本發(fā)明屬于基因芯片技術(shù)與基因分子育種,具體涉及一種梅花鹿全基因組高密度snp育種芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、隨著遺傳學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,分子標(biāo)記尤其是snp已被廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)植物中。由密集的全基因組snp組成的基因芯片已成為分析基因組信息極有價(jià)值的工具。snp芯片技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)之一是以相對(duì)較低的成本能夠獲得比早期方法更多的信息。此外,它加速了基因組選擇在動(dòng)植物育種中的發(fā)展和應(yīng)用,為動(dòng)物遺傳學(xué)行業(yè)和研究帶來(lái)了革命性的變化,給畜禽育種帶來(lái)了巨大的變化。
2、梅花鹿位居特種畜禽之首,是具有重要經(jīng)濟(jì)和文化價(jià)值的鹿科動(dòng)物之一,全身都是寶。我國(guó)是梅花鹿資源大國(guó)、養(yǎng)殖大國(guó),同時(shí)也是世界鹿產(chǎn)品第一消費(fèi)國(guó)、第一進(jìn)口國(guó)。2020年梅花鹿首次納入《國(guó)家畜禽遺傳資源目錄》,成為33個(gè)畜禽物種之一。但是,我國(guó)梅花鹿產(chǎn)業(yè)從養(yǎng)殖到產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈都存在很大的技術(shù)提升空間,特別是,梅花鹿系譜混亂、育種技術(shù)停留在表型選種階段,嚴(yán)重制約了梅花鹿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了更好促進(jìn)梅花鹿的種業(yè)創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)的健康發(fā)展,充分利用現(xiàn)代分子育種技術(shù),加快提高我國(guó)梅花鹿生產(chǎn)性能,提高產(chǎn)業(yè)收益、降低育種成本,亟待開(kāi)展梅花鹿基因組選擇育種的工作。
3、全基因組選擇是基于基因組育種值(genomic?estimatedbreeding?value,gebv)進(jìn)行的,通過(guò)檢測(cè)覆蓋全基因組的分子標(biāo)記,利用基因組水平的遺傳信息對(duì)個(gè)體進(jìn)行遺傳評(píng)估,以獲得更高的育種值估計(jì)準(zhǔn)確性。對(duì)早期難以度量的性狀進(jìn)行選擇,縮短世代間隔,加速育種進(jìn)程,從而節(jié)約大量的育種成本。全基因組選擇育種須選擇高密度snp芯片,中低密度芯片無(wú)法滿足要求。因此,本領(lǐng)域內(nèi)已有的梅花鹿40k液相snp芯片,不能滿足全基因組選擇育種要求。其位點(diǎn)設(shè)計(jì)僅來(lái)源于東北地區(qū)梅花鹿,且樣本重測(cè)序深度較低。所以,亟需開(kāi)發(fā)遺傳背景更廣泛、密度更高的梅花鹿全基因組育種芯片,以滿足梅花鹿全基因組選擇的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足,為了滿足梅花鹿高通量、低成本基因分型,和滿足梅花鹿全基因組選擇的應(yīng)用以及大規(guī)模商業(yè)化育種需求,本發(fā)明提供了基于靶向捕獲測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)的梅花鹿全基因組100k高密度snp育種芯片,所用snp位點(diǎn)均勻覆蓋染色體組,且代表性強(qiáng)、多態(tài)性高、特異性高、通用性強(qiáng),為梅花鹿高通量基因分型、基因定位、指紋圖譜、全基因組選擇等分子育種研究提供了不可或缺的重要工具。
2、本發(fā)明提供技術(shù)方案如下:
3、第一方面,本發(fā)明提供一種梅花鹿全基因組snp分子標(biāo)記組合,所述全基因組snp分子標(biāo)記組合,包含100,000個(gè)snp分子標(biāo)記,所述100,000個(gè)snp分子標(biāo)記的位點(diǎn)信息在梅花鹿參考基因組mhl_v1.0的位置如表1所示。
4、第二方面,本發(fā)明提供一種梅花鹿全基因組snp靶向捕獲探針,包含所述100,000個(gè)snp分子標(biāo)記位點(diǎn)探針,所述探針是根據(jù)snp分子標(biāo)記合成的5’端帶有生物素基團(tuán)修飾的dna核甘酸序列。
5、第三方面,本發(fā)明提供一種梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片,所述芯片包括所述梅花鹿全基因組snp靶向捕獲探針。
6、優(yōu)選的,所述芯片為液相芯片。
7、進(jìn)一步地,本發(fā)明梅花鹿全基因組100k?snp液相芯片的設(shè)計(jì)和制備方法如下:
8、一、篩選梅花鹿100k?snp位點(diǎn)
9、梅花鹿100k?snp位點(diǎn)通過(guò)下述方法篩選獲?。?/p>
10、1、根據(jù)196個(gè)個(gè)體的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù),比對(duì)到梅花鹿參考基因組(mhl_v1.0),構(gòu)建所有樣本基因組上的snp位點(diǎn)集合,用于目標(biāo)snp位點(diǎn)的挑選;
11、2、對(duì)snp位點(diǎn)集合進(jìn)行如下條件篩選:(1)二態(tài)位點(diǎn)且missingrate<0.1;(2)目標(biāo)位點(diǎn)相鄰位置無(wú)串聯(lián)序列;(3)符合哈德溫伯格平衡;(4)最小等位基因頻率maf>0.05;(5)核苷酸多態(tài)性pi≥0.25;(6)目標(biāo)位點(diǎn)側(cè)翼各60bp特異性高,側(cè)翼120bp范圍內(nèi)不超過(guò)7個(gè)snp。
12、二、設(shè)計(jì)并制備梅花鹿100k?snp位點(diǎn)探針
13、所述梅花鹿全基因組snp靶向捕獲探針的設(shè)計(jì)合成方法是:
14、對(duì)擬選取的候選位點(diǎn)進(jìn)行分型核對(duì),對(duì)ref堿基與參考基因組進(jìn)行比對(duì),去除重復(fù)項(xiàng),保留分型正確位點(diǎn)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)打分。將位點(diǎn)集合提交探針設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行打分,根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)上下游序列的評(píng)估結(jié)果進(jìn)行探針設(shè)計(jì),主要評(píng)估項(xiàng)目包括目標(biāo)位點(diǎn)上下游序列復(fù)雜程度、目標(biāo)位點(diǎn)處于探針中間位置、探針gc含量20%-80%、tm值60-80℃、參考基因組上的比對(duì)次數(shù)(≤5)等多方面綜合評(píng)價(jià),獲得探針長(zhǎng)度為120bp,5’端帶有生物素基團(tuán)修飾的dna核甘酸序列。
15、本發(fā)明還提供所述的梅花鹿全基因組100k?snp芯片的應(yīng)用,所述應(yīng)用包括但不限于:(1)梅花鹿snp位點(diǎn)分型;(2)梅花鹿遺傳背景分析;(3)梅花鹿分子遺傳圖譜構(gòu)建;(4)梅花鹿全基因組關(guān)聯(lián)分析;(5)梅花鹿品種鑒定;(6)梅花鹿分子標(biāo)記輔助選擇育種;(7)梅花鹿全基因組選擇育種。
16、本發(fā)明還提供一種梅花鹿鋸茸重性狀檢測(cè)試劑盒,所述試劑盒包括梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片。
17、所述的梅花鹿鋸茸重性狀檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用,所述應(yīng)用包括但不限于:(1)在梅花鹿品種篩選的應(yīng)用;(2)在梅花鹿品種鑒定中的應(yīng)用;(3)在梅花鹿育種中的應(yīng)用;(4)在梅花鹿種質(zhì)資源保護(hù)中的應(yīng)用;(5)在梅花鹿種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。
18、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
19、1、本發(fā)明snp標(biāo)記組合,代表性強(qiáng)、多態(tài)性高、特異性高、通用性強(qiáng)。
20、本發(fā)明所述的液相芯片是針對(duì)梅花鹿國(guó)內(nèi)外8個(gè)梅花鹿亞種:東北亞種、臺(tái)灣亞種、華南亞種、四川亞種、北海道亞種、本州亞種、屋久島亞種、指名亞種和7個(gè)梅花鹿品種(品系):東大梅花鹿、雙陽(yáng)梅花鹿、東豐梅花鹿、四平梅花鹿、興凱湖梅花鹿、長(zhǎng)白山梅花鹿、敖東梅花鹿的196個(gè)梅花鹿個(gè)體開(kāi)展的全基因組重測(cè)序,位點(diǎn)來(lái)源廣泛、品種覆蓋面全、品種適用性廣,在梅花鹿群體中具有較豐富的多態(tài)性。
21、2、本發(fā)明所述的液相芯片基于靶向捕獲測(cè)序技術(shù),不僅能夠?qū)δ繕?biāo)位點(diǎn)進(jìn)行分型,同時(shí)還可以對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)臨近一定范圍的snp進(jìn)行分型,因此可以獲得更多的分型信息。
22、3、本發(fā)明所述100k高密度snp液相芯片可以通過(guò)直接增減探針的方式對(duì)目標(biāo)snp位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整,與固相芯片相比具有更好的靈活性。
23、4、本發(fā)明所述的液相芯片可以低成本、快速的檢測(cè)出相關(guān)snp標(biāo)記,對(duì)在梅花鹿育種選育方面具有重要意義,使得通過(guò)梅花鹿全基因組100k高密度snp液相芯片普及梅花鹿全基因組選擇分子育種成為可能,將大大提高我國(guó)梅花鹿育種選育進(jìn)程。
1.一種梅花鹿全基因組snp分子標(biāo)記組合,其特征在于,所述全基因組snp分子標(biāo)記組合,包含100,000個(gè)snp分子標(biāo)記,所述100,000個(gè)snp分子標(biāo)記的位點(diǎn)信息在參考基因組mhl_v1.0的位置如說(shuō)明書(shū)表1所示。
2.一種梅花鹿全基因組snp靶向捕獲探針,其特征是,包含權(quán)利要求1所述100,000個(gè)snp分子標(biāo)記位點(diǎn)探針,所述探針是根據(jù)snp分子標(biāo)記合成的5’端帶有生物素基團(tuán)修飾的dna核甘酸序列。
3.一種梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片,其特征在于,所述芯片包括權(quán)利要求2所述的梅花鹿全基因組snp靶向捕獲探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片,其特征在于,所述芯片為液相芯片。
5.一種梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片的設(shè)計(jì)制備方法,其特征是,步驟如下:
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片的設(shè)計(jì)制備方法,其特征是,所述探針設(shè)計(jì)打分主要評(píng)估項(xiàng)目包括目標(biāo)位點(diǎn)上下游序列復(fù)雜程度、目標(biāo)位點(diǎn)處于探針中間位置、探針gc含量20%-80%、tm值60-80℃、參考基因組上的比對(duì)次數(shù)等,多方面綜合評(píng)價(jià),獲得探針長(zhǎng)度為120bp,5’端帶有生物素基團(tuán)修飾的dna核甘酸序列。
7.一種梅花鹿鋸茸重性狀檢測(cè)試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括權(quán)利要求3所述的梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片。
8.權(quán)利要求3所述的梅花鹿全基因組100k高密度snp芯片如下任意應(yīng)用中的用途:(1)梅花鹿snp位點(diǎn)分型;(2)梅花鹿遺傳背景分析;(3)梅花鹿分子遺傳圖譜構(gòu)建;(4)梅花鹿全基因組關(guān)聯(lián)分析;(5)梅花鹿品種鑒定;(6)梅花鹿分子標(biāo)記輔助選擇育種;(7)梅花鹿全基因組選擇育種。
9.權(quán)利要求7所述的梅花鹿鋸茸重性狀檢測(cè)試劑盒在如下任一應(yīng)用中的用途:(1)在梅花鹿品種篩選的應(yīng)用;(2)在梅花鹿品種鑒定中的應(yīng)用;(3)在梅花鹿育種中的應(yīng)用;(4)在梅花鹿種質(zhì)資源保護(hù)中的應(yīng)用;(5)在梅花鹿種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。