專利名稱:高效降解高分子量多環(huán)芳烴的細菌分離方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及高分子量多環(huán)芳烴類污染土壤的生物修復(fù)。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環(huán)以稠環(huán)和非稠環(huán)形式相連接的有機化合物。PAHs在環(huán)境中普遍存在，其極低的水溶性、穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是造成這類化合物持久性的主要原因。人類及動物癌癥病變有70%-90%是環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)引起的，而PAHs則是環(huán)境致癌化學(xué)物質(zhì)中最大的一類。由于這類化合物具有致癌、致畸和致突變的特性，對人類健康和生態(tài)環(huán)境均具有潛在的危險而引起世界各國的普遍重視。
研究發(fā)現(xiàn)自然界中多種微生物能夠降解多環(huán)芳烴，但因高分子量的多環(huán)芳烴性質(zhì)穩(wěn)定，強疏水性物質(zhì)，易被土壤顆粒吸附或被其它作用固定，隔斷其與專性微生物和酶的直接接觸，從而影響其降解速率。天然的水體和土壤是微生物的大本營，存在著數(shù)量巨大的各種各樣微生物，在遭受有毒有害的有機物污染后，可出現(xiàn)一個天然的馴化選擇過程，使適合的微生物不斷增長繁殖、數(shù)量不斷增多。因此，微生物降解被認為是污染物在自然界中降解的主要途徑，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)進行環(huán)境污染治理和監(jiān)測是解決當(dāng)今社會環(huán)境污染問題的重要途徑。從受污染的地區(qū)土壤篩選分離出PAHs的降解優(yōu)勢菌株，再將其投回到污染環(huán)境，或者尋求適宜高效降解PAHs菌群生長的工藝條件，是進行修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
近年來對降解PAHs的微生物進行了廣泛的研究，常見的微生物有紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌(Mycobacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobac-terium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、拜葉林克氏菌屬(Beijernckia)、棒狀桿菌 屬(Corynebacterium)、藍細菌(Cyanobacteria)、微球菌屬(Micrococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、白腐真菌(White rot fungi)和弧菌屬(Vibrio)等。經(jīng)國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索系統(tǒng)檢索，在“一種多環(huán)芳烴降解菌劑的制備方法(公開號CN 101423807A)”中，利用新型菌株Mycobacterium sp. SN12,經(jīng)過7天，對花和菲的降解率分別為91. 5%和95. 2%。在“一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化細菌制備方法(公開號CN 101177679A)”中，42天后微球菌對芘和苯并芘的降解率分別為30. 7%和25. 7%，動膠桿菌對芘和苯并芘的降解率分別為31. 4%和21. 9%。在“一種可高效降解苯并[a]芘的不動桿菌及其應(yīng)用(公開號CN 102174445A)”中，經(jīng)過20天后在苯并[a]芘濃度40mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，37°C振蕩，菌株對苯并[a]芘的降解率達28. 66%，同樣條件下，加入適量蔗糖或葡萄糖，可提高該菌對苯并[a]芘的降解率達48. 87%。在“一種多環(huán)芳烴降解菌及其應(yīng)用(公開號CN 1844361A)”中，鞘氨醇單胞菌屬菌株GY2B對菲的降解速率在36h后為91. 7%-97. 8%。“一種產(chǎn)生生物乳化劑和降解多環(huán)芳烴的赤紅球菌Em及用途(公開號CN1519312)”中，該菌劑對蒽、菲、芘均有降解效果。綜上所述，在針對多環(huán)芳烴降解相關(guān)的已公開的專利信息中，大部分都是圍繞單一菌種對PAHs的降解效果，而且基本都是基于實驗室條件下液體培養(yǎng)基中的降解效果驗證，其中有一部分菌劑經(jīng)在污染土壤中的處理效果并不是很理想。
事實上，環(huán)境中通常以多種組分的污染物同時存在，呈現(xiàn)為復(fù)合污染現(xiàn)象。在實際場地修復(fù)中，單純通過投加通過實驗室優(yōu)化條件分離馴化的單體微生物，難以讓其在惡劣的污染環(huán)境中定植，并成為該污染環(huán)境中的主要菌群而發(fā)揮其高效降解效果。研究表明，混合菌群作為一種多菌體共存的生物群體，在其生長過程中能分解有機物，同時依靠各種微生物之間相互共生增殖及協(xié)同代謝作用降解環(huán)境中的有機物，并能激活其他具有凈化功能的微生物，從而形成復(fù)雜而穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。在“一種多環(huán)芳烴高效降解菌系及其應(yīng)用(公開號CN101196810)”中，7天后GP3混合菌系對芘的降解率為75. 7%_99. 5%。在“去除多環(huán)芳烴和/或降解多環(huán)芳烴的菌劑及其應(yīng)用”(公開號CN101851582 A)專利中，公布了紅球菌、微桿菌、蒼白桿菌和博德特氏菌組成的菌劑，4周后，添加該菌劑的土壤中16種多環(huán)芳烴的去除率比未添加該菌劑的土壤中的平均提高了 30%，其中6種低環(huán)(二 /三環(huán))多環(huán)芳烴的去除率提高了 26%，10種中高環(huán)(四環(huán)及以上)多環(huán)芳烴的去除率平均提高了 32%，說明復(fù)合菌在混合污染場地中的應(yīng)用前景。
綜上可以看出，在針對多環(huán)芳烴降解相關(guān)的已公開的現(xiàn)有技術(shù)中，大部分都是圍繞單一菌種對PAHs的降解效果，而且基本都是基于實驗室條件下液體培養(yǎng)基中的降解效果驗證，其中有一部分菌劑的降解效果是在低濃度多環(huán)芳烴污染土壤中進行的。針對高濃度污染土壤，特別是四環(huán)及以上多環(huán)芳烴高污染老化土壤的處理效果較好的菌劑相關(guān)技術(shù)，報道甚少。
本發(fā)明是通過PCR-DGGE技術(shù)，分析多環(huán)芳烴污染土壤中投加菌劑后，其微生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性的變化與污染物降解相關(guān)性，跟蹤添加菌劑在環(huán)境中的定植來確定菌劑的功效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種多環(huán)芳烴類污染場地中分離篩選高效降解細菌復(fù)合體的方法及其應(yīng)用，該方法是利用PCR-DGGE技術(shù)，迅速確定土壤樣品中污染物降解相關(guān)優(yōu)勢菌群及其分離純化，優(yōu)化組合，擴大培養(yǎng)，重新投放到長期污染的含有高濃度高分量多環(huán)芳烴污染土壤中，通過定期投加適量的不同配比的營養(yǎng)元素及其濕度的控制(40-60%)，持久保持高效降解菌群的優(yōu)勢。該方法降解效率高，特別是針對高分子量多環(huán)芳烴污染的土壤。
本發(fā)明同時提供了一種跟蹤高效降解菌在環(huán)境中的定植的技術(shù)。
本發(fā)明提供的一種多環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的分離、篩選方法包括如下步驟
I)培養(yǎng)基中加入PAHs的方法在滅菌三角瓶中加入不同濃度PAHs的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，加入下述細菌培養(yǎng)基I，使芘終濃度為終濃度為200mg/L,苯并花總濃度為10mg/L。
細菌培養(yǎng)基1:硫酸銨2. 5g，硫酸亞鐵O. 28mg，磷酸氫二鈉1. 5g，磷酸二氫鉀1.36g，硫酸鎂O. 25g，氯化鈣10. 7mg,氯化鈉O. 5g，氯化鐵O. 004g,1. OmL微量金屬液A、ImL維生素復(fù)合溶液，加水至IOOOmL并將pH控制在7. 2-7. 4，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用，若為固體培養(yǎng)基，則加入1. 5%瓊脂粉。其中微量金屬液A的組成為=CoCl2 · 6H2035mg, CuCl2
O.20mg，H3BO3 6. Omgj MnCl2 · 4H20 25mg，Na2MoO4 · 2H20 3. Omgj NiCl2 · 2H202.Omg, ZnCl22. 5mg,加水至IOOOmL ;維生素復(fù)合溶液的組成為維生素B61. Omg,維生素C1.5mg，加水至 IOOOmLo
2)在150ml三角瓶中加入50ml滅菌蒸餾水，加入IOg新鮮高濃度PAHs污染土壤，25-30°C,90rpm條件下培養(yǎng)5天后，取IOml分別接種至上述含多環(huán)芳烴的IOOml無機鹽培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)10天，測定污染物降解效果。
3)確定高效降解功能的目標(biāo)菌群通過PCR-DGGE方法，分析上述兩種污染物富集的樣品中優(yōu)勢囷群，以兩種污染物為唯一碳源S集培養(yǎng)液中都存在的囷株確定為目標(biāo)囷株。取1. 5ml細菌培養(yǎng)液提取總DNA，選取細菌16S rDNA V3區(qū)進行PCR擴增。制備Imm厚10% (w / v)聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為30%-70% (100%變性劑組成為7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)。加樣后，置于lXTAE緩沖液中45V電泳16h。電泳完畢，取下凝膠，EB上染色。DGGE凝膠經(jīng)EB染色后，在紫外燈下將凝膠中較亮的條帶用潔凈的刀片小心切下。將目的條帶置于30 μ I滅菌超純水中，-20°C放置過夜。PCR前65°C水浴溶解IOmin,取DNA浸出液作為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物再用DGGE電泳確認所回收條帶的正確位置。然后PCR擴增純化，完成測序。序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析。
4)分離純化目標(biāo)菌株
A、通過劃線和稀釋平鋪兩種接種的方式，分別接種于上述細菌培養(yǎng)基I和II制成的固體培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至菌落生長，16S rRNA鑒定。細菌培養(yǎng)基I1:氯化鈉lg，酵母浸出粉O. 5g，蛋白胨lg，蒸餾水1L，1. 5%瓊脂粉。
B、細菌的鑒定根據(jù)其形態(tài)特征及其16S rRNA基因序列鑒定。
2、降解效果驗證及菌劑的優(yōu)化
實驗設(shè)置2個方案，目的是根據(jù)不同污染物降解效果，確定高效降解細菌的最佳組合。設(shè)置不加菌懸液 的作為對照，采用GC-MS測定菌株的降解效果。
方案一苯并芘和芘作為唯一的碳源，在含細菌培養(yǎng)基I的液體中，分別加入培養(yǎng)好的單一細菌，室溫90rpm條件下,避光搖床培養(yǎng)2,4,6,8,10天(花為唯一碳源)或5,10，15，20，30，40，50，60天(苯并芘為唯一碳源)，設(shè)置不加菌懸液+污染物作為對照，采用GC-MS測定菌株的降解效果。
方案二 苯并芘和芘作為唯一的碳源，再加入上述細菌培養(yǎng)基I，使污染物終濃度分別為10mg/L和200mg/L。依據(jù)上述3)通過PCR-DGGE分析結(jié)果，將上述4)分離純化的優(yōu)勢菌株進行組合，室溫90rpm條件下,避光搖床培養(yǎng)2,4,6,8,10天(花為唯一碳源)或5,10，15，20，30，40，50，60天(苯并芘為唯一碳源)，設(shè)置不加菌懸液+污染物作為對照，采用GC-MS測定菌株的降解效果。
3、菌液的制備
上述分離純化的各菌株利用下述培養(yǎng)基接種，室溫90rpm條件下，搖床培養(yǎng)24_48小時得到，細菌的數(shù)量保持在5X IO8 5X101(lCFU/ml之間。所用培養(yǎng)基為每20L上述細菌培養(yǎng)基I溶液中，混合10g_20g葡萄糖，乙酸鈉3-15g。
4、高濃度多環(huán)芳烴污染土壤中投加高效降解菌的菌跟蹤及降解效果驗證
I)將上述3中獲得的菌液等量比例混合后，按照10ml/100g污染土壤的量，投放到長期污染的含有高分量多環(huán)芳烴污染土壤中。常溫下，通過定期投加適量的不同配比的上述微量元素A，保持環(huán)境中的40-60%的水分含量。間隔10天，定期檢測土壤中污染物濃度的變化。
2)高效降解菌的跟蹤監(jiān)測。
高濃度污染土壤中添加上述菌劑后，依照不同處理時間，分別稱取O. 25 g 土壤樣品，利用"powersoi IDNAi solat i ο η K i t " (Mobio 公司)，提取基因組。選取細菌16S rDNA V3區(qū)進行PCR擴增。制備Imm厚10% (w / v)聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為30% — 70% (100%變性劑組成為7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)。加樣后，置于IXTAE緩沖液中45V電泳16h。電泳完畢，取下凝膠，EB上染色。DGGE凝膠經(jīng)EB染色后，在紫外燈下將凝膠中較亮的條帶用潔凈的刀片小心切下。將目的條帶置于30 μ I滅菌超純水中，-20°C放置過夜。PCR前65°C水浴溶解lOmin，取DNA浸出液作為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物再用DGGE電泳確認所回收條帶的正確位置。然后PCR擴增純化，完成測序。序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析。
5、本發(fā)明所提供的三種高效降解菌來源于上海某工業(yè)園區(qū)重度污染土壤，經(jīng)過人工富集培養(yǎng)、分離純化獲得。經(jīng)16S rDNA鑒定分別為分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、微桿菌屬(Microbacterium sp.)。
本發(fā)明的高濃度高環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的分離篩選方法，涉及一種細菌互營復(fù)合體的分離篩選方法。它解決了現(xiàn)有多環(huán)芳烴類降解菌劑降解范圍較單一，單一菌種難以在復(fù)合污染環(huán)境中與土著菌間競爭的難題。本發(fā)明通過優(yōu)勢菌種組合，提供了一種能高效廣譜降解多環(huán)芳烴的復(fù)合細菌體。
`[0030]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點
1、本發(fā)明利用PCR-DGGE技術(shù)，確定污染物降解相關(guān)優(yōu)勢菌群及其分離純化，分別擴大培養(yǎng)24-48hr，菌數(shù)達到5X IO8 5X 101(lCFU/ml。各菌按照相同的比例混合后，以10ml/100g 土壤的量，投放到長期污染的含有高濃度高分量多環(huán)芳烴污染土壤中，通過定期投加適量的不同配比的營養(yǎng)元素及其濕度控制(40-60%)，持久保持所投加高效降解菌群的優(yōu)勢。該方法降解效率高，特別是針對高分子量多環(huán)芳烴污染的土壤和水體。
2、本發(fā)明提供了一種跟蹤高效降解菌在環(huán)境中的定植技術(shù)。
3、本發(fā)明還提供了一種營養(yǎng)元素的組合，能持久保持所投加高效降解菌群的優(yōu)勢。


圖1 :不同污染物為唯一碳源培養(yǎng)復(fù)合菌16S r DNA V3區(qū)PCR-DGGE電泳圖，樣品1:芘(200ppm) +細菌培養(yǎng)基I+菌懸液A ;樣品2 :苯并芘(IOppm) +細菌培養(yǎng)基I+菌懸液B0
圖2 :三種單菌分別對芘的降解效果(芘初始濃度為200mg/L)。
圖3 :三種單菌分別對苯并芘的降解效果(苯并芘初始濃度為10mg/L)。
圖4 :三種菌混合對芘的降解效果(芘初始濃度為200mg/L)。
圖5 :三種混合菌對苯并芘的降解效果(苯并芘初始濃度為10mg/L)。
圖6 :污染土壤投加菌后不同時間處理樣品16S r DNA V3區(qū)PCR-DGGE電泳圖，投加菌6天后開始采集樣品，時間間隔分別為6天、26天、46天、66天，1-8泳道分別表示1 加入蒸餾水調(diào)整濕度；2 :原始土壤，未加任何處理；3-5 :微量元素液調(diào)整濕度；6-8 :細菌培養(yǎng)基1+1%葡萄糖調(diào)整濕度。A、B、C表示所投加的菌，分別是A :投加的Acinetobactersp. ;B :投力口的 Microbacterium sp. ；C Mycobacterium sp. ;D :土著菌 Xanthomonas sp.。
具體實施方式
實施例1:
本實施例提供一種篩選高效多環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的分離方法，該方法具體如下
1、在IOOml三角瓶中加入50ml滅菌蒸餾水，IOg新鮮高濃度PAHs污染土壤，25-30 V，90rpm條件下培養(yǎng)。
2、在兩個新的滅菌三角瓶中各自加入芘和苯并芘的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入細 菌培養(yǎng)基I，使多環(huán)芳烴終濃度芘為200mg/L，苯并芘終濃度為10mg/L。接入1%體積含量的上述I中培養(yǎng)的細菌，25-30°C，90rpm條件下避光搖床培養(yǎng)10天，重復(fù)操作步驟2至步驟I細菌富集培養(yǎng)液對芘和苯并芘降解速率達到穩(wěn)定為止，得菌懸液A和B。
3、分別步驟2中獲得的菌懸液A和B各取Iml培養(yǎng)液均勻涂布于10mg/L苯并芘[a]和200mg/L芘的細菌培養(yǎng)基I和1%葡萄糖的細菌培養(yǎng)基I上。
4、30°C，培養(yǎng)2-4天，至菌落出現(xiàn)。從平板上挑取特征不同、生長旺盛且穩(wěn)定的菌落，在含1%葡萄糖和1%乙酸鈉的細菌培養(yǎng)基I固體平板上反復(fù)劃線分離以獲得純菌種，16srRNA鑒定。
5、取菌懸液A和B各1ml，5000rpm轉(zhuǎn)速下，離心3分鐘，倒掉上清液，再加入500ul滅菌蒸餾水，混懸，5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3分鐘，倒掉上清液，加入200ul滅菌蒸餾水，100°C煮沸5分鐘，冷卻。IOOOOrpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，取上清液作為下一步16s rRNAV3區(qū)擴增的模板。
6、分別以上述I和2步驟獲取的菌懸液煮沸液為模板，進行V3區(qū)PCR擴增，將獲得的V3區(qū)PCR擴增后的產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，以及凝膠成像圖譜分析(圖1)。
7、將步驟6中得到的含芘和苯并芘[a]不同樣品的變性梯度凝膠的條帶比對，以兩個樣品中都含有的條帶和各自優(yōu)勢的條帶作為目的片斷進行回收、純化及測序，將所得的序列片斷在GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析和檢測。
8、綜合上述步驟4和步驟7的結(jié)果，優(yōu)化菌群，確定該污染土壤中主要優(yōu)勢降解菌株。
9、通過上述過程，篩選得到的菌株為分枝桿菌(Mycobacterium sp.)不動桿菌(Acinetobacter sp.)、微桿菌(Microbacterium sp.)。
表I通過上述步驟I和步驟2富集，不同污染物為唯一碳源培養(yǎng)復(fù)合菌16S r DNAV3區(qū)PCR-DGGE電泳圖譜
(圖1)對應(yīng)單個條帶的序列比對分析
權(quán)利要求
1.一種篩選多環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的方法，其特征在于，所述方法采用PCR-DGGE技術(shù)，迅速確定出土壤樣品中污染物降解相關(guān)優(yōu)勢菌群及其分離純化，優(yōu)化組合，擴大培養(yǎng)，重新投放到長期污染的含有高濃度高分量多環(huán)芳烴污染土壤中，定期投加適量的不同配比的營養(yǎng)元素，并將濕度控制在40-60%范圍內(nèi)，持久保持高效降解菌群的優(yōu)勢。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種篩選多環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的方法，其特征在于，所述多環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的分離、篩選方法包括如下步驟 1)培養(yǎng)基中加入PAHs:在滅菌三角瓶中加入不同濃度PAHs的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，加入下述細菌培養(yǎng)基I，使芘終濃度為終濃度為200mg/L，苯并芘總濃度為10mg/L ； 細菌培養(yǎng)基1:硫酸銨2. 5g，硫酸亞鐵O. 28mg，磷酸氫二鈉1. 5g，磷酸二氫鉀1. 36g，硫酸鎂O. 25g，氯化鈣10. 7mg,氯化鈉O. 5g，氯化鐵O. 004g,1. OmL微量金屬液A、ImL維生素復(fù)合溶液，加水至IOOOmL并將pH控制在7. 2-7. 4，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用，若為固體培養(yǎng)基，則加入1. 5%瓊脂粉，其中微量金屬液A的組成為CoCl2 *6H2035mg, CuCl2O. 20mg,H3BO36. Omg, MnCl2 *4H2025mg, Na2MoO4 · 2H20 3. Omg, NiCl2 · 2H20 2. Omg, ZnCl22. 5mg,加水至IOOOmL ;維生素復(fù)合溶液的組成為維生素B61. Omg，維生素H O. 5mg，維生素C 1.5mg，加水至 IOOOmL ； 2)在150ml三角瓶中加入50ml滅菌蒸餾水，加入IOg新鮮高濃度PAHs污染土壤，25-30°C,90rpm條件下培養(yǎng)5天后，取IOml分別接種至上述含多環(huán)芳烴的IOOml無機鹽培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)10天，測定污染物降解效果； 3)確定高效降解功能的目標(biāo)菌群通過PCR-DGGE方法，分析上述兩種污染物富集的樣品中優(yōu)勢菌群，以兩種污染物為唯一碳源富集培養(yǎng)液中都存在的菌株確定為目標(biāo)菌株，取1. 5ml細菌培養(yǎng)液提取總DNA，選取細菌16S rDNA V3區(qū)進行PCR擴增，制備Imm厚10%(w / v)聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為30% -70%，加樣后置于I X TAE緩沖液中45V電泳16h，電泳完畢，取下凝膠，EB上染色，DGGE凝膠經(jīng)EB染色后，在紫外燈下將凝膠中較亮的條帶用潔凈的刀片小心切下，將目的條帶置于30μ I滅菌超純水中，_20°C放置過夜，PCR前65°C水浴溶解lOmin，取DNA浸出液作為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物再用DGGE電泳確認所回收條帶的正確位置，然后PCR擴增純化，完成測序，序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析； 4)分離純化目標(biāo)菌株 A、通過劃線和稀釋平鋪兩種接種的方式，分別接種于上述細菌培養(yǎng)基I和II制成的固體培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至菌落生長，16S rRNA鑒定，細菌培養(yǎng)基I1:氯化鈉lg，酵母浸出粉O. 5g，蛋白胨lg，蒸餾水1L，1. 5%瓊脂粉， B、細菌的鑒定根據(jù)其形態(tài)特征及其16SrRNA基因序列鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種篩選多環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的方法，其特征在于，100%變性劑的組成為7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺。
4.一種篩選高效多環(huán)芳烴降解細菌復(fù)合體的分離方法，其特征在于該方法包括如下步驟 (I)在IOOml三角瓶中加入50ml滅菌蒸餾水，IOg新鮮高濃度PAHs污染土壤，25-30°C，90rpm條件下培養(yǎng)；(2)在兩個新的滅菌三角瓶中各自加入芘和苯并芘的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入細菌培養(yǎng)基I，使多環(huán)芳烴終濃度芘為200mg/L，苯并芘終濃度為10mg/L，接入1%體積含量的上述I中培養(yǎng)的細菌，25-30°C，90rpm條件下避光搖床培養(yǎng)10天，重復(fù)操作步驟2至步驟I細菌富集培養(yǎng)液對芘和苯并芘降解速率達到穩(wěn)定為止，得菌懸液A和B ; (3)分別步驟2中獲得的菌懸液A和B各取Iml培養(yǎng)液均勻涂布于10mg/L苯并芘[a]和200mg/L芘的細菌培養(yǎng)基I和1%葡萄糖的細菌培養(yǎng)基I上； (4)30°C，培養(yǎng)2-4天，至菌落出現(xiàn)，從平板上挑取特征不同、生長旺盛且穩(wěn)定的菌落，在含1%葡萄糖和1%乙酸鈉的細菌培養(yǎng)基I固體平板上反復(fù)劃線分離以獲得純菌種，16srRNA鑒定； (5)取菌懸液A和B各Iml，5000rpm轉(zhuǎn)速下，離心3分鐘，倒掉上清液，再加入500ul滅菌蒸餾水，混懸，5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3分鐘，倒掉上清液，加入200ul滅菌蒸餾水，100°C煮沸5分鐘，冷卻，IOOOOrpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，取上清液作為下一步16s rRNAV3區(qū)擴增的模板； (6)分別以上述I和2步驟獲取的菌懸液煮沸液為模板，進行V3區(qū)PCR擴增，將獲得的V3區(qū)PCR擴增后的產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，以及凝膠成像圖譜分析； (7)將步驟6中得到的含芘和苯并芘[a]不同樣品的變性梯度凝膠的條帶比對，以兩個樣品中都含有的條帶和各自優(yōu)勢的條帶作為目的片斷進行回收、純化及測序，將所得的序列片斷在GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析和檢測； (8)綜合上述步驟4和步驟7的結(jié)果，優(yōu)化菌群，確定該污染土壤中主要優(yōu)勢降解菌株; (9)通過上述過程，篩選得到的菌株為分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)不動桿菌(Acinetobacter sp.)、微桿菌(Microbacterium sp.)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-4任一項所述的細菌復(fù)合體在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及高分子量多環(huán)芳烴類污染土壤的生物修復(fù)。具體提供了一種多環(huán)芳烴類污染場地中分離篩選高效降解細菌復(fù)合體的方法及其應(yīng)用，該方法利用PCR-DGGE技術(shù)，迅速確定土壤樣品中污染物降解相關(guān)優(yōu)勢菌群及其分離純化，優(yōu)化組合，擴大培養(yǎng)，重新投放到長期污染的含有高濃度高分量多環(huán)芳烴污染土壤中，通過定期投加適量的不同配比的營養(yǎng)元素及其濕度的控制(40-60%)，持久保持高效降解菌群的優(yōu)勢。該方法降解效率高，特別是針對高分子量多環(huán)芳烴污染的土壤。
文檔編號C12N1/20GKCN103045507SQ201210537032
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月12日
發(fā)明者金京華, 程言君, 高振, 郭鵬, 羅霂, 宋云 申請人:輕工業(yè)環(huán)境保護研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan