<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物F3-2<400>8agagcaagaa aacggcaagt cttcctggct gc 32<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物F5-1<400>9tcatcgcggc cttccgcgtt ttgcgtcagg 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物F5-2<400>10atccgcagcc atgaaggtgt gagcgatacc 30<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物C1<400>11gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca 35<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物C2<400>12cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga 35<210>13<211>3378<212>DNA<213>乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)<220><221>CDS<222>(881)..(2944)<400>13gtggtaaagg catcaatgtc gcccacgctg tcttgcttgc gggctttgaa accttggctg 60tgttcccagc cggcaagctc gaccccttcg tcccactggt ccgcgacatc ggcttgcccg 120tggaaactgt tgtgatcaac aacaacgtcc gcaccaacac cacagtcacc gaaccggacg 180gcaccaccac caagctcaac ggccccggcg caccgctcag cgagcagaag ctccgtagct 240tggaaaaggt gcttatcgac gcgctccgcc ccgaagtcac ctgggttgtc ttggcgggct 300cgctgccacc aggggcacca gttgactggt acgcgcgtct caccgcgttg atccattcag 360cacgccctga cgttcgcgtg gctgtcgata cctccgacaa gccactgatg gcgttgggcg 420agagcttgga tacacctggc gctgctccga acctgattaa gccaaatggt ctggaactgg 480gccagctggc taacactgat ggtgaagagc tggaggcgcg tgctgcgcaa ggcgattacg 540acgccatcat cgcagctgcg gacgtactgg ttaaccgtgg catcgaacag gtgcttgtca 600ccttgggtgc cgctggagcg gtgttggtca acgcagaagg tgcgtggact gctacttctc 660caaagattga tgttgtatcc accgttggag ctggagacag tgctcttgca ggttttgtta 720tcgcacgttc ccagaagaaa acactggagg aatctctgct gaatgccgtg tcttacggct 780cgactgcggc gtctcttcct ggcactacca ttcctcgtcc tgaccaactc gccacaactg 840gtgcaacggt cacccaagtc aaaggattga aagaatcagc atg aat agc gta att 895Met Asn Ser Val Ile1 5aat tcc tcg ctt gtc cgg ctg gat gtc gat ttc ggc gac tcc acc acg 943Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe Gly Asp Ser Thr Thr10 15 20gat gtc atc aac aac ctt gcc act gtt att ttc gac gct ggc cga gct 991Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe Asp Ala Gly Arg Ala25 30 35tcc tcc gcc gac gcc ctt gcc aaa gac gcg ctg gat cgt gaa gca aag 1039Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu Asp 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Ala150 155 160 165gtt gct gag agt ggg gcg gcg tcg aca agc gtt act cgt atc gtg gca 1423Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val Thr Arg Ile Val Ala170 175 180atc acc gca tgc cca acc ggt atc gca cac acc tac atg gct gcg gat 1471Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr Tyr Met Ala Ala Asp185 190 195tcc ctg acg caa aac gcg gaa ggc cgc gat gat gtg gaa ctc gtt gtg 1519Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp Val Glu Leu Val Val200 205 210gag act cag ggc tct tcc gct gtc acc cca gtt gat ccg aag atc atc 1567Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val Asp Pro Lys Ile Ile215 220 225gaa gct gcc gac gcc gtc atc ttc gcc acc gac gtg gga gtt aaa gac 1615Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp Val Gly Val Lys Asp230 235 240 245cgc gag cgt ttc gct ggc aag cca gtc att gaa tcc ggc gtc aag cgc 1663Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu Ser Gly Val Lys Arg250 255 260gcg atc aat gag cca gcc aag atg atc gac gag gcc atc gca gcc tcc 1711Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu Ala Ile Ala Ala Ser265 270 275aag aac cca aac gcc cgc aag gtt tcc ggt tcc ggt gtc gcg gca tct 1759Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser Gly Val Ala Ala Ser
280 285 290gct gaa acc acc ggc gag aag ctc ggc tgg ggc aag cgc atc cag cag 1807Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly Lys Arg Ile Gln Gln295 300 305gca gtc atg acc ggc gtg tcc tac atg gtt cca ttc gta gct gcc ggc 1855Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro Phe Val Ala Ala Gly310 315 320 325ggc ctc ctg ttg gct ctc ggc ttc gca ttc ggt gga tac gac atg gcg 1903Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly Gly Tyr Asp Met Ala330 335 340aac ggc tgg caa gca atc gcc acc cag ttc tcc ctg acc aac ctg cca 1951Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser Leu Thr Asn Leu Pro345 350 355ggc aac acc gtc gat gtt gac ggc gtg gcc atg acc ttc gag cgt tca 1999Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met Thr Phe Glu Arg Ser360 365 370ggc ttc ctg ctg tac ttc ggc gca gtc ctg ttc gct acc ggc caa gca 2047Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe Ala Thr Gly Gln Ala375 380 385gcc atg ggc ttc atc gtg gca gca ctg tct ggc tac acc gca tac gca 2095Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Thr Ala Tyr Ala390 395 400 405ctt gct gga cgc cct ggc atc gcg ccg ggc ttc gtc ggt ggc gcc atc 2143Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe Val Gly Gly Ala Ile410 415 420tcc gtc acc atc ggc gct ggc ttc att ggt ggt ctg gtt acc ggt atc 2191Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly Leu Val Thr Gly Ile425 430 435ttg gct ggt ctc att gcc ctg tgg att ggc tcc tgg aag gtg cca cgc 2239Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser Trp Lys Val Pro Arg440 445 450gtg gtg cag tca ctg atg cct gtg gtc atc atc ccg cta ctt acc tca 2287Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile Pro Leu Leu Thr Ser455 460 465gtg gtt gtt gga ctc gtc atg tac ctc ctg ctg ggt cgc cca ctc gca 2335Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Pro Leu Ala470 475 480 485tcc atc atg act ggt ttg cag gac tgg cta tcg tca atg tcc gga agc 2383Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser Ser Met Ser Gly Ser490 495 500tcc gcc atc ttg ctg ggt atc atc ttg ggc ctc atg atg tgt ttc gac 2431Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu Met Met Cys 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Ala Pro615 620 625cac ggc ggt atc ttc gtg gtc tgg gca atc gaa cca tgg tgg ggc tgg 2815His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu Pro Trp Trp Gly Trp630 635 640 645ctc atc gca ctt gca gca ggc acc atc gtg tcc acc atc gtt gtc atc 2863Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser Thr Ile Val Val Ile650 655 660gca ctg aag cag ttc tgg cca aac aag gcc gtc gct gca gaa gtc gcg 2911Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val Ala Ala Glu Val Ala665 670 675aag caa gaa gca gct gcg gcc gcc gta gcc gca taaccctgat gtctggtcgg 2964Lys Gln Glu Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala680 685acattgtttt tgcttccggt aacgtggcaa aacgaacaat gtctcactag actaaagtga 3024gatccacatt aaatcccctc cgttgggggt ttaactaaca aatcgctgcg ccctaatccg 3084ttcggatgaa cggcgtagca acacgaaagg acactttcca tggcttccaa gactgtaacc 3144gtcggttcct ccgttggcct gcacgcacgt ccagcatcca tcatcgctga agcggctgct 3204gagtacgacg acgaaatctt gctgaccctg gttggctccg atgatgacga agagaccgac 3264gcttcctctt ccctcatgat catggcgctg ggtgcagagc acggcaacga agtaaccgtc 3324acctccgaca acgctgaagc tgttgagaag atcgctgcgc ttatcgcaca ggac 3378<210>14<211>688<212>PRT<221>CDS<400>14Met Asn Ser Val Ile Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe1 5 10 15Gly Asp Ser Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe20 25 30Asp Ala Gly Arg Ala Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu35 40 45Asp Arg Glu Ala Lys Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile50 55 60Pro His Cys Arg Ser Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala65 70 75 80Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn85 90 95Leu Val Phe Leu Ile Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu100 105 110Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile115 120 125Lys Ala Leu Gln Glu Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val130 135 140Asp Ala Val Leu Asn Pro Ala Pro Lys Thr Thr Glu Pro Ala Ala Ala145 150 155 160Pro Ala Ala Thr Ala Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val165 170 175Thr Arg Ile Val Ala Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr180 185 190Tyr Met Ala Ala Asp Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp195 200 205Val Glu Leu Val Val Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val210 215 220Asp Pro Lys Ile Ile Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp225 230 235 240Val Gly Val Lys Asp Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu245 250 255Ser Gly Val Lys Arg Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu260 265 270Ala Ile Ala Ala Ser Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser275 280 285Gly Val Ala Ala Ser Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly290 295 300Lys Arg Ile Gln Gln Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro305 310 315 320Phe Val Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly325 330 335Gly Tyr Asp Met Ala Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser340 345 350Leu Thr Asn Leu Pro Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met355 360 365Thr Phe Glu Arg Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe370 375 380Ala Thr Gly Gln Ala Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly385 390 395 400Tyr Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe405 410 415Val Gly Gly Ala Ile Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly420 425 430Leu Val Thr Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser435 440 445Trp Lys Val Pro Arg Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile
450 455 460Pro Leu Leu Thr Ser Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu465 470 475 480Gly Arg Pro Leu Ala Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser485 490 495Ser Met Ser Gly Ser Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu500 505 510Met Met Cys Phe Asp Leu Gly Gly Pro Val Asn Lys Ala Ala Tyr Leu515 520 525Phe Gly Thr Ala Gly Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ser Met Glu Ile530 535 540Met Ala Ala Ile Met Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile Ala Leu Ser545 550 555 560Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu565 570 575Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly580 585 590Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met595 600 605Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val610 615 620Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu625 630 635 640Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser645 650 655Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val660 665 670Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Glu Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala675 680 685
權(quán)利要求
1.一種棒狀桿菌，該棒狀桿菌的細(xì)胞內(nèi)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)而且L-氨基酸生產(chǎn)能力提高。
2.權(quán)利要求
1的棒狀桿菌，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸。
3.權(quán)利要求
1的棒狀桿菌，其中所述果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性通過(guò)增加所述細(xì)菌細(xì)胞中的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因拷貝數(shù)得到增強(qiáng)。
4.權(quán)利要求
3的棒狀桿菌，其中所述果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因得自埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌。
5.權(quán)利要求
3的棒狀桿菌，其中所述果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因得自棒狀桿菌。
6.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，該方法包含以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求
1-5任一項(xiàng)的棒狀桿菌，從而在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累所述L-氨基酸，以及從培養(yǎng)物中收集所述L-氨基酸。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸。
8.權(quán)利要求
6或7的方法，其中所述培養(yǎng)基包含果糖作為碳源。
9.一種DNA，它編碼以下(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有存在一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒置的序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白質(zhì)，而且該蛋白質(zhì)具有果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。
10.權(quán)利要求
9的DNA，它是以下(a)或(b)定義的DNA(a)包含序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸號(hào)為881-2499的核苷酸序列的DNA，(b)在嚴(yán)格條件下與序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸號(hào)為881-2499的核苷酸序列或者與用所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA，而且該DNA編碼具有果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
專利摘要
將果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因?qū)肽軌虍a(chǎn)生L－氨基酸如L－賴氨酸或L－谷氨酸的棒狀桿菌中，從而增強(qiáng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，因此提高L－氨基酸生產(chǎn)能力。
文檔編號(hào)C12N15/54GKCN1434860SQ00819106
公開日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2000年12月22日
發(fā)明者杉本雅一, 中井勇太, 伊藤久生, 倉(cāng)橋修 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan