本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠識別柯薩奇病毒a組6型（coxsackievirus?a6，cv-a6）的中和單克隆抗體10g8及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、引起手足口病的病毒屬于小核糖核酸病毒科（picornavirus）腸道病毒屬（enteroviruse），為單股正鏈rna病毒，包括柯薩奇病毒a組的2、4、5、6、7、9、10、16型等，b組的1、2、3、4、5、6、13型等，腸道病毒71型（human?enterovirus?71,ev-a71），?？刹《荆╡choviruses）等。早期研究發(fā)現(xiàn)ev-a71是手足口?。╤and?foot?and?mouth?disease，hfmd）的主要致病原,?近年來hfmd腸道病毒病原譜發(fā)生了改變，近幾年的流行病學(xué)資料顯示，cv-a6引起的hfmd病例正逐年持續(xù)升高，已成為引起hfmd暴發(fā)的主要病原體。

2、中和抗體更能反應(yīng)病毒的抗原性、免疫原性和功能，因此，開發(fā)靶向識別cv-a6結(jié)構(gòu)蛋白的中和單克隆抗體對疫苗研發(fā)的質(zhì)控、臨床樣本的檢測和實驗室病毒鑒別具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明通過將純化的滅活cv-a6原液免疫小鼠，然后進行脾臟淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合，并篩選獲得雜交瘤細(xì)胞10g8，進一步獲得單克隆抗體10g8。該單克隆抗體與10g8現(xiàn)有的cv-a6單克隆抗體不同，結(jié)合不同的中和位點，其能夠識別cv-a6且具有中和活性，可用于cv-a6病毒定量，且反應(yīng)病毒的含量和功能，對疫苗研發(fā)的質(zhì)控至關(guān)重要。

2、本發(fā)明目的之一在于提供一種識別cv-a6的中和單克隆抗體10g8，所述中和單克隆抗體10g8的六個cdr區(qū)具體如下：

3、（1）重鏈cdr1的氨基序列如seq?id?no.1所示：gftlknya；

4、（2）重鏈cdr2的氨基序列如seq?id?no.2所示：vssggst；

5、（3）重鏈cdr3的氨基序列如seq?id?no.3所示：ereeggyaeawfay；

6、（4）輕鏈cdr1的氨基序列如seq?id?no.4所示：qsivqsngnty；

7、（5）輕鏈cdr2的氨基序列為seq?id?no.5所示：evs；

8、（6）輕鏈cdr3的氨基序列為seq?id?no.6所示：fqgshvpft。

9、進一步的，所述單克隆抗體10g8的重鏈可變區(qū)全長氨基酸如seq?id?no.7所示，或與seq?id?no.7所示氨基酸序列有95％以上同源性的氨基酸序列；

10、所述單克隆抗體10g8的輕鏈可變區(qū)全長氨基酸如seq?id?no.8所示，或與seq?idno.8所示氨基酸序列有95％以上同源性的氨基酸序列。

11、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，所述seq?id?no.7具體為：evklvesggglvkpggslklscaasgftlknyamswvrqtpekrlewvasvssggstyyldsvkgrftvsrdnarnilylqmsslrsedtamyycereeggyaeawfaywgqgtlvtvsa。

12、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，所述seq?id?no.8具體為：avlmtqtplsltvslgdqasiscrssqsivqsngntylewylqksgqspklllyevsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshvpftfgsgtkleik。

13、進一步的，編碼seq?id?no.7所示氨基酸序列的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；編碼seq?id?no.8所示氨基酸序列的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。

14、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，所述seq?id?no.9具體為：gaagtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtaaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcaccttaaaaaactatgccatgtcttgggttcgccagactccagagaagaggctggagtgggtcgcatccgttagtagtggtggtagcacctactatttagacagtgtgaagggccgattcaccgtctccagagataatgccaggaacatcctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgaaagagaagaaggcggttacgccgaggcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca。

15、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，所述seq?id?no.10具體為：gctgttttgatgacccaaactccactctccctgactgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacaaagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaatcaggccagtctccaaagctcctgctttatgaagtttccaaccgcttttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcagggttcacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa。

16、進一步的，所述單克隆抗體10g8為igm型抗體。

17、本發(fā)明目的之二在于提供一種編碼上述單克隆抗體10g8的核苷酸序列。

18、本發(fā)明目的之三在于提供一種表達(dá)載體，所述載體含有編碼上述的單克隆抗體的核酸分子。

19、本發(fā)明目的之四在于提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有上述的核苷酸序列，或含有上述的表達(dá)載體。

20、本發(fā)明目的之五在于提供一種抗體偶聯(lián)物，所述抗體偶聯(lián)物包含上述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段及標(biāo)記物。

21、本發(fā)明目的之六在于提供上述的單克隆抗體在制備檢測cv-a6試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明目的之七在于提供上述的單克隆抗體在制備抑制、預(yù)防和治療cv-a6所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

24、（1）本發(fā)明提供的單克隆抗體10g8可與偶聯(lián)物（辣根過氧化酶或異硫氰酸熒光素等）結(jié)合用于直接或間接檢測、快速診斷；如可用于開發(fā)檢測由cv-a6感染引起的臨床樣品的檢測試劑或試劑盒，也可用于臨床病毒分離株實驗室鑒定抗體，同時還可用于制備預(yù)防性疫苗生產(chǎn)中間品及產(chǎn)品含cv-a6抗原的定量檢測試劑。

25、（2）本發(fā)明提供的單克隆抗體10g8體現(xiàn)出優(yōu)異的被動保護治療效果，當(dāng)給注射致死量毒株的小鼠注射不同濃度單克隆抗體10g8后（162.0ng/g小鼠、486.1ng/g小鼠），喂養(yǎng)14天，發(fā)現(xiàn)486.1ng/g實驗組小鼠存活率達(dá)100%，162.0ng/g實驗組存活率達(dá)70%。