本發(fā)明屬于生物,具體設(shè)計(jì)一種檢測麻風(fēng)桿菌的引物探針組合、試劑盒及方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、麻風(fēng)(leprosy),亦稱漢森病,是由麻風(fēng)桿菌感染引起的慢性傳染性疾病,主要通過呼吸道與未經(jīng)治療的麻風(fēng)患者頻繁密切接觸傳播。主要侵犯皮膚及周圍神經(jīng),若不及時(shí)診治,可能導(dǎo)致進(jìn)行性和永久性殘疾。
2、麻風(fēng)臨床表現(xiàn)多樣,可模擬皮膚科中多種疾病,初步診斷主要通過皮膚皮損病變、感覺喪失、毛發(fā)脫落、肢體殘疾等癥狀觀察,缺乏特異性表現(xiàn),組織液抗酸染色和組織病理檢查作為診斷金標(biāo)準(zhǔn),靈敏度低、耗時(shí)、操作難度高,而血清學(xué)檢測對(duì)于少菌型麻風(fēng)靈敏度低,且與其他分枝桿菌存在交叉反應(yīng),不能實(shí)現(xiàn)麻風(fēng)的早期、準(zhǔn)確診斷。
3、自1981?年多藥治療方案推行以來,麻風(fēng)在世界范圍內(nèi)得到了有效控制,麻風(fēng)患病率及新發(fā)病例數(shù)顯著下降,2013年至2022年期間,全球新發(fā)病例數(shù)下降了19.3%,到2019年下降了6%,但在部分麻風(fēng)流行區(qū)域發(fā)病率仍然較高。世界衛(wèi)生組織在《2021-2030年全球麻風(fēng)戰(zhàn)略》中呼吁實(shí)現(xiàn)零麻風(fēng)目標(biāo)(零疾病、零殘疾、零污名和歧視),目標(biāo)是到2030年全球麻風(fēng)新發(fā)病例減少70%。要達(dá)到這個(gè)目標(biāo),實(shí)現(xiàn)麻風(fēng)患者早期診斷,及早治療顯得尤為重要。
4、隨著核酸檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,現(xiàn)已開發(fā)出多種針對(duì)麻風(fēng)桿菌不同靶基因的普通pcr、qpcr及巢式pcr等核酸檢測技術(shù),qpcr因其靈敏度、特異性高廣泛應(yīng)用于麻風(fēng)桿菌檢測,但其反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長,需依賴熱循環(huán)儀、專業(yè)pcr實(shí)驗(yàn)室及專業(yè)人員操作,限制了其在麻風(fēng)診斷及篩查中的應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是一種新的dna擴(kuò)增技術(shù),其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物,在鏈置換dna聚合酶(bst?dna?polymerase)的作用下,60℃~65℃恒溫?cái)U(kuò)增,15~60分鐘左右即可實(shí)現(xiàn)109~1010倍的核酸擴(kuò)增,還可以通過引入兩條環(huán)引物加快反應(yīng),提高反應(yīng)速度,縮短檢測時(shí)間,提高檢測效率,操作簡單,對(duì)儀器設(shè)備要求低,結(jié)果判讀簡單,適合基層快速診斷,但是非特異性擴(kuò)增問題限制了lamp在微生物檢測中的應(yīng)用。雖然現(xiàn)在已建立了幾種麻風(fēng)桿菌的lamp檢測,但主要以染料法及ph敏感指示劑作為觀察結(jié)果,可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致假陽性。因此,基于qpcr技術(shù)反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長,對(duì)熱循環(huán)儀器的依賴性、專業(yè)人員及專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的需求性,傳統(tǒng)lamp可能存在的假陽性問題,亟需研究出一套麻風(fēng)桿菌檢測用引物探針組合,以實(shí)現(xiàn)麻風(fēng)桿菌的早期、即時(shí)、快速、準(zhǔn)確檢測。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明正是為了解決上述問題缺陷,提供一種檢測麻風(fēng)桿菌引物探針組合、試劑盒、方法和應(yīng)用。本發(fā)明旨在針對(duì)麻風(fēng)桿菌的rlep基因,設(shè)計(jì)特定的lamp引物及探針,并以此為基礎(chǔ)建立一種高保真dna聚合酶介導(dǎo)的探針法lamp(hifi-lamp)檢測技術(shù)。此技術(shù)旨在提高麻風(fēng)桿菌檢測的靈敏度和特異性,同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間,為麻風(fēng)病的早期、快速、準(zhǔn)確、即時(shí)檢測提供有效方案。
2、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
3、檢測麻風(fēng)桿菌引物探針組合,所述引物探針組合包括:上游外引物f3、下游外引物b3、上游內(nèi)引物fip、下游內(nèi)引物bip;
4、上游外引物f3:gcggggtttttgttggtg;
5、下游外引物b3:tcctcacactcacgcctg;
6、上游內(nèi)引物fip:cgcgctaatcgtgtccactgc-ggctgactgcctgctttc;
7、下游內(nèi)引物bip:gtcggtggtggatgctgctt-cgatatcgccttcagcacag;
8、上游外引物f3如seq?id?no.1所示;
9、下游外引物b3如seq?id?no.2所示;
10、上游內(nèi)引物fip如seq?id?no.3所示;
11、下游內(nèi)引物如bip如seq?id?no.4所示。
12、進(jìn)一步為,本發(fā)明所述引物探針組合包括:上游環(huán)狀引物lf:aaagcacacgaagcctcatc、下游環(huán)狀引物lb:?tgttgatgatgccaggggc;
13、上游環(huán)狀引物lf如seq?id?no.5所示;
14、下游環(huán)狀引物lb如?seq?id?no.6所示。
15、進(jìn)一步為,本發(fā)明所述引物探針組合包括:熒光探針hfman-probe:bhq2-tgttgatgatgccaggggc-cy5,熒光探針hfman-probe?如seq?id?no.7所示。
16、一種試劑盒,所述試劑盒包括上述的引物和熒光探針。
17、本發(fā)明保護(hù)所述引物探針組合在特異性檢測麻風(fēng)桿菌中的應(yīng)用。
18、本發(fā)明檢測麻風(fēng)桿菌應(yīng)用的方法,包括在64℃下進(jìn)行50min的hifi-lamp檢測方法,包括使用高保真dna聚合酶和上述引物探針組合,以檢測麻風(fēng)桿菌。
19、所述的方法的檢測結(jié)果的判定方法:通過實(shí)時(shí)熒光檢測系統(tǒng)監(jiān)測hifi-lamp反應(yīng)結(jié)果,30分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯“s”型曲線則判定為陽性。
20、本發(fā)明的有益效果為,
21、1)高靈敏度與特異性:通過設(shè)計(jì)針對(duì)麻風(fēng)桿菌rlep的lamp引物及探針,結(jié)合高保真dna聚合酶,hifi-lamp技術(shù)顯著提高了檢測的靈敏度和特異性,有效解決了傳統(tǒng)lamp檢測中存在的非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽性問題。
22、2)快速檢測:hifi-lamp技術(shù)可在30分鐘內(nèi)完成檢測,相較于qpcr技術(shù),反應(yīng)時(shí)間更短,且檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
23、3)簡便易用:該技術(shù)不依賴特定的熱循環(huán)儀器、專業(yè)的pcr實(shí)驗(yàn)室及專業(yè)操作人員,適用于基層和即時(shí)檢測場景。
24、4)應(yīng)用意義:本發(fā)明的hifi-lamp檢測技術(shù)為麻風(fēng)病的診斷提供了一種有效可靠的方案,有助于麻風(fēng)病的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療,進(jìn)而為全球麻風(fēng)的消除作出貢獻(xiàn)。
25、下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋。
1.檢測麻風(fēng)桿菌引物探針組合,其特征在于,所述引物探針組合包括:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合,其特征在于,所述引物探針組合包括:上游環(huán)狀引物lf、下游環(huán)狀引物lb;
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合,其特征在于,所述引物探針組合包括:熒光探針hfman-probe;
4.一種試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的引物和權(quán)利要求3所述的熒光探針。
5.如權(quán)利要求1或2或3所述的引物探針組合在特異性檢測麻風(fēng)桿菌中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測麻風(fēng)桿菌應(yīng)用的方法,其特征在于,在64℃下進(jìn)行50min的hifi-lamp檢測方法,包括使用高保真dna聚合酶和上述引物探針組合,以檢測麻風(fēng)桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,檢測結(jié)果的判定方法:通過實(shí)時(shí)熒光檢測系統(tǒng)監(jiān)測hifi-lamp反應(yīng)結(jié)果,30分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯“s”型曲線則判定為陽性。