專利名稱:一種利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹蛋白ace抑制肽的方法及其產(chǎn)品及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及功能食品和生物制藥的生產(chǎn)方法，具體涉及一種利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽的方法及其產(chǎn)品及應(yīng)用。
背景技術(shù):
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin-1converting enzyme,簡稱 ACE)是一種調(diào)節(jié)人體血壓的二肽羧基肽酶，ACE通過控制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensinsystem,簡稱RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system,簡稱KKS)調(diào)節(jié)人體血壓。ACE抑制肽是一種生物活性肽，具有無毒副作用和對正常血壓無影響的優(yōu)點，長期服用可以達(dá)到預(yù)防、控制和輔助治療高血壓之目的(Yu Z, Liu B, Zhao W，et al.Primaryand secondary structure of novel ACE-1nhibitory peptides from egg whiteprotein[J].Food Chemistry, 2012，133(2):315-322)。
蠶蛹是蠶繭繅絲中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，我國每年約產(chǎn)生50萬噸左右干蠶蛹。蠶蛹中的營養(yǎng)物質(zhì)十分豐富，干蠶蛹中粗蛋白的含量約為60% 71.9%，含有18種氨基酸，氨基酸組成合理。目前，蠶蛹主要被作為飼料開發(fā)利用，經(jīng)濟價值極低。蠶蛹蛋白中脯氨酸、芳香族氨基酸和疏水性氨基酸含量高，分別占到總氨基酸約和40%左右，根據(jù)ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系，這些氨基酸對ACE抑制肽的活性提高具有重要作用。因此，蠶蛹蛋白是理想的用于制備ACE抑制肽的蛋白資源。
以蠶蛹蛋白為原料，采用酶法制備ACE抑制肽已被報道，如專利“利用蠶蛹制取降血壓肽的方法(公開號:CN1896267A)”和專利“利用組合酶酶解蠶蛹蛋白制取降血壓肽的方法(公開號:CN101701240A)”。此外，我們課題組賈俊強等利用堿性蛋白酶水解蠶蛹蛋白制備ACE抑制肽，獲 得的ACE抑制肽粗提物的IC5tl值為0.102mg/mL (賈俊強，徐金玲，吳瓊英，等.酶解蠶蛹蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的工藝優(yōu)化[J].蠶業(yè)科學(xué)，2011，37 (5):872-877.) ；2012年李勇等利用大孔樹脂純化蠶蛹ACE抑制肽，研究發(fā)現(xiàn)利用75%乙醇能夠有效洗脫ACE抑制肽，并且發(fā)現(xiàn)疏水性與ACE抑制率呈正相關(guān)(李勇，黃先智，闞建全，等.大孔樹脂吸附分離蠶蛹ACE抑制肽的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33(16):281-288.)。由此可以看出，蠶蛹蛋白適合制備ACE抑制肽，具有潛在的開發(fā)前景。
目前，蠶蛹蛋白ACE抑制肽的制備方式幾乎都是采用間歇酶解法，酶解結(jié)束后再通過離心、超濾和柱層析等分離手段進行分離和純化，該方法存在諸多不足之處，如酶資源利用效率低、產(chǎn)物過渡降解、生產(chǎn)周期長、各批次產(chǎn)物質(zhì)量不穩(wěn)定和勞動強度大等。因此，這些問題限制了蠶蛹蛋白ACE抑制肽的工業(yè)化生產(chǎn)。酶膜反應(yīng)器能夠很好地解決這些不足，現(xiàn)已有一些關(guān)于使用酶膜反應(yīng)器制備ACE抑制肽的公開報導(dǎo)，如專利“利用酶-膜耦合技術(shù)制備紫菜降血壓肽的方法及其用途(公開號:CN1687444A)”、“連續(xù)酶膜反應(yīng)制備馬氏珠母貝降血壓肽的方法(公開號:CN101215594A)”和“連續(xù)酶解與超濾分離偶聯(lián)制備麥胚蛋白ACE抑制肽的方法(公開號:CN101514355A)”等。迄今為止，尚未有利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹ACE抑制肽的報道。

發(fā)明內(nèi)容
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發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽的方法及其產(chǎn)品及應(yīng)用。
技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽的方法，包括以下步驟:
I)將蠶蛹蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% 3.5%的懸浮液，在功率為100w-300w超聲浴中處理20-40min得到混合液；
2)用堿性溶液調(diào)節(jié)混合液的pH至8.0 9.5，加熱至40°C 55°C后加入到反應(yīng)罐中，在反應(yīng)罐中加入2500-4500U/g的堿性蛋白酶Alcalase，攪拌均勻后進行酶膜反應(yīng)，酶膜反應(yīng)的條件為PH8.0 9.5，溫度40°C 55°C ；
3)將酶膜反應(yīng)的產(chǎn) 物溶液透過超濾膜收集得到透過液、反應(yīng)不完全的底物和酶溶液，反應(yīng)不完全的底物和酶溶液被截留后重新流至反應(yīng)罐中；
4)與步驟3)同步進行測定透過液中蠶蛹蛋白ACE抑制肽的濃度，并在反應(yīng)罐中補充與透過液中蠶蛹蛋白ACE抑制肽相同濃度的蠶蛹蛋白溶液繼續(xù)進行酶膜反應(yīng)；
5)重復(fù)步驟3)、步驟4)直到蠶蛹蛋白溶液反應(yīng)完全；
6)收集步驟3)和步驟5)中得到的透過液調(diào)節(jié)pH至中性，然后真空濃縮至蠶蛹蛋白ACE抑制肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 20%，利用噴霧干燥進行干燥，噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在180°C 210°C和95°C 115°C，即得到粉末狀蠶蛹蛋白ACE抑制肽。
所述超濾膜的截留分子量3 IOkDa,超濾壓力0.5 1.0kg/cm2,出肽速率3 6mT ,/mi η η
所述的利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備的蠶蛹蛋白ACE抑制肽，所述蠶蛹ACE抑制肽的IC5tl值為 0.10 0.50mg/mL。
所述的利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備的蠶蛹蛋白ACE抑制肽在制備降血壓藥物和保健食品方面的應(yīng)用。
有益效果:相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
I)首次利用連續(xù)酶膜反應(yīng)技術(shù)制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽，實現(xiàn)了酶解產(chǎn)物在線及時分離，防止酶解產(chǎn)物因過度水解而活性降低或喪失。
2)實現(xiàn)了蛋白酶循環(huán)利用，提高了蛋白酶的利用率。
3)避免了傳統(tǒng)酶解工藝中需高溫滅酶的操作，實現(xiàn)了連續(xù)性制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽，提高了工作效率。
4)與其它原料相比，蠶蛹蛋白來源廣泛，且為農(nóng)副產(chǎn)品，價格低廉。
5)本發(fā)明所得到的蠶蛹蛋白ACE抑制肽的活性較高，其IC5tl為0.10-0.50mg/mL,而傳統(tǒng)的間歇式酶解反應(yīng)所得到的蠶蛹蛋白ACE抑制肽IC5tl為0.90-1.40mg/mL。

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圖1連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹ACE抑制肽的工藝流程。[0024]圖2本發(fā)明所用的酶膜反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖:1 一原料恒溫儲存罐；2 —蛋白酶恒溫儲存罐；3 —堿液恒溫儲存罐；4、5和6 —控制閥；7具體實施方式
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下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。
實施例1
將蠶蛹蛋白配制成底物濃度為0.5% (w/v)溶液，在200W超聲浴中處理30min后，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至8.0，加熱至40°C后加入到反應(yīng)罐中，在反應(yīng)罐中加入2500U/g的堿性蛋白酶(Alcalase)，攪拌均勻后在40°C下進行酶膜反應(yīng)，整個反應(yīng)過程中反應(yīng)液PH用NaOH溶液保持在8.0，超濾膜的截留分子量為3kDa，超濾壓力為0.5kg/cm2,出肽速率為6mL/min ;反應(yīng)過程中的截留液返回反應(yīng)罐，透過液進行收集，同時依據(jù)透過液中產(chǎn)物的濃度在反應(yīng)罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。透過液PH調(diào)至中性后，用真空濃縮裝置濃縮至肽含量10% (w/v)左右，利用噴霧干燥進行干燥，噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在180°C和95°C，即得到粉狀蠶蛹蛋白ACE抑制肽產(chǎn)品，用反相高效液相色譜分析其抑制 ACE 的 IC50 為 0.25mg/mL。
實施例2
將蠶蛹蛋白配制成底物濃度為2.0% (w/v)溶液，在200W超聲浴中處理30min后，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至9.0，加熱至50°C后加入到反應(yīng)罐中，在反應(yīng)罐中加入3500U/g的堿性蛋白酶(Alcalase)，攪拌均勻后在50°C下進行酶膜反應(yīng)，整個反應(yīng)過程中反應(yīng)液PH用NaOH溶液保持在9.0，超濾膜的截留分子量為5kDa，超濾壓力為0.7kg/cm2,出肽速率為3mL/min ;反應(yīng)過程中的截留液返回反應(yīng)罐，透過液進行收集，同時依據(jù)透過液中產(chǎn)物的濃度在反應(yīng)罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。透過液PH調(diào)至中性后，用真空濃縮裝置濃縮至肽含量10% (w/ v)左右，利用噴霧干燥進行干燥，噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在200°C和100°C，即得到粉狀蠶蛹蛋白ACE抑制肽產(chǎn)品，用反相高效液相色譜分析其抑制 ACE 的 IC50 為 0.10mg/mL。
實施例3
將蠶蛹蛋白配制成底物濃度為3.5%(w/v)溶液，在200W超聲浴中處理30min后，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至9.5，加熱至55°C后加入到反應(yīng)罐中，在反應(yīng)罐中加入4500U/g的堿性蛋白酶(Alcalase)，攪拌均勻后在55°C下進行酶膜反應(yīng)，整個反應(yīng)過程中反應(yīng)液pH用NaOH溶液保持在9.5，超濾膜的截留分子量為IOkDa,超濾壓力為1.0kg/cm2,出肽速率為4mL/min ;反應(yīng)過程中的截留液返回反應(yīng)罐，透過液進行收集，同時依據(jù)透過液中產(chǎn)物的濃度在反應(yīng)罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。透過液PH調(diào)至中性后，用真空濃縮裝置濃縮至肽含量10% (w/v)左右，利用噴霧干燥進行干燥，噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在210°C和115°C，即得到粉狀蠶蛹蛋白ACE抑制肽產(chǎn)品，用反相高效液相色譜分析其抑制 ACE 的 IC50 為 0.50mg/mL。
本發(fā)明中圖2的工作原理:
本發(fā)明圖2中的原料恒溫儲存罐I用來儲存蠶蛹蛋白溶液，堿性蛋白酶存儲在蛋白酶恒溫儲存罐2中，NaOH溶液存儲在堿液恒溫儲存罐3中，他們分別由控制閥4、控制閥5、控制閥6控制，pH檢測器7用來檢測整個反應(yīng)過程中的pH值，當(dāng)pH值不在pH8.0 9.5時，打開閥門6，用堿液恒溫儲存罐3中的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，在反應(yīng)過程中，攪拌器8用來攪拌反應(yīng)罐9中的反應(yīng)液，恒溫水浴鍋10用來控制反應(yīng)罐9的溫度，一輪反應(yīng)結(jié)束后，泵11將反應(yīng)液泵入超濾膜12中，透過液則由透過液儲存罐13存儲，截留液則重新返回反應(yīng)罐9中繼續(xù)進行下一輪反應(yīng)，反應(yīng)可以連續(xù)進行。
最終收集透過液儲存罐13中的透過液，將pH調(diào)節(jié)到中性，真空濃縮至肽含量為10% (w/v)左右，利用噴 霧干燥干燥得到粉狀蠶蛹蛋白ACE抑制肽產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將蠶蛹蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% 3.5%的懸浮液，在功率為100W-300W超聲浴中處理20-40min得到混合液； 2)用堿性溶液調(diào)節(jié)混合液的pH至8.0 9.5，加熱至40°C 55°C后加入到反應(yīng)罐中，在反應(yīng)罐中加入2500-4500U/g的堿性蛋白酶Alcalase，攪拌均勻后進行酶膜反應(yīng)，酶膜反應(yīng)的條件為ρΗ8.0 9.5，溫度40°C 55°C ； 3)將酶膜反應(yīng)的產(chǎn)物溶液透過超濾膜收集得到透過液、反應(yīng)不完全的底物和酶溶液，反應(yīng)不完全的底物和酶溶液被截留后重新流至反應(yīng)罐中； 4)與步驟3)同步進行測定透過液中蠶蛹蛋白ACE抑制肽的濃度，并在反應(yīng)罐中補充與透過液中蠶蛹蛋白ACE抑制肽相同濃度的蠶蛹蛋白溶液繼續(xù)進行酶膜反應(yīng)； 5)重復(fù)步驟3)、步驟4)直到蠶蛹蛋白溶液反應(yīng)完全； 6)收集步驟3)和步驟5)中得到的透過液調(diào)節(jié)pH至中性，然后真空濃縮至蠶蛹蛋白ACE抑制肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 20%，利用噴霧干燥進行干燥，噴霧干燥的進風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在180°C 210°C和95°C 115°C，即得到粉末狀蠶蛹蛋白ACE抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于:所述超濾膜的截留分子量3 IOkDa,超濾壓力0.5 1.0kg/cm2,出肽速率3 6mL/min0
3.權(quán)利要求
1-3任意一項所述的利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備的蠶蛹蛋白ACE抑制肽，其特征在于:所述蠶蛹ACE抑制肽的IC5tl值為0.10 0.50mg/mL。
4.權(quán)利要求
3所述的利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備的蠶蛹蛋白ACE抑制肽在制備降血壓藥物和保健食品方面的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種利用連續(xù)酶膜反應(yīng)制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽的方法，該方法以堿性蛋白酶為水解用酶，利用酶膜反應(yīng)器制備蠶蛹蛋白ACE抑制肽；其制備方法為將蠶蛹蛋白配制成溶液后，與堿性蛋白酶一起在反應(yīng)罐中進行反應(yīng)，然后利用超濾膜進行實時分離，截留液返回反應(yīng)罐中繼續(xù)反應(yīng)，透過液經(jīng)真空濃縮和噴霧干燥后得到粉末狀蠶蛹蛋白ACE抑制肽，其IC50為0.10-0.50mg/mL。本發(fā)明具有產(chǎn)品收率高、操作方便、生產(chǎn)成本低，適用于連續(xù)化生產(chǎn)，所得產(chǎn)品符合功能食品要求。
文檔編號A23L1/29GKCN103194515SQ201310113267
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月2日
發(fā)明者吳瓊英, 賈俊強, 顏輝, 桂仲爭, 徐金玲 申請人:江蘇科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan