本發(fā)明屬于生物，涉及一種提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法。

背景技術(shù)：

1、重組蛋白是通過組合不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)而人工產(chǎn)生的，重組是指重新組合或連接遺傳物質(zhì)以創(chuàng)建非自然發(fā)生的新組合。臨床上使用的重組蛋白包括重組激素、干擾素、白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、凝血因子等，用于治療糖尿病、侏儒癥、心肌梗死等重大疾病。重組蛋白是現(xiàn)代生物技術(shù)的一個(gè)重要方面，廣泛應(yīng)用于開發(fā)治療藥物、生產(chǎn)用于工業(yè)過程的酶以及農(nóng)業(yè)目的的轉(zhuǎn)基因生物。

2、轉(zhuǎn)染是真核細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)地導(dǎo)入外源dna片段而獲得新的表型的過程。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，另一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。前者外源dna/rna不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只能持續(xù)幾天；后者也稱永久轉(zhuǎn)染，外源dna既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在，但通常需要多月完成，需要耗費(fèi)大量時(shí)間與成本。

3、hek293細(xì)胞，又稱人胚胎腎細(xì)胞，具有人源的翻譯后修飾能力，且具有在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)快速分裂與表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。通過轉(zhuǎn)染外源基因，hek293細(xì)胞可以用于表達(dá)重組蛋白，包括抗體、細(xì)胞因子等。在目的蛋白表達(dá)生物實(shí)驗(yàn)中廣泛被應(yīng)用，這使得hek293細(xì)胞成為蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的重要工具。但目前hek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白的表達(dá)方法存在由于轉(zhuǎn)染效率低、質(zhì)粒整合率低導(dǎo)致較低的重組蛋白表達(dá)水平較低等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，采用本發(fā)明所述方法可以顯著提高目的蛋白的表達(dá)水平。

2、本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

3、一種提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，所述方法包括以下步驟：將hek?293細(xì)胞復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)后，將調(diào)整好密度的細(xì)胞加入重組蛋白dna-pei復(fù)合物進(jìn)行第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)hek?293細(xì)胞進(jìn)行第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后在轉(zhuǎn)染體系中加入添加劑，所述添加劑包括檸檬酸鐵銨與胰蛋白胨。

4、進(jìn)一步的，第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5~3.5×106cells/ml。

5、進(jìn)一步的，在第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h~48h后對(duì)hek?293細(xì)胞進(jìn)行第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

6、進(jìn)一步的，第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)加入添加劑。

7、進(jìn)一步的，加入添加劑后，檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中的終濃度為3~8μmol/l，胰蛋白胨在培養(yǎng)基中的終濃度為150~250g/l。

8、進(jìn)一步的，所述重組蛋白dna-pei復(fù)合物包括重組蛋白dna和pei，重組蛋白dna與pei的質(zhì)量比為1：4~6。

9、進(jìn)一步的，第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)搖床的轉(zhuǎn)速為120rpm以上。

10、進(jìn)一步的，第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前調(diào)整細(xì)胞密度的方法包括：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hek?293細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳到3代次后，進(jìn)行第一次細(xì)胞密度調(diào)整，按照0.7~0.8×106cells/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，繼續(xù)培養(yǎng)20~28h，進(jìn)行第二次細(xì)胞密度調(diào)整，將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5~3.5×106cells/ml。

11、進(jìn)一步的，hek?293細(xì)胞傳代培養(yǎng)前，先在700~900rpm轉(zhuǎn)速條件下離心4~6min重懸細(xì)胞。

12、進(jìn)一步的，第一次細(xì)胞密度調(diào)整后，細(xì)胞培養(yǎng)條件為：溫度為37℃，5%體積百分比的co2，轉(zhuǎn)速為120?rpm以上。

13、有益效果

14、本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)量較低的問題，在對(duì)培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染體系中重組蛋白dna與pei的比例進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過增加二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速，并在轉(zhuǎn)染24h后添加終濃度為5μmol/l檸檬酸鐵銨和200g/l的胰蛋白胨，將重組蛋白的表達(dá)水平提高了近1倍。

技術(shù)特征：

1.一種提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：將hek?293細(xì)胞復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)后，將調(diào)整好密度的細(xì)胞加入重組蛋白dna-pei復(fù)合物進(jìn)行第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)hek?293細(xì)胞進(jìn)行第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后在轉(zhuǎn)染體系中加入添加劑，所述添加劑包括檸檬酸鐵銨與胰蛋白胨。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5~3.5×106cells/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，在第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h~48h后對(duì)hek?293細(xì)胞進(jìn)行第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)加入添加劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，加入添加劑后，檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中的終濃度為3~8μmol/l，胰蛋白胨在培養(yǎng)基中的終濃度為150~250g/l。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，所述重組蛋白dna-pei復(fù)合物包括重組蛋白dna和pei，重組蛋白dna與pei的質(zhì)量比為1：4~6。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)搖床的轉(zhuǎn)速為120rpm以上。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前調(diào)整細(xì)胞密度的方法包括：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hek?293細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳到3代次后，進(jìn)行第一次細(xì)胞密度調(diào)整，按照0.7~0.8×106cells/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，繼續(xù)培養(yǎng)20~28h，進(jìn)行第二次細(xì)胞密度調(diào)整，將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5~3.5×106cells/ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，hek?293細(xì)胞傳代培養(yǎng)前，先在700~900rpm轉(zhuǎn)速條件下離心4~6min重懸細(xì)胞。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的提高h(yuǎn)ek?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，第一次細(xì)胞密度調(diào)整后，細(xì)胞培養(yǎng)條件為：溫度為37℃，5%體積百分比的co2，轉(zhuǎn)速為120?rpm以上。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高HEK?293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組蛋白表達(dá)量的方法，所述方法包括以下步驟：將HEK?293細(xì)胞復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)后，將調(diào)整好密度的細(xì)胞加入重組蛋白DNA?PEI復(fù)合物進(jìn)行第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在第一次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)HEK?293細(xì)胞進(jìn)行第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，第二次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后在轉(zhuǎn)染體系中加入添加劑，所述添加劑包括檸檬酸鐵銨與胰蛋白胨。本發(fā)明所述方法顯著提高了目的蛋白的表達(dá)水平。

技術(shù)研發(fā)人員：孫益軍,張峰,王敏敏,楊文駿,李利云
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19