本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體為一種高通量ssr分子標(biāo)記技術(shù)鑒定李雜交后代的方法。

背景技術(shù)：

1、分子鑒定技術(shù)指利用生物體dna或rna水平上的多態(tài)性進(jìn)行鑒定、遺傳分析和基因定位，廣義上指可遺傳并可檢測(cè)的dna序列或蛋白質(zhì)，狹義上指反應(yīng)生物個(gè)體或種群間差異的特異性dna片段，基于個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異，是dna水平遺傳多態(tài)性的直接反饋，主要類型包括基于southem雜交的分子標(biāo)記、以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記以及以pcr為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記等，傳統(tǒng)的ssr分型方法如凝膠電泳和毛細(xì)管電泳等，通量低且依賴于電泳圖譜的相似程度進(jìn)行比較，耗時(shí)費(fèi)力且準(zhǔn)確性有限，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，ssr分子標(biāo)記技術(shù)也實(shí)現(xiàn)了高通量和高進(jìn)準(zhǔn)的分型，為遺傳學(xué)研究提供了更高效的工具，高通量ssr分子標(biāo)記技術(shù)基于擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在單堿基水平上的分型，且能同時(shí)對(duì)多個(gè)品種的數(shù)千個(gè)ssr點(diǎn)位進(jìn)行準(zhǔn)確分型，降低了分型成本和耗時(shí)，提高了分型準(zhǔn)確性，該技術(shù)避免了傳統(tǒng)分型方法中的電泳圖譜比較，實(shí)現(xiàn)了任意兩個(gè)品種間的直接比較，極大提高了工作效率，同時(shí)其豐富的多態(tài)性和高信息量，使得在遺傳育種和基因定位等領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢(shì)；

2、ssr引物的開發(fā)難度大，新的ssr引物的開發(fā)和合成需要較高的投入，技術(shù)難度大，現(xiàn)有ssr標(biāo)記不足，目前可用的ssr標(biāo)記數(shù)量有限，無法覆蓋所有的功能基因，一定程度上限制了ssr分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用范圍，ssr多態(tài)性檢測(cè)受限，ssr多態(tài)性的檢測(cè)核應(yīng)用在很大程度上依賴于pcr擴(kuò)增的效果，pcr擴(kuò)增不理想會(huì)直接影響ssr標(biāo)記的應(yīng)用效果。

3、1、專利文件cn104561332b公開了一種鑒定山楊性別的ssr分子標(biāo)記及其應(yīng)用，上述專利實(shí)現(xiàn)了鑒定的引物特異性極高，穩(wěn)定性極強(qiáng)的ssr引物，不需要進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳片段分離，只需要進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)即可完成對(duì)山楊性別的快速鑒定，為山楊的定向育種提供理論和技術(shù)上的指導(dǎo)，但上述專利不能實(shí)現(xiàn)在鑒定過程中快速提取dna的功能。

4、2、專利文件cn111424108b公開了一種利用ssr分子標(biāo)記鑒定冬青種質(zhì)的方法，上述專利實(shí)現(xiàn)了多態(tài)性檢出率高、分辨率更好、穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)單高效，但上述專利不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)雜質(zhì)和rna進(jìn)行去除的功能。

5、3、專利文件cn108277295b公開了適用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)的一組玉米ssr分子標(biāo)記及其應(yīng)用，上述專利實(shí)現(xiàn)了能夠在基因組水平上拓展了玉米可用標(biāo)記位點(diǎn)的范圍；為玉米品種、種質(zhì)資源鑒定，親緣關(guān)系評(píng)價(jià)，細(xì)胞質(zhì)遺傳特性等研究提供新工具，應(yīng)用前景良好，但上述專利不能實(shí)現(xiàn)對(duì)dna分子變性的功能。

6、4、專利文件cn112029825b公開了花菜類ssr分子標(biāo)記引物的篩選方法及應(yīng)用，上述專利實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建了一種快速、準(zhǔn)確的鑒定我國花椰菜和青花菜品種的方法，為今后花菜類產(chǎn)業(yè)化中種苗純度和真實(shí)性鑒定及種質(zhì)資源管理提供理論依據(jù)，但上述專利不能實(shí)現(xiàn)保障檢測(cè)準(zhǔn)確和降低成本及污染的功能。

7、綜上所述，上述專利不能實(shí)現(xiàn)在鑒定過程中快速提取dna的功能，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)雜質(zhì)和rna進(jìn)行去除的功能，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)dna分子變性的功能，不能實(shí)現(xiàn)保障檢測(cè)準(zhǔn)確和降低成本及污染的功能，導(dǎo)致鑒定過程中dna提取時(shí)間長(zhǎng)降低鑒定效率、樣品中dna雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響、毛細(xì)管電泳過程中dna穩(wěn)定和檢測(cè)效率低、在處理大量樣品時(shí)通量低、耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性較低和廢棄物對(duì)環(huán)境造成污染的問題；

8、為此，本技術(shù)提出了一種能實(shí)現(xiàn)在鑒定過程中快速提取dna的功能，能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)雜質(zhì)和rna進(jìn)行去除的功能，能實(shí)現(xiàn)對(duì)dna分子變性的功能，能實(shí)現(xiàn)保障檢測(cè)準(zhǔn)確和降低成本及污染的功能的高通量ssr分子標(biāo)記技術(shù)鑒定李雜交后代的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高通量ssr分子標(biāo)記技術(shù)鑒定李雜交后代的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的不能實(shí)現(xiàn)在鑒定過程中快速提取dna的功能，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)雜質(zhì)和rna進(jìn)行去除的功能，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)dna分子變性的功能，不能實(shí)現(xiàn)保障檢測(cè)準(zhǔn)確和降低成本及污染的功能，導(dǎo)致鑒定過程中dna提取時(shí)間長(zhǎng)降低鑒定效率、樣品中dna雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響、毛細(xì)管電泳過程中dna穩(wěn)定和檢測(cè)效率低、在處理大量樣品時(shí)通量低、耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性較低和廢棄物對(duì)環(huán)境造成污染的技術(shù)問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種高通量ssr分子標(biāo)記技術(shù)鑒定李雜交后代的方法，一種高通量ssr分子標(biāo)記技術(shù)鑒定李雜交后代的方法，所述高通量ssr分子標(biāo)記鑒定李雜交后代的方法包括：制備ssr引物體系、運(yùn)行ssr-pcr擴(kuò)增程序、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和進(jìn)行毛細(xì)管電泳，所述ssr引物體系包括：去離子水、dntp、buffer、f、r0、dna模板和taq酶，所述dna模板的制備方法為：

3、步驟1：將78個(gè)原始樣品放入裝有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

4、步驟2：向培養(yǎng)基中加入氯霉素；

5、步驟3：使用生理鹽水懸浮并漂洗去殘留培養(yǎng)基；

6、步驟4：加入naoh-sds進(jìn)行裂解；

7、步驟5：加入乙酸鉀恢復(fù)中性后，使用離心法分離雜質(zhì)和dna；

8、步驟6：對(duì)dna進(jìn)行提純，得到dna模板。

9、優(yōu)選的，所述dna模板的制備方法還有：

10、步驟1：準(zhǔn)備1mol/l的nacl溶液、含辛醇的氯仿、0.15mol/l的nacl溶液、蛋白酶k、氯仿、無水乙醇、75％乙醇和去離子水；

11、步驟2：將78個(gè)樣品在0.15mol/l的nacl溶液中破碎；

12、步驟3：加入1mol/l的nacl溶液進(jìn)行提取，得到dnp粘液；

13、步驟4：加入含有辛醇的氯仿進(jìn)行搖蕩乳化；

14、步驟5：離心去除蛋白質(zhì)，回收水相，用2倍體積的95％乙醇將dna鈉鹽沉淀出來；

15、步驟6：使用75％乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌，在室溫中干燥處理；

16、步驟7：加入去離子水溶解dna，得到dna模板。

17、優(yōu)選的，所述對(duì)dna進(jìn)行提純的步驟為：

18、步驟7：準(zhǔn)備蛋白酶k、tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、70％乙醇、te緩沖液和rna酶溶液；

19、步驟8：向制備好的dna中加入蛋白酶k，置于搖床中消化；

20、步驟9：加入等體積的tris飽和酚，搖勻后離心，分離出上層dna層，移入新離心管中；

21、步驟10：在上清液中加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，搖勻后離心，戲曲上層水相；

22、步驟11：在上清液中加入等體積的無水乙醇，混勻后靜置；

23、步驟12：分離出dna，使用70％乙醇洗滌2次，在真空環(huán)境中干燥；

24、步驟13：將干燥后的dna溶于te緩沖液中，加入rna酶溶液進(jìn)行處理，使用酚/氯仿抽提；

25、步驟14：用70％乙醇洗滌2次，在真空環(huán)境中干燥處理，加入te緩沖液溶解dna,制得dna模板。

26、優(yōu)選的，所述鑒定李雜交后代的方法為：

27、步驟1：制備用于pcr反應(yīng)體系的ssr引物體系；

28、步驟2：運(yùn)行ssr-pcr擴(kuò)增程序；步驟3：對(duì)pcr反應(yīng)完成后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

29、步驟4：pcr反應(yīng)后產(chǎn)物在進(jìn)行瓊脂糖電泳抽檢合格后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

30、步驟5：對(duì)毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，得出結(jié)論。

31、優(yōu)選的，所述毛細(xì)管電泳檢測(cè)的方法為：

32、步驟6：將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按100：1的體積比混勻后，取15μl加入樣板中，再加入1μl稀釋10倍的pcr產(chǎn)物；

33、步驟7：使用3730xl測(cè)序儀對(duì)樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

34、步驟8：使用genemarker?v2.2.0軟件中的fragment片段對(duì)測(cè)序儀得到的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；

35、步驟9：將各泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置作比較，得到片段大小。

36、優(yōu)選的，所述瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為：

37、步驟10：向瓊脂糖粉末中加入tae/tbe緩沖液，置于微波爐中加熱至完全融化；

38、步驟11：搖勻倒入模具中，凝固后將膠塊放入電泳槽；

39、步驟12：向電泳槽中加入電泳緩沖液至液面高于膠面2mm；

40、步驟13：抽取pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將產(chǎn)物與上樣緩沖混合，加至加樣孔中；

41、步驟14：接通電泳儀和電泳槽，電壓保持120v，電泳50min；

42、步驟15：停止電泳，取出膠塊，染色后進(jìn)行觀察記錄結(jié)果。

43、優(yōu)選的，所述ssr引物體系共20μl，其中去離子水14.8μl、dntp?0.4μl、buffer?2μl、f?0.3μl、r0.3ul、dna模板2μl和taq酶0.2μl。

44、優(yōu)選的，所述甲酰胺通過抑制dna分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，使dna在電泳過程中保持單鏈狀態(tài)，甲酰胺通過降低核酸分子間的相互作用，減少dna和rna在電泳過程中的構(gòu)象變化。

45、優(yōu)選的，所述ssr-pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變形30s，60℃復(fù)性45s，72℃延伸50s，為一個(gè)循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)，最終在72℃延伸5min。

46、優(yōu)選的，所述瓊脂糖凝膠的濃度為2.0％。

47、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

48、1.本發(fā)明通過設(shè)計(jì)有dna模板，實(shí)現(xiàn)了在鑒定過程中快速提取dna的功能，解決了鑒定過程中dna提取時(shí)間長(zhǎng)降低鑒定效率的問題，能夠滿足大規(guī)模樣本的處理，提高了實(shí)驗(yàn)效率，降低了dna提取的難度，提高了鑒定的準(zhǔn)確性；

49、2.本發(fā)明通過設(shè)計(jì)有對(duì)dna進(jìn)行提純，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)雜質(zhì)和rna進(jìn)行去除的功能，解決了樣品中dna雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響的問題，能夠降低成本，提高dna的純度，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，減少了鑒定時(shí)間；

50、3.本發(fā)明通過設(shè)計(jì)有甲酰胺的加入，實(shí)現(xiàn)了對(duì)dna分子變性的功能，解決了毛細(xì)管電泳過程中dna穩(wěn)定和檢測(cè)效率低的問題，能夠使dna變性為單鏈狀態(tài)，提高了電泳的分離效果和分析的準(zhǔn)確性，能夠穩(wěn)定rna和變性后的單股dna，提高了樣品在電泳過程中的穩(wěn)定性；

51、4.本發(fā)明通過設(shè)計(jì)有瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)現(xiàn)了保障檢測(cè)準(zhǔn)確和降低成本及污染的功能，解決了在處理大量樣品時(shí)通量低、耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性較低和廢棄物對(duì)環(huán)境造成污染的問題，能夠提高鑒定效率，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，簡(jiǎn)化了操作過程，降低了后續(xù)回收樣品的難度，減少了回收成本。