專利名稱:新蛋白質(zhì),其編碼基因及它們的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的新蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的基因和使用所述蛋白質(zhì)和基因的方法。更具體地，本發(fā)明涉及源自Lyophyllum shimeji，并具有至少抗茄屬絲核菌和Pyricularia oryzae的抗微生物活性的蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的基因，和使用所述蛋白質(zhì)和基因的方法。
本申請要求1999年9月21日提交的日本專利申請267238/1999(其全部內(nèi)容列入本文作為參考)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
已知如殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的裂解酶是具有抗植物致病性微生物的抗真菌或抗微生物活性的植物蛋白質(zhì)。體外實驗證實盡管這些類型的酶單獨使用時可以發(fā)揮作用(Schlumbaum等，(1986)，自然324，pp365-367，Broglie等，(1991)，科學(xué)254，pp1194-1197)，但如果聯(lián)合使用兩種或多種上述酶，一般會獲得增強的作用(Mauch等，(1988)，植物生理學(xué)，88，pp936-942；Sela-Buurlage等，(1993)，植物生理學(xué)，101，pp857-863)。如果用于抑制真菌生長，已知當單獨使用這些裂解酶時，需要其使用濃度約為幾十至幾百μg/ml，或者當聯(lián)合使用這些酶時，每種酶的濃度約為幾μg/ml。然而，就本發(fā)明人所知道的而言，至今尚未闡明這些裂解酶能夠?qū)?dǎo)致水稻作物大面積受損的Pyricularia oryzae發(fā)揮任何抗微生物作用。
以防衛(wèi)素為例的低分子量抗真菌肽(AFP)也具有抗微生物活性，據(jù)報道其中的Ca-AMP1(日本國內(nèi)公告號505048/96)和CB-1(Oita等，(1996)，Biosci.Biotech.Biochem，60，pp481-483)顯示出抗Pyricularia oryzae和茄屬絲核菌的抗微生物活性。而Rs-AFP1和Ar-AFP2(Terras等，1992，生物化學(xué)雜志，267，pp15301-15309)，以及Ace-AMP1(日本國內(nèi)公告號501424/97)顯示出抗Pyricularia oryzae的抗微生物活性。幾μg/ml這些低分子量肽能50％抑制包括上述微生物的植物致病性微生物的生長。
人們也嘗試分離裂解酶基因或低分子量抗微生物肽基因，并將這些基因轉(zhuǎn)移至植物，從而構(gòu)建能耐受疾病損傷的植物(Broglie等，(1991)，科學(xué)，254，pp1194-1197；Zhu等，(1994)，Bio/Technology12，pp807-812；Lin等，(1995)，Bio/Techmology13，pp686-691；Terras等，(1995)，植物細胞7，pp573-588)。然而，迄今為止幾乎無法得到任何被賦予實踐可接受水平的耐受性的植物。據(jù)認為一個原因是僅表達了低水平的轉(zhuǎn)移基因。然而，據(jù)認為更主要的原因是迄今為止所報道的抗微生物蛋白本身具有很低的抗微生物活性。因此，需要鑒定和利用抗微生物活性比現(xiàn)有技術(shù)中的更高的抗微生物蛋白。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是篩選和鑒定新的抗微生物蛋白，濃度甚至相對較低的該蛋白質(zhì)也能抑制多種植物致病性微生物的生長，所述微生物包括Pyriculariaoryzae和茄屬絲核菌，它們能導(dǎo)致影響水稻的兩種主要疾病。
本發(fā)明的另一方面是克隆編碼所述新蛋白質(zhì)的基因并測定其堿基序列。
本發(fā)明的另一方面是將本發(fā)明的基因?qū)胨拗魃?微生物，動物，植物等)以構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，從而使用本發(fā)明的基因。
本發(fā)明的另一方面是提供抗微生物劑，其含有本發(fā)明的抗微生物蛋白。
附圖簡述
圖1顯示了通過使用MonoQ柱分離的Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)圖與其抗微生物活性之間的關(guān)系。
圖2顯示了通過MonoQ柱分離的Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)的電泳模式與其抗微生物活性之間的關(guān)系。泳道上方給出的數(shù)字分別對應(yīng)于圖1中的級分編號，而M表示分子量標記。泳道下方給出的符號(-，+，++，+++)表示抗微生物活性的強度。箭頭表示抗微生物蛋白(70kDa和65kDa)。
發(fā)明詳述深入研究上述問題的結(jié)果，本發(fā)明人建立了體外測定抗Pyricularia oryzae和茄屬絲核菌的抗微生物活性的檢測系統(tǒng)。完成此項任務(wù)之后，他們從食用蘑菇Lyophyllum shimeji中提取蛋白質(zhì)。然后對提取出的蛋白質(zhì)聯(lián)合進行離子交換柱層析和高效液相層析(HPLC)，使用上述檢測系統(tǒng)檢查所得的每個級分。因此，發(fā)明人成功地鑒定，分離和純化出抗微生物蛋白。另外，還測定了所純化蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。然后，使用在這些氨基酸序列的基礎(chǔ)上合成的寡核苷酸作為引物進行RT-PCR，從而得到編碼該蛋白質(zhì)的部分長度的cDNA。隨后，使用該部分長度的cDNA為探針，篩選源自Lyophyllumshimeji的cDNA文庫。結(jié)果，分離出編碼上述蛋白質(zhì)的全長cDNA，并測定其完整的堿基序列。因此，本發(fā)明人成功地分離出源自Lyophyllum shimeji的新的抗微生物蛋白，并克隆出編碼該蛋白質(zhì)的DNA。另外，他們還測定了該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和DNA的堿基序列，從而完成了本發(fā)明。
因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了抗微生物蛋白，可通過硫酸銨沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji獲得含水提取物級分來獲得該蛋白質(zhì)，已證實該蛋白質(zhì)具有至少抗茄屬絲核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性，經(jīng)SDS-PAGE法測定，該蛋白質(zhì)前體型的分子量約為70kDa，成熟型的分子量約為65kDa。
通常，本發(fā)明的抗微生物蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。據(jù)推測，約為65kDa的成熟型蛋白質(zhì)由SEQ ID NO1的氨基酸殘基76至618組成，但本發(fā)明并不局限于此。
本發(fā)明的抗微生物蛋白不僅包括具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的抗微生物蛋白，也包括具有對SEQ ID NO2進行一個或多個氨基酸突變所得的氨基酸序列，或與SEQ ID NO2具有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且顯示出抗茄屬絲核菌或pyricularia oryzae的抗微生物活性的抗微生物蛋白。
優(yōu)選本發(fā)明的抗微生物蛋白與序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有60％或更高，優(yōu)選為70％或更高，優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供了抗微生物蛋白，其含有選自下列的單個多肽具有例如序列表中SEQ ID NO2中氨基酸殘基76至618的部分氨基酸序列的多肽；具有對SEQ ID NO2進行一個或多個氨基酸突變所得的氨基酸序列的多肽；或具有與SEQ ID NO2具有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且顯示出抗茄屬絲核菌或pyricularia oryzae的抗微生物活性的多肽；或這些多肽的組合。
關(guān)于上述根據(jù)本發(fā)明第二方面的抗微生物蛋白，與每個特定的氨基酸序列“具有50％或更高同源性的蛋白質(zhì)”的定義指的是只要至少具有50％同源性即是可接受的。然而，希望該蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列優(yōu)選具有60％或更高，優(yōu)選為70％或更高，優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括下列步驟回收通過硫酸銨沉淀法，用75％-飽和硫酸銨沉淀的Lyophyllum shimeji含水提取物級分；和對該級分進行離子交換層析并回收用0.05M至1M的NaCl洗脫的級分。
根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗微生物蛋白的基因。
通常，本發(fā)明的基因具有序列表中SEQ ID NO1的堿基序列，通過在此堿基序列中取代，缺失，插入和/或添加一個或多個堿基而得到的堿基序列，或能在嚴謹條件下與上述堿基序列雜交的堿基序列。
本發(fā)明的基因具有的堿基序列通常與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有50％或更高，優(yōu)選為60％或更高，優(yōu)選為70％或更高，優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
根據(jù)第五方面，本發(fā)明提供了通過以下方法產(chǎn)生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到編碼源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白的基因，所述方法包括從序列表中的SEQ ID NO1，即編碼抗微生物蛋白之基因的堿基序列中選擇滿足以下需求的兩個結(jié)構(gòu)域1)每個結(jié)構(gòu)域由15至30個堿基組成；和2)每個結(jié)構(gòu)域具有40至60％的G+C；制備單鏈DNA，該DNA具有與所述結(jié)構(gòu)域的堿基序列相同或互補的堿基序列，或者制備單鏈DNA混合物，該DNA混合物具有的遺傳密碼簡并性可以確保所述單鏈DNA所編碼的氨基酸殘基不會改變；并任選對所述單鏈DNA進行修飾，而避免損害與編碼所述抗微生物蛋白之基因的堿基序列結(jié)合的特異性。
優(yōu)選本發(fā)明的寡核苷酸具有序列表中SEQ ID NO7至12任一個的核苷酸序列。
根據(jù)第六方面，本發(fā)明提供了分離本發(fā)明基因的方法，其中所述方法包括使用Lyophyllum shimeji cDNA文庫為模板，一對上述兩個寡核苷酸為引物進行核酸擴增反應(yīng)，籍此擴增編碼本發(fā)明抗微生物蛋白的基因的一部分，并使用如此獲得的擴增產(chǎn)物為探針篩選cDNA文庫，從而分離全長cDNA克隆。
根據(jù)第七方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明基因的重組載體。
關(guān)于本發(fā)明的重組載體，優(yōu)選載體是表達載體。
根據(jù)第八方面，本發(fā)明提供了通過將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入宿主生物而得到的轉(zhuǎn)化體。
根據(jù)第九方面，本發(fā)明提供了抗微生物劑，其含有本發(fā)明的抗微生物蛋白作為活性成分。
以下將詳細描述優(yōu)選實施方案以闡明本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了源自Lyophyllum shimeji，具有抗植物致病性微生物之抗微生物活性的蛋白質(zhì)，本發(fā)明并不局限于該蛋白質(zhì)的來源，生產(chǎn)方法等，只要它具有本說明書中所述的特征即可。即本發(fā)明的抗微生物蛋白可以是天然蛋白質(zhì)，利用基因工程技術(shù)由重組DNA表達的蛋白質(zhì)，或化學(xué)合成的蛋白質(zhì)。
通常，本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有由序列表中SEQ ID NO2的618個氨基酸組成的氨基酸序列。然而，眾所周知天然蛋白質(zhì)常與具有一個或多個氨基酸突變的突變蛋白質(zhì)相伴，所述氨基酸突變是由以下因素引起的即產(chǎn)生蛋白質(zhì)的生物體品種差異，取決于生態(tài)型差異的基因突變或存在非常類似的同工酶所致的基因突變。本文所用術(shù)語“氨基酸突變”指的是取代，缺失，插入和/或添加例如一個或多個氨基酸。盡管本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有由克隆基因的堿基序列推定的，SEQ ID NO2的氨基酸序列，但它并不局限于具有此序列的蛋白質(zhì)。即本發(fā)明欲包括同源蛋白質(zhì)，只要它具有本說明書中所述的特征即可。同源性至少為50％或更高，優(yōu)選為60％或更高，優(yōu)選為70％或更高，優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高。
在本說明書中，通過使用例如Altschul等(核酸研究，25，pp.3389-3402，1997)所報道的BLAST程序比較序列數(shù)據(jù)，即可測定同源性百分比。該程序可得自國際互聯(lián)網(wǎng)上的國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)或日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)站點。該站點詳細描述了通過BLAST程序搜索同源性的多種條件(參數(shù))。盡管可對參數(shù)的構(gòu)成進行某種程度的改動，但通常通過使用缺省值進行搜索。
通常，通過用其它一個或多個具有類似特性的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基所得到的突變體具有類似于完整蛋白質(zhì)的特性，所述取代如用一個疏水氨基酸取代另一個疏水氨基酸，用一個親水氨基酸取代另一個親水氨基酸，用一個酸性氨基酸取代另一個酸性氨基酸，或用一個堿性氨基酸取代另一個堿性氨基酸。通過使用基因工程技術(shù)制備具有所需突變的重組蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，因此，這些突變蛋白質(zhì)也包含在本在SDS-PAGE法中，前體型本發(fā)明蛋白質(zhì)的分子量約為70kDa，相當于具有序列表中SEQ ID NO2第1至618位氨基酸序列的多肽，成熟型本發(fā)明蛋白質(zhì)的分子量約為65kDa，相當于具有序列表中SEQ ID NO2第76至618位氨基酸序列的多肽。通常，本發(fā)明的抗微生物蛋白具有序列表中SEQ IDNO2的氨基酸序列，但本發(fā)明并不局限于此。
因此，本發(fā)明提供了抗微生物蛋白，其含有選自下列的單個多肽具有序列表中SEQ ID NO2氨基酸序列第1至618位的部分氨基酸序列的多肽；和具有第76至618位氨基酸序列的多肽，或其組合。上述多肽包括具有以上說明書中所述突變的同源多肽。
通過使用硫酸銨沉淀法，離子交換柱層析等，可從Lyophyllum shimeji子實體中純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，這一點將在下文實施例中描述?；蛘撸ㄟ^使用能在宿主中擴增并能表達蛋白質(zhì)的表達載體，將本發(fā)明序列表中SEQ IDNO1的第8至1861位DNA序列，或第233至1861位DNA序列導(dǎo)入大腸桿菌，酵母，昆蟲或特定的動物細胞，也可以大量得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。
使用DDBJ的BLAST程序?qū)Ρ景l(fā)明源自Lyophyllum shimeji的蛋白質(zhì)進行同源性搜索，結(jié)果表明甚至在最高的情況下，全長氨基酸序列之間的同源性也僅為45％，未發(fā)現(xiàn)其它同源序列。根據(jù)這些事實可以得出結(jié)論該蛋白質(zhì)是一種新的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開了該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼它的DNA序列，結(jié)果，通過使用基因工程技術(shù)(雜交，核酸擴增，如PCR等)，利用這些序列或其部分，可以容易地從其它物種中分離出編碼具有類似生理學(xué)活性的蛋白質(zhì)的基因。在這種情況下，由這些基因編碼的新蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。對本發(fā)明的DNA序列進行同源性搜索的結(jié)果，只搜索到一個極短長度(32個堿基)的序列，其同源性為93％。
彩絨革蓋菌的吡喃糖氧化酶與本發(fā)明源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白顯示出最高的同源性(全長氨基酸序列之間的同源性為45％)。吡喃糖氧化酶是氧化吡喃糖(如葡萄糖)以形成2-酮產(chǎn)物和過氧化氫的酶。據(jù)報道，該酶可用于分析其它吡喃糖(參見日本專利公開號205861/96，列入本文作為參考)。 已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白實際上顯示出吡喃糖氧化酶活性，其比活非常高，而針對葡萄糖等的Km值較低。離子交換柱級分中抗微生物活性的強度可以由吡喃糖氧化酶活性的強度預(yù)測得到。因此，據(jù)估計本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的，源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白的抗微生物活性與吡喃糖氧化酶相關(guān)。關(guān)于本發(fā)明抗微生物活性的功能機制，一種理論是在氧化檢測培養(yǎng)基中所含葡萄糖的過程中，由該酶形成的過氧化氫對致病性微生物產(chǎn)生有害作用，但不必拘泥于該理論。
通過適當組合常用于純化和分離蛋白質(zhì)的方法即可純化和分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)，所述方法如硫酸銨沉淀，離子交換層析(MonoQ，A Sepharose，DEAE等)等。
如下文實施例所述，使Lyophyllum shimeji?；⒂镁彌_液提取。過濾提取物之后，在上清液中加入硫酸銨以給出適當?shù)臐舛?例如75％-飽和)，靜置混合物。由此得到含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的沉淀物。透析沉淀物，進行離子交換層析，用鹽濃度梯度(例如50mM至1M氯化鈉)洗脫，從而回收含有所需蛋白質(zhì)的級分。
本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的抗微生物蛋白的基因。基因類型不受限制。即它可以是天然來源的DNA，重組DNA，化學(xué)合成的DNA。基因可以是基因組cDNA或cDNA克隆。
通常，本發(fā)明的基因具有序列表中SEQ ID NO1的堿基序列。然而，SEQ ID NO1是在僅為本發(fā)明例子的下列實施例中所得克隆的堿基序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知天然基因伴隨有少量突變，所述突變是由產(chǎn)生該基因的生物品種差異，或生態(tài)型差異引起的，或者是由非常相似的同工酶的存在引起的。因此，本發(fā)明的基因并不局限于具有序列表中SEQ ID NO1的堿基序列的基因，可包括編碼本發(fā)明的抗微生物蛋白的任何基因。
本發(fā)明公開了該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼它的DNA序列，結(jié)果，通過使用基因工程技術(shù)(雜交，核酸擴增等)，利用這些序列或其部分，可以容易地從其它物種中分離出編碼具有類似生理學(xué)活性的蛋白質(zhì)的基因。在這種情況下，所得的基因也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可以在沒有任何限制的任意條件下進行同源基因的篩選。通常，優(yōu)選利用嚴謹條件(例如6×SSC，5×Denhardt’s，0.1％SDS，25℃至68℃)。優(yōu)選雜交溫度范圍為45℃至68℃(無甲酰胺)或25℃至50℃(50％甲酰胺)。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知可以通過適當?shù)卦O(shè)置雜交條件(甲酰胺濃度，鹽濃度，溫度等)克隆所含核苷酸序列具有某一水平或上述水平同源性的DNA。如此克隆的同源基因都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
核酸擴增反應(yīng)的例子包括利用溫度循環(huán)進行的反應(yīng)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Saiki等，1985，科學(xué)230，pp1350-1354)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(Woh等，1989，基因組學(xué)4，pp560-569；Baringer等，1990，基因89，pp117-122和Baranny等，1991，美國國家科學(xué)院院刊88，pp189-193)和基于轉(zhuǎn)錄的擴增(Kwoh等，1989，美國國家科學(xué)院院刊86，pp1173-1177)和等溫反應(yīng)，如鏈置換擴增(SDA)(Walker等，1992，美國國家科學(xué)院院刊89，pp392-396；和Walker等，1992，核酸研究，20，pp1691-1696)，自我-維持的序列復(fù)制(3SR)(Guatelli等，1990，美國國家科學(xué)院院刊87，pp1874-1878)和Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)(Lizardi等，1988，生物技術(shù)6，pp1197-1202)。另外，可以按歐洲專利0525882等所報道，在競爭性擴增靶核酸和突變序列的基礎(chǔ)上，使用基于核酸序列的擴增(NASBA)。優(yōu)選使用PCR法進行擴增。
通過使用上述雜交，核酸擴增等克隆的同源基因與序列表中SEQ IDNO1的堿基序列具有至少為50％，優(yōu)選為60％或更高，優(yōu)選為70％或更高，優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
本發(fā)明進一步提供了通過以下方法產(chǎn)生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到源自Lyophyllum shimeii的抗微生物蛋白，所述方法包括從序列表中的SEQ ID NO1，即編碼抗微生物蛋白之基因的堿基序列中選擇滿足以下需求的兩個結(jié)構(gòu)域1)每個結(jié)構(gòu)域由15至30個堿基組成；和2)每個結(jié)構(gòu)域具有40至60％G+C；制備單鏈DNA，該DNA具有與所述結(jié)構(gòu)域的堿基序列相同，或與之互補的堿基序列，或者制備單鏈DNA混合物，該DNA混合物具有遺傳密碼簡并性，以確保單鏈DNA所編碼的氨基酸殘基不會改變；任選對單鏈DNA進行修飾，而避免損害與編碼抗微生物蛋白之基因的堿基序列結(jié)合的特異性。本發(fā)明的寡核苷酸可用于雜交以檢測或分離本發(fā)明的基因。也可以在如PCR的擴增反應(yīng)中將這些寡核苷酸一個適當配對用作引物。
本發(fā)明的寡核苷酸可具有序列表中SEQ ID NO8至12任一個的核苷酸序列?？蓪⑦@些核苷酸序列設(shè)計成PCR引物以克隆編碼各個蛋白質(zhì)的基因片段。這些引物含有混合在一起的，所有編碼相應(yīng)氨基酸的潛在堿基。
通過使用Lyophyllum shimeji子實體cDNA文庫為模板，和上述寡核苷酸的適當組合，進行核酸擴增反應(yīng)(PCR等)來擴增和分離本發(fā)明基因的片段。使用所得擴增產(chǎn)物為探針，通過例如噬斑雜交進一步篩選cDNA文庫，即可分離全長cDNA克隆。核酸擴增反應(yīng)的方法和條件，噬斑雜交條件等是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
本發(fā)明進一步提供了含有本發(fā)明基因的重組載體。根據(jù)例如Sambrook，J等(分子克隆，實驗室手冊(第2版)，冷泉港實驗室，1.53(1989))所報道的方法，將本發(fā)明基因的DNA片段整合至諸如質(zhì)粒等載體中。更加方便的方法是使用商購連接試劑盒(例如Takara Shuzo有限公司的產(chǎn)品)。將所得重組載體(例如重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)移至宿主細胞(例如大腸桿菌TB1，LE392或XL-1Blue)。
據(jù)Sambrook，J等，分子克隆，實驗室手冊(第2版)，冷泉港實驗室，1.74(1989)的報道，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至宿主細胞的方法包括例如磷酸鈣法，氯化鈣/氯化銣法，電穿孔法，電注射法，用PEG等化合物進行處理，和使用基因鳥槍的方法。
通過將所需基因連接至本領(lǐng)域可得到的重組載體(例如質(zhì)粒DNA)中，可以方便地制備載體。本文可以使用的載體的具體例子包括源自大腸桿菌的質(zhì)粒，如pBluescript，pUC18，pUC19和pBR322，但本發(fā)明并不局限于此。
表達載體對產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)特別有用。對表達載體的類型沒有特別的限制，只要它具有以下功能即可，即能在多種原核和/或真核宿主細胞中表達所需基因，從而產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)。優(yōu)選載體的例子包括大腸桿菌表達載體，如pQE-30，pQE-60，pMAL-C2，pMAL-p2，pSE420等。關(guān)于酵母中的表達載體，優(yōu)選pYES2(糖酵母屬)和pPIC3.5K，pPIC9K和pAO815(畢赤氏酵母屬)。關(guān)于昆蟲中的表達載體，優(yōu)選pBacPAK8/9，pBK283，pVL1392，pBlueBac4.5等。
通過將所需表達載體轉(zhuǎn)移至宿主細胞可制備轉(zhuǎn)化體。對所用宿主細胞沒有特別的限制，只要它能與本發(fā)明的表達載體相容因而能被轉(zhuǎn)化即可。即可以利用本領(lǐng)域常用的多種細胞，包括天然細胞和人工建立的重組細胞。其例子包括(屬于埃希氏菌屬和芽胞桿菌屬的)細菌，(屬于糖酵母屬，畢赤氏酵母屬等的)酵母，動物細胞，昆蟲細胞和植物細胞。
至于宿主細胞，優(yōu)選使用大腸桿菌，酵母或昆蟲細胞。其具體例子包括大腸桿菌菌株(M15，JM109，BL21等)，酵母(INVSc1(糖酵母)，GS115和KM71(各為畢赤氏酵母)等)和昆蟲細胞(BmN4，蠶幼蟲等)。動物細胞的例子包括源自小鼠，非洲爪蟾，大鼠，倉鼠，猴，人的細胞，和由上述細胞建立的培養(yǎng)細胞系。對植物細胞沒有特別的限制，只要它能被培養(yǎng)即可，所述植物細胞包括源自例如煙草，擬南芥，水稻，玉米和小麥的細胞。
當使用細菌(特別是大腸桿菌)作為宿主細胞時，表達載體一般至少由啟動子/操縱子結(jié)構(gòu)域，起始密碼子，編碼所需抗微生物蛋白的基因，終止密碼子，終止子和可復(fù)制單位組成。
當使用酵母，植物細胞，動物細胞或昆蟲細胞作為宿主細胞時，一般優(yōu)選表達載體至少含有啟動子，起始密碼子，編碼所需抗微生物蛋白的基因，終止密碼子和終止子。還可任選其含有編碼信號肽的DNA，增強子序列，所需基因5’和3’側(cè)的非-翻譯結(jié)構(gòu)域，選擇標記結(jié)構(gòu)域，可復(fù)制單位等。
本發(fā)明載體中起始密碼子的適當例子是甲硫氨酸密碼子(ATG)。終止密碼子的例子包括常用的終止密碼子，如TAG，TGA和TAA。
本文所用術(shù)語“復(fù)制單位”指的是能在宿主細胞中復(fù)制其完整DNA序列的DNA。其例子包括天然質(zhì)粒，人工修飾的質(zhì)粒(即由天然質(zhì)粒制備的質(zhì)粒)和合成質(zhì)粒。質(zhì)粒的適當例子包括質(zhì)粒pQE30，pET，pCAL或其人工修飾質(zhì)粒(如用足夠的限制性酶處理pQE30，pET或pCAL得到的DNA片段)(對大腸桿菌而言)；質(zhì)粒pYES2和pPIC9K(對酵母而言)；和質(zhì)粒pBacPAK8/9等(對昆蟲細胞而言)。
關(guān)于增強子序列和終止序列，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的那些，例如源自SV40的序列。
關(guān)于選擇標記，可以利用本領(lǐng)域通過常規(guī)方法常用的選擇標記。其例子包括抗生素抗性基因(四環(huán)素，氨芐青霉素，卡那霉素，新霉素，潮霉素，壯觀霉素等)。
通過將至少上述啟動子，起始密碼子，編碼所需抗微生物蛋白的基因，終止密碼子和終止結(jié)構(gòu)域順序地和環(huán)形地連接至適當?shù)目蓮?fù)制單位即可制備表達載體。在此方法中，必要時也可以通過常規(guī)方法，如用限制性酶消化或使用T4DNA連接酶連接，來使用適當?shù)腄NA片段(例如接頭，其它限制性酶位點等)。
可使用公知方法將本發(fā)明的表達載體導(dǎo)入(即轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo)))至宿主細胞。
也就是說，可通過以下方法進行轉(zhuǎn)化，例如對細菌(大腸桿菌，枯草芽胞桿菌等)而言的Cohen等(美國國家科學(xué)院院刊，69，2110(1972))報道的方法，原生質(zhì)體法(Mol.Gen.Genet.，168，111(1979))或感受態(tài)法(分子生物學(xué)雜志，56，209(1971))；對釀酒酵母而言的Hinnens等(美國國家科學(xué)院院刊，75，1927(1978))報道的方法和鋰法(細菌學(xué)雜志，153，163(1988))；對植物細胞而言的葉片法(科學(xué)，227，129(1985))和電穿孔法(自然，319，791(1986))；對動物細胞而言的Graham(病毒學(xué)，52，456(1973))報道的方法；和對昆蟲細胞而言的Summers等(分子細胞生物學(xué)，3，pp2156-2165(1983))報道的方法。
通過使用本發(fā)明的DNA片段，轉(zhuǎn)化植物的載體可用于構(gòu)建對疾病具有耐受性的植物。對植物載體沒有特別的限制，只要它能表達相應(yīng)的基因并因而產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)即可。所述載體的例子包括pBI1221和pBI121(Clontech有限公司)和由它們衍生的載體。另外，尤其是為了轉(zhuǎn)化單子葉植物，可使用例如pIG121Hm，pTOK233(Hiei等，植物雜志，6，pp271-282(1994))，pSB424(Komari等，植物雜志，10，pp165-174(1996))。
通過用本發(fā)明的DNA片段取代上述載體中的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因位點以構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物所用的載體，然后將該載體轉(zhuǎn)移至植物，即可制備轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選轉(zhuǎn)化植物所用的載體至少含有啟動子，起始密碼子，所需基因(本發(fā)明的DNA序列或其部分)，終止密碼子和終止子。另外，所述載體還任選含有編碼信號肽的DNA，增強子序列，所需基因5’和3’側(cè)的非-翻譯結(jié)構(gòu)域，選擇標記結(jié)構(gòu)域等。
對啟動子和終止子沒有特別的限制，只要它能在植物細胞中發(fā)揮作用即可。能夠組成型表達的啟動子的例子包括已被整合至上述載體中的35S啟動子，以及肌動蛋白和遍在蛋白基因啟動子。然而，更優(yōu)選整合誘導(dǎo)型啟動子。通過使用誘導(dǎo)型啟動子，僅在轉(zhuǎn)基因植物與害蟲接觸之后才能產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)，因此植物獲得了耐受性?？捎糜诖四康牡恼T導(dǎo)型啟動子的例子包括苯丙氨酸脫氨酶，殼多糖酶，葡聚糖酶，硫堇和消炎痛控釋劑基因的啟動子，和其它可應(yīng)答害蟲或應(yīng)力的基因的啟動子。
通過使用下列方法將基因轉(zhuǎn)移至植物，所述方法包括農(nóng)桿菌的使用(Horsch等，科學(xué)，227，129(1985)；Hiei等，植物雜志，6，pp271-282(1994))，電穿孔法(Fromm等，自然，319，791(1986))，PEG法(Paszkowski等，EMBOJ.，3，2717(1984))，顯微注射法(Crossway等，Mol.Gen.Genet.，202，179(1989))，微量碰撞法(McCabe等，Bio/Technology，6，923(1988))等?？梢圆患酉拗频厥褂萌魏畏椒?，只要它能將基因轉(zhuǎn)移至所需植物即可。類似地，宿主植物并不局限于特定的物種，只要它能與本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物的載體相容，并能被其轉(zhuǎn)化即可。也即，可利用本領(lǐng)域常用的植物，例如雙子葉植物(例如煙草，擬南芥，番茄，黃瓜，胡蘿卜，大豆，馬鈴薯，甜菜，蘿卜，中國甘藍，油菜植物，棉花，矮牽牛屬植物等)和單子葉植物(例如水稻，玉米，小麥等)。
本發(fā)明的抗微生物蛋白表現(xiàn)出高度有效的抗微生物活性。例如，極低濃度(5ng/ml)的所述蛋白質(zhì)可以完全抑制Pyricularia oryzae孢子的萌發(fā)(見下文實施例2)。以此濃度長時間保溫之后，未觀察到孢子的萌發(fā)，這表明本發(fā)明的蛋白質(zhì)不是部分抑制Pyricularia oryzae的生長，而是對其表現(xiàn)出抗微生物活性。就發(fā)明人所知道的而言，迄今為止尚無人報道過在如此低的濃度(即納克水平)下能完全抑制致病性微生物生長的抗微生物蛋白。在下列實施例中，將能導(dǎo)致水稻的兩種主要疾病損傷的Pyricularia oryzae和茄屬絲核菌用于抗微生物試驗，以純化抗微生物蛋白。然而，水平差不多的，由本發(fā)明鑒定的Lyophyllum shimeji抗微生物蛋白很可能也對其它植物疾病發(fā)揮抗微生物作用。在如上所述的其潛在抗微生物作用的基礎(chǔ)上，可將源自Lyophyllum shimeji的，本發(fā)明的抗微生物蛋白用于含有處于活性狀態(tài)中的所述蛋白質(zhì)的制劑中，例如包括抗微生物劑和殺蟲劑的藥物中。如上所述，當使用編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列時，通過將DNA整合至能在大腸桿菌，酵母等中起作用的表達載體，即可大量產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中保溫含有按上述制備的表達載體的轉(zhuǎn)化體細胞，可以表達(產(chǎn)生)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。營養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選含有宿主細胞(轉(zhuǎn)化體)生長所需的碳源，無機氮源或有機氮源。碳源的例子包括葡萄糖，葡聚糖，可溶性淀粉，蔗糖，甲醇等。無機氮源或有機氮源的例子包括銨鹽，硝酸鹽，氨基酸，玉米漿，蛋白胨，酪蛋白，肉膏，豆餅，馬鈴薯提取物等。必要時，還可進一步含有其它營養(yǎng)成分，例如無機鹽(氯化鈉，氯化鉀，磷酸二氫鈉，氯化鎂等)，維生素和抗生素(四環(huán)素，新霉素，氨芐青霉素，卡那霉素等)。通過本領(lǐng)域已知的方法進行保溫?？蛇m當選擇保溫條件(例如溫度，培養(yǎng)基的pH，保溫時間)以大量產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如，在本發(fā)明的實施例4中，通過使用大腸桿菌(M15)作為宿主細胞來表達本發(fā)明的重組抗微生物蛋白。當在大腸桿菌中表達時，優(yōu)選在4℃至40℃下進行保溫，通過0.01mM至5.0mM IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達，但本發(fā)明并不局限于此。
可按下列方法從上述保溫培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的蛋白質(zhì)。當本發(fā)明的蛋白質(zhì)在宿主細胞中積累時，通過例如離心或過濾收集宿主細胞，然后懸浮于適當緩沖液(例如濃度約為100mM至10M的如tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液或MES緩沖液，其pH值范圍隨緩沖液的不同而變化，優(yōu)選pH范圍為5.0至9.0)。然后，通過適于所用宿主細胞的方法破碎細胞，離心得到宿主細胞的內(nèi)容物。另一方面，當本發(fā)明的蛋白質(zhì)從宿主細胞中被分泌出來時，通過例如離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細胞以得到培養(yǎng)物濾過物。任選對破碎細胞的懸浮液或培養(yǎng)物濾過物進行硫酸銨沉淀和透析，然后純化和分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
使用下列方法進行純化和分離。當用6×組氨酸，GST，麥芽糖-結(jié)合蛋白質(zhì)等標記所述蛋白質(zhì)時，可使用適于每個所用標記物的親和層析法。在下文所述的實施例4中，表達了N-末端被6×組氨酸標記的重組抗微生物蛋白，但本發(fā)明并不局限于此。通過使用Ni-NTA瓊脂糖(由Qiagen制備)純化該重組蛋白質(zhì)，所述瓊脂糖對6×組氨酸具有親和性。另一方面，當產(chǎn)生不具有任何標記的本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，可以使用下文實施例所述的離子交換層析法。也可以將這些方法與凝膠過濾，疏水層析，等電層析等聯(lián)合。
如上所述，本發(fā)明的抗微生物蛋白可以用于例如預(yù)防或治療由真菌或細菌導(dǎo)致的植物疾病。因此，本發(fā)明提供了抗微生物劑，其含有本發(fā)明的抗微生物蛋白作為活性成分。一般說來，本發(fā)明的抗微生物劑可用于整個植物或其部分。
使用劑量根據(jù)植物類型，生長期，條件，使用方法，治療時間，所用蛋白質(zhì)的類型(例如是全長蛋白質(zhì)還是通過取代，缺失，插入和/或添加其部分而衍生得到的蛋白質(zhì))，生長地的氣候，生長地的土壤等的不同而變化。一天可以使用一次或多次。使用劑量隨多個因素而變化。必要時，可以以混合溶液，懸浮液，乳液等的形式使用本發(fā)明的抗微生物劑。含水或不含水的溶液或懸浮液含有一種或多種活性物質(zhì)以及至少一種惰性稀釋劑。含水稀釋劑的例子包括蒸餾水和生理鹽水。不含水稀釋劑的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄欖油和醇類，如乙醇。
這些抗微生物組合物可進一步含有輔助劑，如防腐劑，濕潤劑，乳化劑，分散劑或穩(wěn)定劑(精氨酸，天冬氨酸等)。
通過例如流經(jīng)抑菌濾器過濾所述組合物，必要時加入殺菌劑或進行照射可使這些組合物滅菌。也可以通過例如冷凍干燥制備無菌的固體組合物，然后在使用前溶解于蒸餾水或其它溶劑中。
根據(jù)目的的不同，適當?shù)卮_定所得抗微生物劑的劑量形式。也即可以將其與上述添加劑混合，然后以片劑，丸劑，粉劑，顆粒劑，溶液，乳劑等的形式使用。
參照下列實施例，將更詳細地描述本發(fā)明。然而應(yīng)理解本發(fā)明并不局限于此。
實施例實施例1構(gòu)建檢測系統(tǒng)1)建立檢測系統(tǒng)保溫致病性真菌在燕麥粉培養(yǎng)基(Difco有限公司，添加有1％蔗糖)上保溫Pyricularia oryzae(TUS-1菌株，品種337，由農(nóng)林漁業(yè)部，Tohoku國立農(nóng)業(yè)實驗站提供)以產(chǎn)生分生孢子。加入10％甘油之后，將分生孢子懸浮液儲存于-80℃。
在1/2馬鈴薯-葡萄糖肉湯(PD肉湯，Difco有限公司)中將茄屬絲核菌(JT872菌株)保溫2天。使用Teflon勻漿器輕輕研磨3塊菌絲體(約5×5mm)與1/2PD培養(yǎng)基，將所得的分級分離的菌絲用作接種源。
將上述接種源分別加入96孔微滴板(Corning有限公司)。以約1000/孔的密度加入Pyricularia oryzae分生孢子，以約300/孔的密度加入經(jīng)分級分離的茄屬絲核菌菌絲以及100μl1/2 PD培養(yǎng)基。然后，在28℃恒溫箱中保溫這些接種源。通過用微滴板讀數(shù)儀(Benchmark，Bio-Rad有限公司)測定595nm的光吸收來監(jiān)測真菌的生長。
鹽和緩沖液的影響通過在培養(yǎng)基中加入確定量的NaCl，磷酸鹽緩沖液，Tris緩沖液，Hepes緩沖液，牛血清白蛋白，二硫蘇糖醇等，測定鹽和緩沖液對真菌生長的影響。
2)Lyophyllum shimeji中蛋白質(zhì)的提取預(yù)先用剪刀將10g Lyophyllum shimeji(由日本制備，得自Shiga ForestResearch Center)剪成小塊，使用液氮凍干，在研缽中研磨以得到小顆粒。然后用30ml 50mM Hepes緩沖液提取顆粒30分鐘。使提取物濾過Miracloth，然后以10,000×g離心20分鐘。在上清液中加入硫酸銨以達到75％飽和，于4℃靜置混合物過夜。再次以15,000×g離心20分鐘之后，將沉淀物溶解于3ml10mM Hepes緩沖液(pH7.5)，并使用透析管(Spectra/Porl MWCO6-8000，Spectrum Medical Industries有限公司)或苯甲?；肝龉?SIGMA有限公司)，對著10mM Hepes緩沖液(pH7.5)進行透析。離心除去不可溶的物質(zhì)之后，得到Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)樣品。通過Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白質(zhì)，測定Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)濃度。
實施例2純化抗微生物蛋白1)粗Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)樣品的抗微生物活性開始保溫Pyricularia oryzae和茄屬絲核菌之后，立即在保溫系統(tǒng)中加入確定量的粗Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)樣品。然后在2天內(nèi)，隨著時間的流逝監(jiān)測光吸收的變化，從而測定抗微生物活性的存在或缺乏。連續(xù)稀釋蛋白質(zhì)樣品，以測定與抗微生物活性有關(guān)的稀釋限度。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了針對Pyriculariaoryzae和茄屬絲核菌的較高抗微生物活性(表1)。
表1粗Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)提取物的抗微生物活性蘑菇 提取時的pH 完全抑制生長的濃度(μg/ml)P.oryzae 茄屬絲核菌L.shimeji 7.5 30 30據(jù)初步估計，完全抑制Pyricularia oryzae生長所需的Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)提取物的濃度為30μg或更少的總提取蛋白質(zhì)/ml。因此，Lyophyllumshimeji提取物顯然含有具有高抗細菌活性的物質(zhì)。關(guān)于該蛋白質(zhì)提取物抑制真菌生長的方式，在高濃度下觀察到對萌發(fā)的完全抑制，在低濃度下觀察到對菌絲生長的抑制。對菌絲延伸的抑制水平明顯取決于所用濃度。在Pyricularia oryzae細胞中，將細胞壁與細胞質(zhì)分開，從而顯示出質(zhì)壁分離-樣狀態(tài)。
2)通過離子交換柱層析進行純化接著，純化抗微生物蛋白。在液氮中研磨70g Lyophyllum shimeji，用200ml緩沖液(50mM MES，50mM NaCl，pH6.0)提取蛋白質(zhì)30分鐘。濾過雙重折疊的Miracloth之后，以15,000×g離心濾過物20分鐘以沉淀雜質(zhì)。流過濾紙進一步過濾上清液，得到蛋白質(zhì)樣品。將約200ml蛋白質(zhì)樣品倒入填充有離子交換劑Q-SepharoseFF(Pharmacia有限公司)的柱(內(nèi)徑為1.1cm，高度為20cm)中。將50mM Mes(pH6.0)，50mM NaCl用作基礎(chǔ)緩沖液，50mM Mes(pH6.0)，1M NaCl用作洗脫緩沖液，將流速控制為2.5ml/分鐘。上樣樣品之后，在100至120分鐘內(nèi)使NaCl梯度從50mM至1M。隨后，使洗脫緩沖液過柱40分鐘。使用梯度之后4次收集級分(100ml/級分)。連續(xù)稀釋這4個級分(I，II，III和IV)，進行抗Pyricularia oryzae的抗微生物試驗。結(jié)果，級分II至IV顯示出抗微生物活性。這些級分導(dǎo)致致病性真菌細胞的質(zhì)壁分離。用Centriprep(Amicon有限公司，MWCO10,000)濃縮顯示出最高活性的級分II(對應(yīng)于0至333mM NaCl)，倒入離子交換柱Mono QHR5/5(Pharmacia有限公司)，以部分純化該抗微生物蛋白。將50mM Mes(pH6.0)，50mM NaCl用作基礎(chǔ)緩沖液，50mM Mes(pH6.0)，1M NaCl用作洗脫緩沖液，將流速控制為1ml/分鐘。上樣樣品之后，在20至40分鐘內(nèi)使NaCl梯度從50mM至1M。每個級分取一部分(1ml)進行抗Pyriculaha oryzae的抗微生物試驗和SDS-PAGE電泳。圖1顯示了HPLC圖譜和抗微生物活性強度之間的關(guān)系。以4個等級顯示通過從每個MonoQ級分中收集5，1和0.2μl，并進行抗Pyriculariaoryzae的抗微生物試驗所測定的抗微生物活性，即+++(0.2μl時抑制)，++(1μl時抑制)，+(5μl時抑制)和-(甚至在5μl時也不抑制)。當根據(jù)A280和抗Pyricularia oryzae的抗微生物活性強度監(jiān)測蛋白質(zhì)時，在pH6.0，離子強度(NaCl濃度)為250mM左右出現(xiàn)抗微生物蛋白的洗脫峰。隨后，隨著離子強度的增加，每個單位洗脫物中蛋白質(zhì)的抗微生物活性逐漸降低。
接著，加入各級分的10μl等分試樣和等量2×SDS電泳緩沖液(Sambrook等，1989)。95℃處理5分鐘之后，根據(jù)Laemmli(1970)的方法進行SDS-PAGE電泳。至于凝膠，可使用15％PAGEL(ATTO有限公司)，利用銀染II試劑盒Wako(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)檢測蛋白質(zhì)。為了粗略估計分子量和蛋白質(zhì)的量，以一條帶代表20ng的方式電泳分子量標記(LMW，由Pharmacia LKB有限公司制備，94kDa，67kDa，43kDa，30kDa，20.1kDa和14.4kDa，從大到小遞減)。圖2顯示了電泳模式和抗微生物活性強度之間的關(guān)系。泳道上方給出的數(shù)字分別對應(yīng)于圖1中的級分編號。按與圖1相同的方式顯示抗微生物活性的強度。深入的研究表明約70kDa和約65kDa的兩條帶被認為是與抗微生物活性相關(guān)的候選蛋白質(zhì)(圖2中的箭頭)。由于這兩條帶的濃度與抗微生物活性水平正相關(guān)，這強烈暗示這些帶本身就相當于抗微生物蛋白。在這些帶中，Q-Sepharose級分和MonoQ級分中的65kDa帶在蛋白質(zhì)帶密度和抗微生物活性之間有明顯的關(guān)聯(lián)。參照分子量標記(67kDa的白蛋白)，用光密度計估計抗微生物蛋白的量，由此將完全抑制Pyriculariaoryzae生長所必需的濃度計算為約5ng/ml。
3)測定抗微生物蛋白的N-末端氨基酸序列用Centrifut V-20(Kurabo Industries，Ltd)濃縮MonoQ級分號36至44，并進行SDS-PAG正電泳。清除Tris之后，在無甘氨酸的緩沖系統(tǒng)中將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore有限公司)，用考馬斯亮藍進行輕微的染色并脫色。接著，從膜上切下?lián)J為相當于抗微生物蛋白的70kDa和65kDa蛋白質(zhì)帶。通過Edman法，使用氣相蛋白質(zhì)測序儀(HPG1005A蛋白質(zhì)測序系統(tǒng))測定N-末端氨基酸序列。
結(jié)果，測出65kDa蛋白質(zhì)的下列30個氨基酸。
N’-NAEEGTAVPYVPGYHKKNEIEFQKDIDRFV-C’(SEQ ID NO3)另一方面，無法對70kDa蛋白質(zhì)測序，原因可能是該蛋白質(zhì)的N’-末端被封閉。因此，利用賴氨酰內(nèi)肽酶和V8蛋白酶部分消化70kDa蛋白質(zhì)，得到43kDa賴氨酰內(nèi)肽酶-消化產(chǎn)物和45kDa V8蛋白酶-消化產(chǎn)物。通過重新分析這些經(jīng)部分消化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，分別由這兩種蛋白質(zhì)測定出下列24個殘基和29個殘基。
N’-EFDESIRHTLVLRSLQDAYKDRQR-C’(SEQ ID NO4)和N’-AERLIGTSTKEFDESIRHTLVLRSLQDAY-C’(SEQ ID NO5)由于這些氨基酸序列大多互相重疊，因此測定出總共34個殘基的內(nèi)部氨基酸序列。
N’- AERLIGTSTKEFDESIRHTLVLRSLQDAYKDRQR -C’(SEQ IDNO6)在數(shù)據(jù)庫中搜索所測定的氨基酸序列。結(jié)果，65kDa蛋白質(zhì)的30個氨基酸和70kDa蛋白質(zhì)的34個氨基酸皆顯示出與彩絨革蓋菌吡喃糖氧化酶的同源性。因此，根據(jù)Nishimura等(1996)的方法測定每個MonoQ級分的吡喃糖氧化酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡喃糖氧化酶活性的強度與由抗微生物活性強度所預(yù)測的一致。因此，估計抗微生物活性可能源自該酶氧化培養(yǎng)基中的葡萄糖的過程中所形成的過氧化氫。接著，只濃縮同時含有65kDa和70kDa蛋白質(zhì)的級分(圖2第42-44號)，分析吡喃糖氧化酶的特性。結(jié)果揭示出這些級分顯示出很高的吡喃糖氧化酶活性以及對葡萄糖和1，5-脫水葡萄糖醇的低Km值(表2)。
表2L.shimeji抗微生物蛋白的吡喃糖氧化酶活性及其各種特性酶蛋白質(zhì) Km(mM) 比活葡萄糖 1，5-脫水葡萄糖醇 (U/mg)*L.shimeji 0.50 6.5 10.6*1U＝1μmol H2O2/分鐘，pH7.0，37℃通過SDS-PAGE銀染測定酶蛋白質(zhì)(65kDa+70kDa)的量。
另一方面，由源自70kDa蛋白質(zhì)的部分消化產(chǎn)物的氨基酸序列(34個殘基)合成下列3個引物70F1(5’-tgickdatiswytcrtcraaytc-3’(384))(SEQ ID NO10)；70F2(5’-tgickrtcyttrtaigcrtcytg-3’(64))(SEQ ID NO11)；和70F3(5’-ggigcraadatickytgickrtc-3’(96))(SEQ ID NO12)。
在上述引物中，r表示a或g；y表示c或t；h表示a，c或t；m表示a或c；k表示g或t；d表示a，g或t；s表示g或c；w表示a或t；和i表示肌苷。
2)由Lyophyllum shimeji子實體構(gòu)建cDNA文庫通過SDS酚法從Lyophyllum Shimeji子實體中提取總核酸，通過氯化鋰沉淀回收總RNA。然后通過使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia有限公司)由總RNA制備Lyophyllum shimeji mRNA。由約10g子實體得到20微克mRNA。將5微克mRNA用于ZAP cDNA合成試劑盒(Stratagene有限公司)以合成cDNA。通過使用凝膠過濾柱收集1至5kb cDNA級分，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene有限公司)，然后包裝至Gigapack III(Stratagene有限公司)。所有方法都根據(jù)試劑盒所附的廠商說明進行。經(jīng)計算，如此構(gòu)建的Lyophyllum shimeji cDNA文庫的滴度約為3,000,000pfu。
3)通過RT-PCR制備探針通過使用1)中合成的引物，利用2)中合成的cDNA為模板進行PCR，從而試著擴增Lyophyllum shimeji蛋白質(zhì)的部分長度cDNA，所述cDNA可用作篩選文庫所用的探針。所用反應(yīng)條件如下。50μl反應(yīng)混合物溶液含有100ng cDNA，5μl10×Eq taq緩沖液，4μl各種dNTP，10pmol/每種引物序列和1μlEx taq(Takara Shuzo有限公司)+ Taq START抗體(Clontech有限公司)。通過使用Program Temp控制系統(tǒng)PC-700(ASTEK有限公司)，進行由以下條件組成的PCR94℃，3分鐘1次，94℃，1分鐘，50℃，1分鐘和72℃，1分鐘35輪循環(huán)，然后72℃，6分鐘1次。結(jié)果，用引物組合65R1-70F1，65R1-70F2，65R2-70F1，65R2-70F2，65R2-70F3和65R3-70F1擴增了約0.4至0.5kb的產(chǎn)物。顯示出較高擴增效力的約0.4kb片段經(jīng)凝膠純化，將其克隆至載體pCRII(由Invitrogen制備)，從而測定堿基序列。在此堿基序列的基礎(chǔ)上推定的氨基酸序列含有與實施例2-3)中測定的氨基酸序列的一部分相同的序列，完整的序列顯示出與彩絨革蓋菌吡喃糖氧化酶中等程度的同源性。根據(jù)這些結(jié)果，可以證實純化的70kDa和65kDa抗微生物蛋白是由單個基因編碼的，通過RT-PCR得到的cDNA克隆是Lyophyllum shimeji抗微生物蛋白部分長度的cDNA。
4)篩選全長cDNA從所述載體上切下3)中得到的克隆，將其用作探針以篩選2)中構(gòu)建的Lyophyllum shimeji cDNA文庫。根據(jù)ZAP cDNA合成試劑盒(Stratagene有限公司)所附的廠商說明，將約15,000pfu噬菌體與宿主XL1-blue MRF’一起鋪于方形平皿(14×10cm)。然后使噬斑與尼龍濾膜Hybond-N+(Amersham有限公司)接觸，并根據(jù)隨膜所附的廠商說明用堿處理。因此，為了變性所述DNA并將其固定在膜上，可根據(jù)隨膜所附的廠商說明，在高度嚴緊的條件下進行雜交和洗滌。在首次篩選的過程中，從約120,000pfu噬菌體中得到20個陽性克隆。對這些克隆進行第二次篩選，然后進行第三次篩選，其目的也是純化噬斑。根據(jù)ZAP cDNA合成試劑盒(Stratagene有限公司)所附的廠商說明，對所有這20個克隆進行體內(nèi)切割。結(jié)果，收集了18個已整合至噬菌粒載體pBluescript SK的cDNA克隆。這些克隆的長度為1.7至2.1kb。用限制性酶進行分析，結(jié)果表明這些克隆可能源自彼此很相似的基因。
5)測定堿基序列關(guān)于上述18個cDNA克隆，測定5’-和3’-端堿基序列(各約為500bp)。利用分析軟件Genetyx版本9.0(Sofeware Development有限公司)分析所得堿基序列數(shù)據(jù)。結(jié)果，所有這些克隆都含有編碼實施例2-3)中測定的65kDa蛋白質(zhì)30個氨基酸的DNA序列，但克隆與克隆之間的polyA添加位點有所不同。利用ABI PRIMS熒光測序儀(1310型Genetic Analyzer，Perkin Elmer有限公司)，通過引物步移法測定最長cDNA克隆第13號(2.1kb)的全部堿基序列。結(jié)果，編碼Lyophyllum shimeji抗微生物蛋白的全長cDNA由2106個堿基對組成，并含有1854bp的開放閱讀框，該閱讀框編碼618個氨基酸(SEQ ID NO1和2)。根據(jù)該氨基酸序列，估計分子量約為68487，經(jīng)計算，等電點為6.12。在由純化的蛋白質(zhì)測定的氨基酸序列中，源自65kDa蛋白質(zhì)的30個氨基酸相當于SEQ ID NO2中的氨基酸殘基號76至105，源自70kDa蛋白質(zhì)的34個氨基酸相當于SEQ ID NO2中的氨基酸殘基號211至244。這些事實表明65kDa和70kDa蛋白質(zhì)由單個基因編碼。另外，據(jù)估計有7個位置是糖鏈結(jié)合位點(SEQ ID NO2中的氨基酸殘基號154，319，360，412，558，573和583)。
根據(jù)這些結(jié)果，可得出下列結(jié)論克隆的cDNA源自編碼Lyophyllumshimeji抗微生物蛋白的基因。在數(shù)據(jù)庫(DDBJ)中搜索(BLAST)本發(fā)明源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白氨基酸序列的同源性。結(jié)果，完整的序列顯示出與彩絨革蓋菌吡喃糖氧化酶氨基酸序列45％的同源性。由于沒有其它同源序列，推測該基因編碼新的吡喃糖氧化酶-樣蛋白質(zhì)。
實施例4在大腸桿菌中表達并純化重組蛋白質(zhì)1)構(gòu)建表達載體實施例3-5)分離的cDNA克隆第13號攜有位于終止密碼子下游約0.06kb處的唯一一個EcoT22I限制性位點，和位于終止密碼子上游約0.25kb處的唯一的BamHI限制性位點。BamHI也位于該cDNA的5’-端載體的多克隆位點內(nèi)。首先，用限制性酶EcoT22I(Takara Shuzo有限公司)完全消化整合有該cDNA的質(zhì)粒(載體pBluescript)，然后，用BamHI(由Takara制備)部分消化。將如此形成的約2kb BamHI(載體上的BamHI)-EcoT22I片段整合至已被限制性酶BamHI和PstI雙消化的大腸桿菌表達載體pQE30(Qiagen有限公司)(即pQEHSPOfull)。如此形成的構(gòu)建體含有本發(fā)明編碼Lyophyllum shimeji吡喃糖氧化酶-樣蛋白質(zhì)的全長cDNA的最長開放閱讀框(ORF)(含有SEQ ID NO1堿基序列8至1864位，其編碼序列表中SEQ ID NO2的全長氨基酸序列)，6個組氨酸殘基作為標記物結(jié)合在所表達蛋白質(zhì)的N’-末端。
2)在大腸桿菌中表達使用大腸桿菌M15菌株作為宿主進行表達實驗。根據(jù)廠商說明(Qiagen)保溫菌株，并用IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。在含有抗生素氨芐青霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基中預(yù)保溫菌株直至OD600達到約0.5。隨后，在相同培養(yǎng)基中，以不同溫度和不同IPTG濃度保溫確定的一段時間以誘導(dǎo)表達。根據(jù)廠商說明(Qiagen)提取可溶性蛋白質(zhì)，根據(jù)Nishimura等(1996)的方法測定確定量的該蛋白質(zhì)的吡喃糖氧化酶活性。表3簡述了重組蛋白質(zhì)的表達結(jié)果。
表3在大腸桿菌中表達Lyophyllum shimeji吡喃糖氧化酶誘導(dǎo)條件 吡喃糖氧化酶活性構(gòu)建體 (mU/mL培養(yǎng)物)溫度(℃) IPTG(mM) 5小時后 21小時后pQEHSPOfull 37 2 0 025 0.5 2.5 116 0.1 15 34pQE30(對照) 25 0.5 0 016 0.1 0 0盡管首先在平常條件(37℃，IPTG濃度2mM)下誘導(dǎo)，在可溶性級分中并未檢測到吡喃糖氧化酶活性，但表達了大量不溶性的包含物。然后，在多個條件下誘導(dǎo)表達，測定可溶性級分中的吡喃糖氧化酶活性。結(jié)果，當誘導(dǎo)條件變得溫和，即降低培養(yǎng)物溫度和降低IPTG濃度時，吡喃糖氧化酶活性升高。這可能是由于當誘導(dǎo)條件變得溫和時，可溶性重組蛋白質(zhì)的含量有所增加的緣故。相反，從用作對照的pQE30(僅是載體)中未檢測到活性。這些結(jié)果清楚地表明克隆的cDNA一定編碼活性吡喃糖氧化酶-樣蛋白質(zhì)。當于25℃，IPTG濃度為0.5mM進行誘導(dǎo)時，與誘導(dǎo)開始后5小時相比，21小時之后觀察到活性的降低。這可能是因為表達的蛋白質(zhì)被分解的緣故。
接著，嘗試純化表達的蛋白質(zhì)。通過使用Ni-NTA Agarose(Qiagen有限公司)從可溶性蛋白質(zhì)級分中純化重組的吡喃糖氧化酶-樣蛋白質(zhì)，所述級分源自于16℃，IPTG濃度為0.1mM時誘導(dǎo)表達的細胞。根據(jù)廠商說明(Qiagen)吸附，洗滌和洗脫蛋白質(zhì)。結(jié)果，僅在洗脫的級分中發(fā)現(xiàn)吡喃糖氧化酶活性。由此揭示出重組蛋白質(zhì)的N’-末端在大腸桿菌中未被消化，組氨酸殘基仍與N’-末端結(jié)合；通過Ni-NTA Agarose，利用組氨酸殘基可容易地純化重組蛋白質(zhì)；克隆的全長cDNA的編碼結(jié)構(gòu)域編碼此類活性蛋白質(zhì)(即未除去相當于蛋白質(zhì)N-末端側(cè)的部分)。據(jù)估計，重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量為幾mg/l大腸桿菌培養(yǎng)物肉湯。
效果預(yù)期含有蛋白質(zhì)組分作為活性成分的制劑可用作潛在的抗細菌劑，所述蛋白質(zhì)組分的特征在于具有本發(fā)明序列表中SEQ ID NO2的序列，或從其全長序列中除去第1至75位所得的序列。另外，含有上述蛋白質(zhì)組分作為活性成分的試劑可用于測定糖(如血糖)的水平。預(yù)期通過以下方法可以構(gòu)建對疾病和害蟲具有耐受性的植物，所述方法包括將DNA序列整合至表達盒，所述DNA序列的特征在于序列表中SEQ ID NO1之DNA序列中第8至1864位或第233至1864位的序列，所述表達盒含有能在植物細胞中起作用的，組成型，器官/時間-特異性或應(yīng)力-誘導(dǎo)型或疾病/昆蟲-誘導(dǎo)型啟動子序列，和能在植物細胞中起作用的終止序列；將表達盒轉(zhuǎn)移至植物細胞，得到再生的個體。另外，通過使用能在選定宿主中擴增，并能表達蛋白質(zhì)的表達載體，將上述DNA序列轉(zhuǎn)移至大腸桿菌，酵母，昆蟲或某些動物細胞，即可大量得到蛋白質(zhì)。
序列表<110>JAPAN TOBACCO INC.and NORINSUISAN-SENTANGIJYUTU SANGYOUSHINKOUCENTOR<120>新蛋白質(zhì)，其編碼基因及它們的使用方法<130>PC/N(x)-61-17<160>12<210>1<211>2106<212>DNA<213>Lyophyllum shimeji<220><221>CDS<222>(8)...(1861)<400>1atcagcc atg tct ctc tca acc gag cag atg cta cgc gac tat cca cgg 49Met Ser Leu Ser Thr Glu Gln Met Leu Arg Asp Tyr Pro Arg1 5 10tct atg caa atc aac gga cag att cct aag aac gca att cac gaa aca 97Ser Met Gln Ile Asn Gly Gln Ile Pro Lys Asn Ala Ile His Glu Thr15 20 25 30tac gga aac gac gga gtt gat gta ttc att gca gga tct gga ccc att 145Tyr Gly Asn Asp Gly Val Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile35 40 45gga gcg acg tat gca aag ctc tgt gtt gaa gct ggt cta cgt gtt gtg 193Gly Ala Thr Tyr Ala Lys Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Arg Val Val50 55 60atg gtc gag atc gga gct gct gat agc ttc tac gct gtt aat gcc gaa 241Met Val Glu Ile Gly Ala Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Val Asn Ala Glu65 70 75gaa gga act gca gtt ccc tac gtt cct ggc tac cac aag aag aat gaa 289Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His Lys Lys Asn Glu80 85 90atc gag ttc cag aaa gat att gac cgc ttc gtc aat gta atc aag gga 337Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val Asn Val Ile Lys Gly95 100 105 110gcc tta caa caa gtc tct gtt cct gtc aga aac cag aac gtg cct aca 385Ala Leu Gln Gln Val Ser Val Pro Val Arg Asn Gln Asn Val Pro Thr115 120 125ctt gat ccc gga gcc tgg agc gcg ccc cct gga agt tca gcc ata tcg 433Leu Asp Pro Gly Ala Trp Ser Ala Pro Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser130 135 140aac ggt aaa aat cct cac cag cgg gaa ttc gag aac ttg tct gcg gag 481Asn Gly Lys Asn Pro His Gln Arg Glu Phe Glu Asn Leu Ser Ala Glu145 150 155gcc gta acg cgt gga gtc ggc ggc atg agt acc cac tgg acg tgc tcc 529Ala Val Thr Arg Gly Val Gly Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ser160 165 170acg cca cgg att cat cca ccc atg gaa agt ctc ccg ggc atc ggc cgt 577Thr Pro Arg Ile His Pro Pro Met Glu Ser Leu Pro Gly Ile Gly Arg175 180 185 190ccg aag ctc agt aac gac ccg gca gag gac gac aaa gag tgg aac gag 625Pro Lys Leu Ser Asn Asp Pro Ala Glu Asp Asp Lys Glu Trp Asn Glu195 200 205ctt tat tcc gag gcc gag cgt ctc atc ggg act tcc acc aag gaa ttc 673Leu Tyr Ser Glu Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe210 215 220gac gag tca att cgg cac acc ctt gtt ctg cgc tct ttg caa gac gcg 721Asp Glu Ser Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala225 230 235tac aag gat cgt caa cgt atc ttt cgc cct ctc ccg ttg gca tgc cac 769Tyr Lys Asp Arg Gln Arg Ile Phe Arg Pro Leu Pro Leu Ala Cys His240 245 250cgg ttg aag aac gcg ccg gaa tac gtc gaa tgg cac tca gca gaa aat 817Arg Leu Lys Asn Ala Pro Glu Tyr Val Glu Trp His Ser Ala Glu Asn255 260 265 270ctt ttc cac tct atc tac aac gat gac aag cag aag aag ctc ttt acc 865Leu Phe His Ser Ile Tyr Asn Asp Asp Lys Gln Lys Lys Leu Phe Thr275 280 285ctg ctg acg aac cat cgc tgc aca cga ctg gcg ctt acg ggc ggg tat 913Leu Leu Thr Asn His Arg Cys Thr Arg Leu Ala Leu Thr Gly Gly Tyr290 295 300gag aag aag att ggc gct gcc gag gtc agg aat cta ctg gcc acc agg 961Glu Lys Lys Ile Gly Ala Ala Glu Val Arg Asn Leu Leu Ala Thr Arg305 310 315aat cct agt tcg cag ctg gac agc tat atc atg gcg aag gta tat gta 1009Asn Pro Ser Ser Gln Leu Asp Ser Tyr Ile Met Ala Lys Val Tyr Val320 325 330ctg gcg tcg gga gcg atc ggc aac cca cag att ctc tat aac tcg ggc 1057Leu Ala Ser Gly Ala Ile Gly Asn Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Ser Gly335 340 345 350ttc tct ggg cta cag gtc acg cca cgc aat gac tcg ttg atc ccc aac 1105Phe Ser Gly Leu Gln Val Thr Pro Arg Asn Asp Ser Leu Ile Pro Asn
355 360 365ctg ggg agg tac atc acg gag cag ccg atg gca ttt tgc cag ata gtc 1153Leu Gly Arg Tyr Ile Thr Glu Gln Pro Met Ala Phe Cys Gln Ile Val370 375 380ttg agg cag gaa ttc gtc gac agc gtg cgc gac gat cct tat gga ctg 1201Leu Arg Gln Glu Phe Val Asp Ser Val Arg Asp Asp Pro Tyr Gly Leu385 390 395cca tgg tgg aaa gaa gcc gtt gct caa cat att gcc aag aac ccg aca 1249Pro Trp Trp Lys Glu Ala Val Ala Gln His Ile Ala Lys Asn Pro Thr400 405 410gat gca ctg ccc att ccg ttc cgc gat ccg gaa ccc cag gta aca acc 1297Asp Ala Leu Pro Ile Pro Phe Arg Asp Pro Glu Pro Gln Val Thr Thr415 420 425 430cca ttt aca gaa gaa cac ccc tgg cac acg cag att cac cgc gat gct 1345Pro Phe Thr Glu Glu His Pro Trp His Thr Gln Ile His Arg Asp Ala435 440 445ttt tcg tac ggt gcc gtc ggt cct gag gtg gac tct cgt gtc atc gtc 1393Phe Ser Tyr Gly Ala Val Gly Pro Glu Val Asp Ser Arg Val Ile Val450 455 460gac ctg cgc tgg ttt ggc gca acc gac cct gaa gca aac aac ctt ttg 1441Asp Leu Arg Trp Phe Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ala Asn Asn Leu Leu465 470 475gtt ttc cag aac gat gtt caa gac ggg tac agt atg ccg cag ccg acg 1489Val Phe Gln Asn Asp Val Gln Asp Gly Tyr Ser Met Pro Gln Pro Thr480 485 490ttc aga tat cga ccc agc act gcg tca aac gtg aga gca agg aaa atg 1537Phe Arg Tyr Arg Pro Ser Thr Ala Ser Asn Val Arg Ala Arg Lys Met495 500 505 510atg gcc gat atg tgc gaa gtg gcg agc aac ttg gga ggt tat ttg ccc 1585Met Ala Asp Met Cys Glu Val Ala Ser Asn Leu Gly Gly Tyr Leu Pro515 520 525acg tcc ccc ccg cag ttt atg gat cca ggc ctt gca ctt cat ctt gcg 1633Thr Ser Pro Pro Gln Phe Met Asp Pro Gly Leu Ala Leu His Leu Ala530 535 540ggg act act cgc att ggc ttc gac aag gca act aca gtg gct gat aac 1681Gly Thr Thr Arg Ile Gly Phe Asp Lys Ala Thr Thr Val Ala Asp Asn545 550 555aac tcg ctg gtc tgg gac ttt gcc aat ctt tat gtt gca ggc aat ggc 1729Asn Ser Leu Val Trp Asp Phe Ala Asn Leu Tyr Val Ala Gly Asn Gly560 565 570acc atc agg acg ggc ttc ggc gag aac ccg aca ctt acg tcg atg tgc 1777Thr Ile Arg Thr Gly Phe Gly Glu Asn Pro Thr Leu Thr Ser Met Cys575 580 585 590cac gct atc aag agc gcg agg agc atc atc aat aca ctc aag ggt ggg 1825His Ala Ile Lys Ser Ala Arg Ser Ile Ile Asn Thr Leu Lys Gly Gly595 600 605act gac gga aaa aat aca ggc gag cat cgc aac ctt tga ggaaggagca ac 1876Thr Asp Gly Lys Asn Thr Gly Glu His Arg Asn Leu610 615 618agcagtgtaa acaaacgcgt caagtggcta cttcaagttg aatgcattct ggtcccctac 1936catgttgatg tgtacgatag gcgttgaaag attttgtgta ttactgaacc tgtactttgt 1996ctgaatagtt atggcactat gattcatgtt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2056aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2106<210>2<211>618<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>2Met Ser Leu Ser Thr Glu Gln Met Leu Arg Asp Tyr Pro Arg Ser1 5 10 15Met Gln Ile Asn Gly Gln Ile Pro Lys Asn Ala Ile His Glu Thr20 25 30Tyr Gly Asn Asp Gly Val Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro35 40 45Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Lys Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Arg50 55 60Val Val Met Val Glu Ile Gly Ala Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Val65 70 75Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His80 85 90Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val95 100 105Asn Val Ile Lys Gly Ala Leu Gln Gln Val Ser Val Pro Val Arg110 115 120Asn Gln Asn Val Pro Thr Leu Asp Pro Gly Ala Trp Ser Ala Pro125 130 135Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser Asn Gly Lys Asn Pro His Gln Arg140 145 150Glu Phe Glu Asn Leu Ser Ala Glu Ala Val Thr Arg Gly Val Gly155 160 165Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ser Thr Pro Arg Ile His Pro170 175 180Pro Met Glu Ser Leu Pro Gly Ile Gly Arg Pro Lys Leu Ser Asn185 190 195Asp Pro Ala Glu Asp Asp Lys Glu Trp Asn Glu Leu Tyr Ser Glu
200 205 210Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser215 220 225Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr Lys230 235 240Asp Arg Gln Arg Ile Phe Arg Pro Leu Pro Leu Ala Cys His Arg245 250 255Leu Lys Asn Ala Pro Glu Tyr Val Glu Trp His Ser Ala Glu Asn260 265 270Leu Phe His Ser Ile Tyr Asn Asp Asp Lys Gln Lys Lys Leu Phe275 280 285Thr Leu Leu Thr Asn His Arg Cys Thr Arg Leu Ala Leu Thr Gly290 295 300Gly Tyr Glu Lys Lys Ile Gly Ala Ala Glu Val Arg Asn Leu Leu305 310 315Ala Thr Arg Asn Pro Ser Ser Gln Leu Asp Ser Tyr Ile Met Ala320 325 330Lys Val Tyr Val Leu Ala Ser Gly Ala Ile Gly Asn Pro Gln Ile335 340 345Leu Tyr Asn Ser Gly Phe Ser Gly Leu Gln Val Thr Pro Arg Asn350 355 360Asp Ser Leu Ile Pro Asn Leu Gly Arg Tyr Ile Thr Glu Gln Pro365 370 375Met Ala Phe Cys Gln Ile Val Leu Arg Gln Glu Phe Val Asp Ser380 385 390Val Arg Asp Asp Pro Tyr Gly Leu Pro Trp Trp Lys Glu Ala Val395 400 405Ala Gln His Ile Ala Lys Asn Pro Thr Asp Ala Leu Pro Ile Pro410 415 420Phe Arg Asp Pro Glu Pro Gln Val Thr Thr Pro Phe Thr Glu Glu425 430 435His Pro Trp His Thr Gln Ile His Arg Asp Ala Phe Ser Tyr Gly440 445 450Ala Val Gly Pro Glu Val Asp Ser Arg Val Ile Val Asp Leu Arg455 460 465Trp Phe Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ala Asn Asn Leu Leu Val Phe470 475 480Gln Asn Asp Val Gln Asp Gly Tyr Ser Met Pro Gln Pro Thr Phe485 490 495Arg Tyr Arg Pro Ser Thr Ala Ser Asn Val Arg Ala Arg Lys Met500 505 510Met Ala Asp Met Cys Glu Val Ala Ser Asn Leu Gly Gly Tyr Leu515 520 525Pro Thr Ser Pro Pro Gln Phe Met Asp Pro Gly Leu Ala Leu His530 535 540Leu Ala Gly Thr Thr Arg lle Gly Phe Asp Lys Ala Thr Thr Val545 550 555Ala Asp Asn Asn Ser Leu Val Trp Asp Phe Ala Asn Leu Tyr Val560 565 570Ala Gly Asn Gly Thr Ile Arg Thr Gly Phe Gly Glu Asn Pro Thr575 580 585Leu Thr Ser Met Cys His Ala Ile Lys Ser Ala Arg Ser Ile Ile590 595 600Ash Thr Leu Lys Gly Gly Thr Asp Gly Lys Asn Thr Gly Glu His605 610 615Arg Asn Leu618<210>3<211>30<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>3Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His1 5 10 15Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val20 25 30<210>4<211>24<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>4Glu Phe Asp Glu Ser Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu1 5 10 15Gln Asp Ala Tyr Lys Asp Arg Gln Arg20 24<210>5<211>29<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>5Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser1 5 10 15Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr20 25 29<210>6<211>34<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>6Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser1 5 10 15Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr Lys20 25 30Asp Arg Gln Arg34<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><222>9，12，15 and 18<223>i表示肌苷<400>7gargarggia cigcigticc 20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8garttycara argayathga ymg 23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>6，12和21<223>i表示肌苷<400>9ttygtiaayg tiathtgygg igc 23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>3和9<223>i表示肌苷<400>10tgickdatis wytcrtcraa ytc 23<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>3和15<223>i表示肌苷<400>11tgickrtcyt trtaigcrtc ytg 23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>3，12和18<223>i表示肌苷<400>12ggigcraada tickytgick rtc 23
權(quán)利要求
1.抗微生物蛋白，可通過硫酸銨沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji獲得含水提取物級分來獲得該蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有至少抗茄屬絲核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性，并在SDS-PAGE法中，顯示出分子量約為70kDa和/或約為65kDa的組分的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的抗微生物蛋白，其中N-末端具有序列表中SEQ IDNO3的N-末端氨基酸序列Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val ProGly Tyr His Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val。
3.抗微生物蛋白，其具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列，對SEQID NO2進行一個或多個氨基酸突變所得的氨基酸序列，或與所述序列具有50％或更高同源性，并且顯示出抗茄屬絲核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有60％或更高的同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有70％或更高的同源性。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有80％或更高的同源性。
7.根據(jù)權(quán)利要求
3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有90％或更高的同源性。
8.根據(jù)權(quán)利要求
3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有95％或更高的同源性。
9.抗微生物蛋白，其含有選自下列的單個多肽具有序列表中SEQ IDNO2的氨基酸序列中的氨基酸殘基76至618的部分氨基酸序列的多肽；具有對SEQ ID NO2進行一個或多個氨基酸突變所得的氨基酸序列的多肽；或具有與SEQ ID NO2有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且顯示出抗茄屬絲核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性的多肽；或這些多肽的組合。
10.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求
1，3或9的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括下列步驟回收通過硫酸銨沉淀法，用75％-飽和硫酸銨沉淀的Lyophyllum shimeji含水提取物級分；和對所述級分進行離子交換層析并回收用0.05M至1M的NaCl洗脫的級分。
11.編碼根據(jù)權(quán)利要求
1，3或9的抗微生物蛋白的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的基因，其具有序列表中SEQ ID NO1的堿基序列，通過在此堿基序列中取代，缺失，插入和/或添加一個或多個堿基而得到的堿基序列，或能在嚴謹條件下與上述堿基序列雜交的堿基序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11的基因，它與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有50％或更高的同源性。
14.根據(jù)權(quán)利要求
11的基因，它與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有60％或更高的同源性。
15.根據(jù)權(quán)利要求
11的基因，它與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有70％或更高的同源性。
16.根據(jù)權(quán)利要求
11的基因，它與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有80％或更高的同源性。
17.根據(jù)權(quán)利要求
11的基因，它與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有90％或更高的同源性。
18.根據(jù)權(quán)利要求
11的基因，它與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有95％或更高的同源性。
19.通過以下方法產(chǎn)生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到編碼源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白的基因，所述方法包括從序列表中的SEQ ID NO1，即編碼抗微生物蛋白之基因的堿基序列中選擇滿足以下需求的兩個結(jié)構(gòu)域1)每個結(jié)構(gòu)域由15至30個堿基組成；和2)每個結(jié)構(gòu)域具有40至60％的G+C；制備單鏈DNA，該DNA具有與所述結(jié)構(gòu)域的堿基序列相同或互補的堿基序列，或者制備單鏈DNA混合物，該DNA混合物具有的遺傳密碼簡并性可以確保所述單鏈DNA所編碼的氨基酸殘基不會改變；并任選對所述單鏈DNA進行修飾，而避免損害與編碼所述抗微生物蛋白之基因的堿基序列結(jié)合的特異性。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19的寡核苷酸，其具有序列表中SEQ ID NO7至12任一個的核苷酸序列。
21.分離根據(jù)權(quán)利要求
11的基因的方法，其中所述方法包括使用Lyophyllum shimeji子實體cDNA文庫為模板，一對根據(jù)權(quán)利要求
19的兩個寡核苷酸為引物進行核酸擴增反應(yīng)，籍此擴增編碼根據(jù)權(quán)利要求
1的抗微生物蛋白的基因的一部分，并使用如此獲得的擴增產(chǎn)物為探針篩選cDNA文庫，從而分離全長cDNA克隆。
22.含有根據(jù)權(quán)利要求
11的基因的重組載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求
22的重組載體，其中所述載體是表達載體。
24.通過將根據(jù)權(quán)利要求
22的重組載體導(dǎo)入宿主生物而得到的轉(zhuǎn)化體。
25.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求
1，3或9的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括在促進所述抗微生物蛋白表達的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求
24的轉(zhuǎn)化體。
26.通過根據(jù)權(quán)利要求
25的方法得到的重組抗微生物蛋白。
27.抗微生物劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求
1的抗微生物蛋白作為活性成分。
專利摘要
本發(fā)明的目的是篩選和鑒定新的抗微生物蛋白,濃度甚至相對較低的該蛋白質(zhì)也能抑制植物致病性微生物的生長,所述微生物如Pyricularia oryzae和茄屬絲核菌,它們能導(dǎo)致?lián)p害水稻作物的兩種主要疾病。本發(fā)明的另一目的是克隆該蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)本發(fā)明,提供了抗微生物蛋白,可通過硫酸銨沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji獲得含水提取物級分來獲得該蛋白質(zhì),其中所述蛋白質(zhì)具有至少抗茄屬絲核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性,其在SDS－PAGE法中,顯示出分子量約為70kDa和/或約為65kDa的組分的存在。本發(fā)明還提供了編碼該蛋白質(zhì)的基因和使用它們的方法。
文檔編號C12N15/31GKCN1335855SQ00802455
公開日2002年2月13日 申請日期2000年9月20日
發(fā)明者高倉由光, 桑田茂, 井上康宏 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社, 社團法人農(nóng)林水產(chǎn)先端技術(shù)產(chǎn)業(yè)振興中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan