本發(fā)明屬于生物信息學(xué)與rna提純篩選領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤glycorna的提純篩選方法、系統(tǒng)及設(shè)備。

背景技術(shù)：

1、糖基化?rna（glycorna）是一類由flynn等人于2021年發(fā)現(xiàn)的新型聚糖修飾生物分子，廣泛存在于包括人宮頸癌細(xì)胞系?hela、293t、人?t?淋巴細(xì)胞系?h9?在內(nèi)的多種類型細(xì)胞上，被認(rèn)為可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。flynn等人通過(guò)一系列提取純化過(guò)程將glycorna分離出來(lái)，再分別通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、小rna測(cè)序技術(shù)對(duì)glycorna的兩種組成成分：唾液酸聚糖分子、小rna進(jìn)行了檢測(cè)鑒定。

2、在檢測(cè)鑒定來(lái)源于細(xì)胞的多種glycorna時(shí)，將組成glycorna的2種組成成分分別進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)到的多種小rna、聚糖含量進(jìn)行排序，但多種小rna、聚糖之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是未知的，因此阻礙了對(duì)glycorna的進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了以下的技術(shù)方案。

2、本發(fā)明提供了一種特異性純化腫瘤glycorna的探針組，所述探針組為：glycornau2探針seq?id?no:1，glycorna?u4探針seq?id?no:2。

3、本發(fā)明提供了一種腫瘤glycorna的提純篩選方法，所述方法包括：

4、1）對(duì)細(xì)胞中g(shù)lycorna進(jìn)行標(biāo)記；

5、2）對(duì)已標(biāo)記glycorna的細(xì)胞總rna進(jìn)行提取和純化，得到純化總rna；

6、3）對(duì)純化總rna進(jìn)行小rna純化，得到純化小rna；

7、4）對(duì)純化小rna進(jìn)行鏈霉素親和素磁珠純化，得到粗純化glycorna；

8、5）對(duì)粗純化glycorna進(jìn)行g(shù)lycorna特異性磁珠純化，洗脫得到純化的腫瘤glycorna；

9、所述glycorna特異性磁珠由如下方法制備：

10、將磁珠分散液充分混勻，然后移取羧基衍生微珠，磁吸分離磁珠，移去上清液；用rbuffer洗滌磁珠2-3次，磁吸分離磁珠，保留磁珠；移取r?buffer溶解氨基oligo，添加到磁珠中，混勻，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)；使用r?buffer溶解的edc溶液，加入混勻，加入r?buffer補(bǔ)足體積，室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)，磁吸分離磁珠，用w?buffer洗滌磁珠2-3次，得到glycorna特異性磁珠；

11、所述步驟5）中對(duì)粗純化glycorna進(jìn)行g(shù)lycorna特異性磁珠純化，具體包括如下步驟：

12、將鏈霉素親和素磁珠純化后的glycorna樣品65℃溫育變性，將前面所述的探針組加到變性樣品中，37℃雜交30?min，50℃溫育變性5min，37℃雜交90~180?min；加入準(zhǔn)備好的glycorna特異性磁珠，室溫混勻溫育結(jié)合30?min，收集磁珠并去上清，重復(fù)加入washbuffer，37℃搖動(dòng)洗滌后收集磁珠并去上清。

13、進(jìn)一步，所述磁珠分散液為含有magnabind?羧基衍生微珠的pbs水性溶液，ph>4.0。

14、進(jìn)一步，所述氨基oligo為前面所述的特異性純化腫瘤glycorna的探針組特異性互補(bǔ)的氨基rna探針。

15、進(jìn)一步，所述r?buffer為反應(yīng)緩沖液，組分為100?mm?mes，ph?4.5。

16、進(jìn)一步，所述w?buffer為洗滌緩沖液，組分為1×pbs，ph?7.4。

17、進(jìn)一步，所述glycorna特異性磁珠使用s?buffer保存，保存條件為4℃，磁珠濃度為10mg/ml。

18、進(jìn)一步，所述s?buffer為儲(chǔ)存緩沖液，組分為1×pbs，ph7.4，0.05%(w/v)?proclin300。

19、進(jìn)一步，所述羧基衍生微珠與磁珠分散液的比例為10mg：200μl。

20、進(jìn)一步，氨基oligo、溶解氨基oligo的r?buffer、edc溶液、補(bǔ)足體積的r?buffer的比例為3od：300μl：150μl：50μl。

21、進(jìn)一步，所述edc溶液的濃度為100mg/ml。

22、進(jìn)一步，腫瘤包括實(shí)體瘤，具體包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、甲狀腺癌、肝母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤、腎透明細(xì)胞癌、腎橫紋肌樣瘤、腎透明細(xì)胞肉瘤、腎原始神經(jīng)外胚葉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤、胚胎型橫紋肌肉瘤、腺泡型橫紋肌肉瘤、多形型橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、喉癌、副鼻竇癌、舌癌、牙齦癌、頰癌、甲狀腺腫瘤、口腔癌、頭頸部惡性腫瘤、泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、胸腺瘤、胸腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、膠質(zhì)瘤。

23、進(jìn)一步，所述加入準(zhǔn)備好的glycorna特異性磁珠為u2、u4特異性的。

24、進(jìn)一步，所述洗脫是指洗脫glycorna特異性磁珠上攜帶的glycorna，具體包括：glycorna特異性磁珠加入?rna?elution?buffer?混勻后，95℃加熱?2?min，收集磁珠并收集上清，再次加入rna?elution?buffer?混勻后，95℃加熱?2?min，收集磁珠并收集上清；將上清加入rna純化柱中，加binding?buffer，10000g，20s離心，棄去廢液，加prep?buffer洗一次，wash?buffer洗2次，空離一次，加入rna?free水滴，孵育5min，10000g，20s離心，重復(fù)一次，收集洗脫液。

25、進(jìn)一步，所述對(duì)細(xì)胞中g(shù)lycorna進(jìn)行標(biāo)記包括步驟：用dmso?將?ac4mannaz（medchemexpress，hy-w728531）溶解成?500?mm，之后用dmso?稀釋為?100mm。galnac?和gal?分別用無(wú)菌水溶解成?500?mm?和?50mm，用無(wú)菌水稀釋為100mm和10mm；用終濃度為100μm?的?ac4mannaz?(1:1000?稀釋，10ml培養(yǎng)基加10μl?100mm?的ac4mannaz)處理10cm培養(yǎng)皿中的u87、ln229或hela?細(xì)胞?0和?24h后，收獲細(xì)胞以提取rna。gal?（（sigma，g0750）(10μm，1:1000?稀釋)和?galnac（sigma，a2795）?(100?μm，1:1000稀釋)用作培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，并與?ac4mannaz?同時(shí)添加。

26、進(jìn)一步，所述對(duì)已標(biāo)記glycorna的細(xì)胞總rna進(jìn)行提取和純化包括步驟：通過(guò)trizol?法提取總?rna。收集細(xì)胞，在trizol中裂解混勻后，樣品在37℃下孵育10min，進(jìn)一步使非共價(jià)相互作用變性。之后再加0.2倍體積的氯仿提取rna。渦旋混合，最后在4℃離心，小心地吸取水相，轉(zhuǎn)移到新管中，并與2倍體積的無(wú)水乙醇混合；將上述含有總?rna?的溶液加入?zymo?rna?純化濃縮柱（zymo?research，1017），10,000?x?g?離心?20?s，棄廢液，用400?μl?rna?制備緩沖液洗1次和?400?μl?rna?洗滌緩沖液洗2次對(duì)?rna?進(jìn)行洗滌純化，再以?10,000?x?g?離心?20?s。使用兩倍體積的純水洗脫rna。向?25?μg?純化?rna?中加入?1μg?蛋白酶?k，37?℃?孵育?45?min?后，再次用?zymo柱進(jìn)行純化。zymo?spin?ic和iiicg柱可以結(jié)合50-350μg總rna，根據(jù)需要純化的rna的量選擇每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的柱。

27、進(jìn)一步，所述對(duì)純化總rna進(jìn)行小rna純化包括步驟：每個(gè)15cm培養(yǎng)皿細(xì)胞加入2mlrnazol；dna/蛋白質(zhì)沉淀：充分震蕩混勻，每使用1ml?rnazol加入0.4ml水，顛倒混勻，靜置15min后，12000g，15min離心；mrna沉淀：上清液加入0.4倍體積75%乙醇，顛倒混勻，靜置10分鐘，12000?g?，8分鐘離心；mrna洗滌：上清收集到新管中，沉淀加入0.4ml?75%乙醇洗滌，8000g，2min離心棄上清，洗兩次；mrna溶解：使用depc水溶解mrna；mirna沉淀：mrna沉淀得到的上清液中加入0.8倍體積異丙醇，顛倒混勻，靜置30分鐘，12000g?15分鐘離心；mirna洗滌：棄上清，沉淀加入0.4ml，70%異丙醇，8000g，3min，洗滌兩次；mirna溶解：使用depc水溶解mirna，并通過(guò)zymo純化柱純化。

28、進(jìn)一步，所述對(duì)純化小rna進(jìn)行鏈霉素親和素磁珠純化包括步驟：鏈霉親和素磁珠純化glycorna：10μl?myone?c1鏈霉素親和素磁珠，用50?ng/ml糖原在500μl?biotin?washbuffer（10?mm?tris?hcl?ph7.5,?1?mm?edta,?100?mm?nacl,?0.05%?tween-20)?）中，在25℃孵育1h封閉，封閉后4℃，3000rpm離心2min，放于磁力架上，棄上清；500μl?biotin?washbuffer重旋磁珠，加入生物素化的mirna中，封口膜封口，4℃旋轉(zhuǎn)混合2h，3000rpm離心2min，放于磁力架上，收集上清，后續(xù)過(guò)純化柱，用于上樣；洗滌珠子以去除未結(jié)合的rna：用1ml?biotin?wash?buffer洗滌兩次，每次3分鐘；洗脫glycorna：將生物素化的rna與磁珠在60μl?0.75m?nacl，10?mm?edta和10?mm?tris-cl（ph?7.4）中（提前配制完成）在22℃孵育5分鐘。通過(guò)將磁珠重懸于1×體積的5%?b-巰基乙醇（bme）溶液中（上一步溶液不棄）并在22℃下孵育5分鐘來(lái)洗脫rna，3000rpm離心2min，收集上清，通過(guò)zymo濃縮純化柱進(jìn)行g(shù)lycorna純化。

29、本發(fā)明提供了一種前面所述的腫瘤glycorna的提純篩選方法得到的腫瘤glycorna。

30、本發(fā)明提供了一種腫瘤glycorna中聚糖的提純方法，所述方法包括以下步驟：

31、將前面所述的腫瘤glycorna用rna?free水稀釋，加入pngasef和10×glycobuffer?2，37℃孵育18小時(shí)，冷卻至室溫，使用預(yù)處理過(guò)的pgc-spe純化柱2次，然后用5%乙腈/0.1%?tfa清洗柱子1次，用1.5?ml、4×?50%乙腈/?0.1%tfa將聚糖洗脫，立即將樣品冷凍在干冰上，然后凍干至干燥，凍干后，溶解于1ml水中，再次干燥，得到純化的腫瘤glycorna中聚糖。

32、進(jìn)一步，所述rna?free水、pngasef、10×?glycobuffer?2的體積比為8:1:1。

33、進(jìn)一步，所述預(yù)處理過(guò)的pgc-spe純化柱的預(yù)處理步驟包括：按以下順序用試劑預(yù)處理每個(gè)pgc-spe純化柱:15ml?1m?naoh，15ml?hplc級(jí)水，15ml?30%醋酸，15ml?hplc級(jí)水，15ml?50%乙腈/0.1%三氟乙酸(tfa)洗柱子3次，15m?5%乙腈/0.1%三氟乙酸洗柱子2次，得到預(yù)處理的pgc-spe純化柱。

34、本發(fā)明提供了一種前面所述的提純方法中使用的腫瘤glycorna中聚糖的提純?cè)噭┖?，所述試劑盒包括：rna?free水、pngasef、10×?glycobuffer?2、pgc-spe純化柱、5%乙腈/0.1%?tfa、4×50%乙腈/?0.1%tfa、1m?naoh、30%醋酸。

35、本發(fā)明提供了一種前面所述的腫瘤glycorna中聚糖的提純方法得到的腫瘤glycorna聚糖。

36、本發(fā)明提供了一種glycorna聚糖分析的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括，數(shù)據(jù)獲取單元：獲得glycorna中聚糖的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)為前面所述的腫瘤glycorna聚糖的液相色譜數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)處理單元：根據(jù)數(shù)據(jù)獲取單元中的數(shù)據(jù)進(jìn)行文庫(kù)鑒定分析；數(shù)據(jù)輸出單元，將數(shù)據(jù)處理單元的結(jié)果進(jìn)行輸出，得到glycorna聚糖的分析結(jié)果。

37、在一些實(shí)施方案中，glycorna中聚糖分析的系統(tǒng)包括采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)對(duì)glycorna中的聚糖進(jìn)行鑒定和分析步驟，具體步驟為：將多糖溶液在真空濃縮器中干燥，再溶于純水中。溶液中加入ch3i和dmso,?naoh微螺旋柱進(jìn)行全甲基化。用氯仿提取甲基化聚糖，用水沖洗數(shù)次。然后收集氯仿層，真空濃縮至干燥。lc分離參數(shù)設(shè)置為:分析柱:360?μm?od?×?75?μm?id,?75?cm;填料:phenomenex?jupiter?c18,?5?μm,?300??;隔離柱:360?μm?od?×?200?μm?id,?5?cm;填料:phenomenex?jupiter?c18,?5μm,?300??;流動(dòng)相:緩沖液a為99.9%?h2o和0.1%?fa的混合物，緩沖液b為99.9%?acn和0.1%?fa的混合物。串聯(lián)質(zhì)譜的參數(shù)為:質(zhì)量分辨率22.5?k，數(shù)據(jù)依賴采集top?20，自動(dòng)增益控制目標(biāo)值1×105，最大離子注入時(shí)間200?ms，母離子隔離窗口3?m/z，動(dòng)態(tài)排除50.0?s，階躍nce為10%。基于lc-ms/ms數(shù)據(jù)，采用glyseeker軟件進(jìn)行文庫(kù)鑒定(fdr≤1%)。

38、本發(fā)明提供了一種glycorna的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括，數(shù)據(jù)獲取單元：獲得glycorna的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)為前面所述的腫瘤glycorna的測(cè)序數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)處理單元：根據(jù)數(shù)據(jù)獲取單元中的數(shù)據(jù)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；數(shù)據(jù)輸出單元，將數(shù)據(jù)處理單元的結(jié)果進(jìn)行輸出，得到glycorna的三維結(jié)構(gòu)。

39、進(jìn)一步，所述進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)包括步驟：使用?rnastructure進(jìn)行g(shù)lycorna二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，然后將二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到3drna中構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，再使用動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行優(yōu)化。

40、進(jìn)一步，使用的動(dòng)力學(xué)軟件為gromacs?5.0。

41、進(jìn)一步，所述gromacs?5.0在優(yōu)化時(shí)的模擬條件為：力場(chǎng)?gomacs?54a7，水模型spc，確定模擬體系的溫度耦合采用“berendsen?thermostat”法，壓力耦合采用“manometer”方法，參照壓力1.01×105，體系所有方向上采用周期邊界條件。

42、進(jìn)一步，所述gromacs?5.0在優(yōu)化時(shí)采用如下步驟：固定主鏈在模擬的水溶液環(huán)境中優(yōu)化側(cè)鏈?5000?步，然后在模擬的水溶液環(huán)境中全局優(yōu)化?5000?步。

43、在一些實(shí)施方案中，上述的單元或步驟可通過(guò)計(jì)算裝置實(shí)現(xiàn)效果。在一些實(shí)施方案中，所述單元或步驟可集中于單個(gè)的計(jì)算裝置上。在一些實(shí)施方案中，所述單元或步驟可分布與多個(gè)計(jì)算裝置上，多個(gè)計(jì)算裝置由網(wǎng)絡(luò)或其他鏈接方式進(jìn)行鏈接。在一些實(shí)施方案中，所述計(jì)算裝置中儲(chǔ)存有用于執(zhí)行上述單元或步驟的程序代碼，所述的程序代碼儲(chǔ)存于存儲(chǔ)裝置中。在一些實(shí)施方案中，所述單元或步驟可分別制備成集成電路，也可組合制成單個(gè)的集成電路。

44、本發(fā)明提供了一種設(shè)備，所述設(shè)備包括存儲(chǔ)存儲(chǔ)器和處理器，所述存儲(chǔ)器用于存儲(chǔ)程序指令；所述處理器用于調(diào)用程序指令，當(dāng)程序指令被執(zhí)行時(shí)實(shí)現(xiàn)前面所述的腫瘤glycorna的提純篩選方法、或前面所述的腫瘤glycorna中聚糖的提純方法。

45、進(jìn)一步，所述存儲(chǔ)器包括只讀存儲(chǔ)器(rom)、相變隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(pram)、靜態(tài)隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(sram)、閃速存儲(chǔ)器、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(ram)、諸如同步dram(sdram)的動(dòng)態(tài)隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(dram)、電可擦除可編程只讀存儲(chǔ)器(eeprom))、靜態(tài)存儲(chǔ)器、以及其他類型的隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、高速緩沖存儲(chǔ)器、寄存器、致密盤只讀存儲(chǔ)器(cd-rom)、數(shù)字通用盤(dvd)或其他光存儲(chǔ)裝置、盒帶、其他非暫態(tài)介質(zhì)。

46、進(jìn)一步，所述處理器包括微處理器、微控制器、圖形處理單元（gpu）、專用集成電路（asic）、現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列（fpga）。

47、本發(fā)明提供了一種計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)上存儲(chǔ)有計(jì)算機(jī)程序，所述計(jì)算機(jī)程序被處理器執(zhí)行時(shí)實(shí)現(xiàn)前面所述的腫瘤glycorna的提純篩選方法、或前面所述的腫瘤glycorna中聚糖的提純方法。

48、本發(fā)明中使用術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)”應(yīng)被理解為包括存儲(chǔ)一個(gè)或多個(gè)指令集的單個(gè)介質(zhì)或多個(gè)介質(zhì)(例如，集中式數(shù)據(jù)庫(kù)或分布式數(shù)據(jù)庫(kù)，和/或相關(guān)聯(lián)的高速緩存和服務(wù)器)。術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)”還應(yīng)被理解為包括能夠存儲(chǔ)或編碼指令集的任何介質(zhì)，所述指令集用于由機(jī)器執(zhí)行并且致使所述機(jī)器完成本發(fā)明的方法中的任何一項(xiàng)或多項(xiàng)。術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)”應(yīng)相應(yīng)地被理解為包括但不限于固態(tài)存儲(chǔ)器以及光學(xué)介質(zhì)和磁性介質(zhì)。

49、本發(fā)明提供了前面所述的探針組、前面所述的glycorna的提純篩選方法、或前面所述的glycorna中聚糖的提純方法在制備腫瘤glycorna提純、腫瘤glycorna篩選、腫瘤glycorna聚糖提純產(chǎn)品中的應(yīng)用。

50、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

51、找到組成膠質(zhì)瘤細(xì)胞glycorna的兩種組分：小rna、聚糖之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而明確其具體構(gòu)成；利用分子對(duì)接模擬方法，預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞glycorna的三維結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步對(duì)glycorna的功能研究提供基礎(chǔ)。