本發(fā)明涉及一種藻類的鑒定方法，特別涉及一種產(chǎn)嗅藻類的鑒定方法，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、飲用水嗅味問題在我國廣泛檢出，其中由土臭素(geosmin)引發(fā)的土腥味是主要的嗅味類型，但是常規(guī)的飲用水處理工藝對geosmin難以去除，增加深度處理工藝又會(huì)增加處理成本，并且在geosmin濃度較高時(shí)很難有效去除。雖然從醫(yī)學(xué)角度看，多數(shù)異味物質(zhì)沒有明確毒性，但飲用水中殘留痕量的嗅味物質(zhì)會(huì)引發(fā)消費(fèi)者對飲用水安全的擔(dān)憂，湖庫型水源地水流速度緩慢，水體自凈能力較弱，所以對嗅味物質(zhì)的原位調(diào)控能夠大幅減輕水廠的處理需求，是較為理想的處理方式。

2、在湖庫型水源地中，geosmin主要是由絲狀藍(lán)藻代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性萜類化合物，嗅閾值僅為5-10ng/l。在現(xiàn)有的水源型湖庫中，geosmin超標(biāo)問題此消彼長，階段性出現(xiàn)較多，目前對藻類進(jìn)行的化學(xué)和生物控制方式均存在較大局限性。若水廠專門為了降低geosmin濃度設(shè)置深度處理，需要較高的處理成本，且并非每天都有必要使用，所以原位控制geosmin產(chǎn)嗅藻在水源中的生長和產(chǎn)嗅是更優(yōu)的選擇。而精準(zhǔn)識別geosmin產(chǎn)嗅藻是原位處理geosmin問題的關(guān)鍵。

3、現(xiàn)已查明的geosmin產(chǎn)嗅藻屬包括長孢藻、魚腥藻、鞘絲藻、浮絲藻、念珠藻、顫藻等，多為絲狀藍(lán)藻，這些藍(lán)藻形態(tài)接近，常規(guī)的顯微鏡鏡檢難以區(qū)分，而單獨(dú)分離純藻培養(yǎng)的方法隨機(jī)性大，成功率低，基本不可能實(shí)現(xiàn)對環(huán)境樣品中全部藍(lán)藻的geosmin產(chǎn)嗅情況進(jìn)行鑒定。

4、分子生物方法存在快速、敏感、高通量和能夠進(jìn)行早期診斷等優(yōu)點(diǎn)，能夠從生命的本質(zhì)上研究微生物的表觀現(xiàn)象和功能反應(yīng)。目前已有的研究表明，基因組中是否攜帶geosmin合成酶功能基因(geoa基因)是進(jìn)行產(chǎn)嗅藻識別的關(guān)鍵依據(jù)，對功能基因的定量檢測可以檢出水體中所有的geosmin產(chǎn)嗅藻，但是不能識別出geosmin產(chǎn)嗅藻的不同物種信息。

5、基于分子生物學(xué)的系統(tǒng)發(fā)育基因(如16s?rrna基因)擴(kuò)增子測序僅能用于識別藻類群落結(jié)構(gòu)，不能特定地識別出geosmin產(chǎn)嗅藻。宏基因組測序結(jié)果雖然可以基本拼接到較為完整的基因組信息，但是宏基因組測序研究對象僅為優(yōu)勢物種，而geosmin產(chǎn)嗅藻通常不成為優(yōu)勢物種，且低密度的geosmin產(chǎn)嗅藻已經(jīng)可以造成geosmin超標(biāo)問題，所以目前現(xiàn)有分子生物技術(shù)無法完成環(huán)境樣品中高通量的geosmin產(chǎn)嗅藻精準(zhǔn)識別。

6、單細(xì)胞融合pcr(epicpcr)是一種可以實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞中連接系統(tǒng)發(fā)育基因和功能基因的新型分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)通過添加乳化油和聚丙烯酰胺將水體中的藻類等微生物分散成單細(xì)胞或單藻絲的體系，在這種體系內(nèi)，對該細(xì)胞或該藻絲的系統(tǒng)發(fā)育基因和geoa基因通過融合pcr及巢氏進(jìn)行連接，這樣可以避免某個(gè)藻細(xì)胞或藻絲的geoa基因連接到其他藻細(xì)胞或藻絲的系統(tǒng)發(fā)育基因，最后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，得到功能基因?qū)?yīng)的宿主信息，準(zhǔn)確、高通量的識別出水體中的geosmin產(chǎn)嗅藻種。

7、由于功能基因的不同，目前單細(xì)胞融合pcr方法不能直接用于geosmin產(chǎn)嗅藻的鑒定和識別，因此本發(fā)明通過對geoa基因及16s?rrna基因引物的選擇及擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立針對geosmin產(chǎn)嗅藻的單細(xì)胞融合pcr方法，本發(fā)明針對geosmin產(chǎn)嗅藻的功能基因設(shè)計(jì)融合pcr及巢式pcr的引物及擴(kuò)增條件，精準(zhǔn)識別geosmin產(chǎn)嗅藻(90％以上)。通過環(huán)境樣品中進(jìn)行驗(yàn)證，該方法可以用于環(huán)境樣品中g(shù)eosmin產(chǎn)嗅藻的特異性識別。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有g(shù)eosmin產(chǎn)嗅藻的鑒定和識別過程中存在常規(guī)鏡檢無法準(zhǔn)確區(qū)分產(chǎn)嗅藻種，分離培養(yǎng)方法存在無法培養(yǎng)的藻種，分子鑒定僅能識別藻類群落結(jié)構(gòu)，無法精準(zhǔn)識別水體中產(chǎn)嗅藻種，鑒定不準(zhǔn)確，鑒定存在偏差、pcr擴(kuò)增進(jìn)行鑒定的凝膠電泳檢測時(shí)，存在大量的非特異性擴(kuò)增，鑒定方法的準(zhǔn)確度差、無法全面識別和鑒定geosmin產(chǎn)嗅藻等技術(shù)問題，提供一種環(huán)境水體中產(chǎn)geosmin的藍(lán)藻種類的鑒定方法，本發(fā)明方法基于單細(xì)胞融合pcr技術(shù)，對環(huán)境水體中產(chǎn)geosmin的產(chǎn)嗅藻進(jìn)行精確鑒定和識別，本發(fā)明的鑒定方法將geoa功能基因與系統(tǒng)發(fā)育基因的連接，鑒定方法通量高，成本低，對環(huán)境樣品中絕大多數(shù)geosmin產(chǎn)嗅藻的精準(zhǔn)識別，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度高、且geosmin產(chǎn)嗅藻覆蓋范圍廣、種類齊全、誤差或漏檢率低；另外本發(fā)明方法不需要通過傳統(tǒng)的純藻分離培養(yǎng)的手段，直接在環(huán)境樣品細(xì)胞中(未培養(yǎng)的細(xì)胞)進(jìn)行基因的連接。

2、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供一種鑒定環(huán)境水體中g(shù)eosmin產(chǎn)嗅藻種類的引物，包括：

4、a)融合pcr反應(yīng)引物：

5、融合pcr正向引物f1：5’-tcctaycaragagaagt-3’，seq?id?no.1；

6、融合pcr反向引物r1：5’-ggttaccttgttacgactt-3’，seq?id?no.2；

7、融合pcr搭橋引物：5’-ttaccgcggckgctggcacctgccaatcctgaagtccttt-3’，seq?idno.3；

8、b)巢式pcr反應(yīng)引物：

9、巢式pcr正向引物f2：5’-tgtgagtacccaagagg-3’，seq?id?no.6；

10、巢式pcr反向引物r2：5’-ggactachvgggtwtctaat-3’，seq?id?no.7。

11、特別是，還包括c)blocking?pcr反應(yīng)引物：

12、blocking?pcr正向引物(blockingf)：5’-ttttttttttgtgycagcmgccgcggtaa-3’，seq?id?no.4；

13、blocking?pcr反向引物(blockingr)：5’-ttttttttttttaccgcggckgctgrcac-3’，seq?id?no.5。

14、特別是，所述引物按照如下方法篩選：

15、1)針對geosmin產(chǎn)嗅藻的產(chǎn)嗅功能基因geoa端，查閱文獻(xiàn)，檢索針對geoa基因的引物；

16、2)使用primer?premier?5對ncbi中已收錄的3種典型geosmin產(chǎn)嗅藻類的geoa基因序列，設(shè)計(jì)引物，其中引物長度控制在16到24bp，gc含量在40％-60％之間，且所述3種典型藻類geoa基因序列在ncbi中分別如下：

17、hq404997.1anabaena?ucrainica?chab2155?geosmin?synthesis?operon,complete?sequence；

18、lc739811.1dolichospermum?planctonicum?b-18geoa?gene?for?geosminsynthase,partial?cds；

19、mk124614.1nostoc?sp.turkeygeo1?geosmin?synthase?gene,partial?cds；

20、3)從中篩選出覆蓋至少兩種基因型的引物；并對篩選的引物對通過在ncbi的blast比對，獲得對產(chǎn)geosmin的藍(lán)藻覆蓋度高的引物對173af、173ar，其中173a引物對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因型的堿基序列為seq?id?no.9；引物173af、173ar的堿基序列為：seq?id?no.6，seqid?no.10。

21、特別是，還包括使用篩選的引物，對與篩選的引物存在兩個(gè)或以上堿基差異八種產(chǎn)嗅基因型進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，驗(yàn)證篩選獲得的引物對173af、173ar可行，且對產(chǎn)geosmin的藍(lán)藻覆蓋度最大。

22、特別是，所述的八種產(chǎn)嗅基因型在ncbi中的序列編號、在序列中的位置如下：

23、

24、又一方面，提供一種環(huán)境水體中g(shù)eosmin產(chǎn)嗅藻種類的鑒定方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟：

25、a、制備環(huán)境水樣的細(xì)胞凝珠

26、a-1)將采集的環(huán)境水體水樣、丙烯酰胺溶液和過硫酸銨溶液混勻后加入stt乳化油；接著再加入四甲基乙二胺，混勻，靜置狀態(tài)下，進(jìn)行丙烯酰胺聚合反應(yīng)，制成包裹水體中藻類細(xì)胞的聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠混合液；

27、a-2)對聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠混合液依次進(jìn)行水飽和乙醚清洗、超純水洗滌后向聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠加入1×tk緩沖液，形成聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠tk懸液，然后采用細(xì)胞過濾器進(jìn)行過濾，制得純化聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠tk懸液；

28、b、細(xì)胞溶解處理

29、向純化聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠tk懸液中添加溶菌酶，溶解藻類細(xì)胞細(xì)胞壁后加入蛋白酶k和tritonx-100，酶解去除與核酸結(jié)合的組蛋白，使藻類細(xì)胞dna游離，以及破壞藻類細(xì)胞細(xì)胞膜，使得藻類細(xì)胞基因組暴露在聚丙烯酰胺凝珠殼內(nèi)，獲得細(xì)胞溶解聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠；

30、c、epicpcr處理(即三步pcr反應(yīng))

31、以細(xì)胞溶解聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠為模板依次進(jìn)行融合pcr反應(yīng)、blocking?pcr反應(yīng)、巢式pcr反應(yīng)；并對獲得的巢式pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，產(chǎn)物中融合pcr的搭橋引物和巢式反向引物之間的擴(kuò)增片段為目標(biāo)16s?rrna基因，即攜帶geoa基因的藍(lán)藻物種信息，將擴(kuò)增獲得的16s?rrna基因與ncbi數(shù)據(jù)庫的基因組序列進(jìn)行比對，獲知攜帶產(chǎn)geosmin的geoa基因的藻類，即鑒定出環(huán)境水體中產(chǎn)geosmin的藍(lán)藻種類。

32、特別是，步驟a-1)中所述stt乳化油按照如下方法制備而成：將span-80、tween-80、tritonx-100溶于礦物油，其中span-80的體積分?jǐn)?shù)為4.5％，tween-80的體積分?jǐn)?shù)為0.4％,tritonx-100的體積分?jǐn)?shù)為0.05％。

33、特別是，步驟a-1)中所述環(huán)境水體水樣中細(xì)胞濃度為：30微升水樣中包含的細(xì)胞個(gè)數(shù)≤1400萬個(gè)，優(yōu)選為30微升水樣中包含的細(xì)胞個(gè)數(shù)1000-1400萬個(gè)。

34、特別是，所述環(huán)境水體水樣按照如下方法制備而成：

35、a-1-1)采用1.2μm濾膜對采集的環(huán)境水體水液進(jìn)行過濾，用超純水將濾膜上細(xì)胞收集，制成水樣細(xì)胞懸浮液；

36、a-1-2)將水樣細(xì)胞懸浮液與atp提取劑于(38±1)℃下分別預(yù)熱至少1min；接著將預(yù)熱后的水樣細(xì)胞懸浮液與atp提取劑混合，并于(38±1)℃下再加熱20-30s，然后測定混合液的生物發(fā)光度a；

37、a-1-3)將測定的生物發(fā)光度帶入atp-生物發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得水樣細(xì)胞懸浮液的atp濃度；

38、a-1-4)按照每個(gè)細(xì)胞平均atp質(zhì)量為10-16g的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算水樣細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞數(shù)量；其中：

39、如果測定的水樣細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞濃度為30微升水樣中包含的細(xì)胞個(gè)數(shù)≤1400萬個(gè)，則直接將水樣細(xì)胞懸浮液作為環(huán)境水體水樣；

40、如果測定的水樣細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞濃度為30微升水樣中包含的細(xì)胞個(gè)數(shù)>1400萬個(gè)，則對水樣細(xì)胞懸浮液進(jìn)行稀釋，測定稀釋后的水樣細(xì)胞懸浮液與atp提取劑混合液的生物發(fā)光度，并按照atp-生物發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線再計(jì)算稀釋后的水樣細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞數(shù)量，直至30微升水樣中包含的細(xì)胞個(gè)數(shù)≤1400萬個(gè)，然后以稀釋后的水樣細(xì)胞懸浮液作為環(huán)境水體水樣。

41、特別是，步驟a-1)中所述環(huán)境水體水液為水庫、湖泊、河流或海洋的水液。環(huán)境水體水樣中的藍(lán)藻細(xì)胞過濾并富集至濾膜上。

42、特別是，步驟a-1-2)中采用glomax?20/20發(fā)光儀測定混合液的生物發(fā)光度；水樣細(xì)胞懸浮液與atp提取劑的體積之比為10:1，通常為水樣細(xì)胞懸浮液為500μl，atp提取劑為50μl。

43、特別是，步驟a-1-3)中所述atp-生物發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線按照如下方法繪制：

44、a-1-3-1)用不含atp(adenosine?triphosphate，腺嘌呤核苷三磷酸)的無菌水稀釋純atp標(biāo)準(zhǔn)液至不同濃度梯度(通常為0.00005-1nm，優(yōu)選為0.00005、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1nm)，獲得atp稀釋液；

45、a-1-3-2)在(38±1)℃下，將不同濃度atp稀釋液、atp提取劑分別預(yù)熱至少1min；接著分別將預(yù)熱后的，不同濃度的atp稀釋液分別與atp提取劑混合，再于(38±1)℃下加熱20-30s；然后測定各不同濃度的atp稀釋液的生物發(fā)光度(a)；

46、a-1-3-3)以atp稀釋液的atp濃度(b)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，生物發(fā)光強(qiáng)度(a)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制atp濃度與生物發(fā)光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)，即atp-生物發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，

47、log?a＝?k?×?log?b?+?b?????????(1)

48、式(1)中：a：生物發(fā)光強(qiáng)度；b：atp濃度，mol/l；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，k＝0.7501；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，b＝12.943；r2＝0.971,p<0.01。

49、尤其是，所述atp標(biāo)準(zhǔn)液濃度10mm；promega?corporation。

50、尤其是，步驟a-1-3-2)中atp稀釋液與atp提取劑的體積之比為10:1，通常為atp稀釋液為500μl，atp提取劑為50μl；采用發(fā)光儀(glomax?20/20，turner?bio-systems,sunnyvale,ca,usa))測定所述的生物發(fā)光度。

51、其中，步驟a-1)中所述環(huán)境水體水樣、丙烯酰胺溶液和過硫酸銨溶液的體積之比為30:200:25，通常環(huán)境水體水樣的體積為30μl；丙烯酰胺溶液的體積為200μl；過硫酸銨溶液的體積為25μl；加入stt乳化油之后，渦旋處理至液體呈乳白色，使得水樣中的細(xì)胞充分分散，且使得加入的乳化油、聚丙烯酰胺充分包裹單個(gè)細(xì)胞。

52、特別是，所述丙烯酰胺水溶液按照如下方法制備而成：將丙烯酰胺和bac(n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺，n,n'-methylenebisacrylamide)溶于無菌水中，其中丙烯酰胺，bac的的質(zhì)量-體積百分比濃度分別為12％，0.32％，例如100毫升無菌水中溶解12g丙烯酰胺和0.32g?bac。

53、丙烯酰胺溶液中丙烯酰胺的質(zhì)量百分比濃度為10-15％；bac的質(zhì)量百分比濃度為0.3-0.4％均適用于本發(fā)明；過硫酸銨溶液的質(zhì)量百分比濃度為5-15％均適用于本發(fā)明。

54、特別是，所述過硫酸銨水溶液的質(zhì)量百分比濃度為10％，按照如下方法配制而成：將過硫酸銨溶于無菌水中，其中過硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％。

55、其中，所述環(huán)境水體水樣與stt乳化油的體積之比為30:600，通常環(huán)境水體水樣的體積為30μl；stt乳化油的體積為600μl。

56、特別是，所述stt乳化油按照如下方法制備而成：將span-80、tween-80、tritonx-100溶于礦物油，攪拌混勻，其中span-80的體積分?jǐn)?shù)為4.5％，tween-80的體積分?jǐn)?shù)為0.4％,tritonx-100的體積分?jǐn)?shù)為0.05％。

57、其中，所述環(huán)境水體水樣與四甲基乙二胺的體積之比為30:25，通常環(huán)境水體水樣的體積為30μl；四甲基乙二胺的體積為25μl。

58、特別是，于室溫下靜置至少90min，四甲基乙二胺催化丙烯酰胺聚合為聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺和過硫酸銨成為包裹單個(gè)細(xì)胞的外殼，形成包裹單個(gè)細(xì)胞的聚丙烯酰胺凝珠。

59、特別是，步驟a-2)中所述1×tk緩沖液由40mmol/l的tris-hcl(ph?7.5)和120mmol/l氯化鉀溶液，按體積比1：1混合而成。

60、特別是，步驟a-2)中所述水飽和乙醚清洗、超純水洗滌按照如下方法進(jìn)行：向聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠混合液中加入水飽和乙醚，混勻后，移走上層化合物；接著向下層沉淀物中加入超純水，進(jìn)行超純水洗滌，即向含有聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠的下層混合層中加入超純水，混勻后離心處理并移走上層混合液；然后再向下層沉淀物層中加入超純水，混合后離心并移走上層混合液；重復(fù)加入超純水進(jìn)行超純水洗滌處理2-4次，獲得超純水洗滌聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠混合液。

61、特別是，采用注射器通過35μm的細(xì)胞過濾器過濾聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠tk懸液，聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠過濾至新的離心管中，獲得所述的純化聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠tk懸液。

62、尤其是，所述1×tk緩沖液由40mmol/l的tris-hcl(ph?7.5)和120mmol/l氯化鉀溶液，按體積比1：1混合而成?；旌弦哼^0.2微米的濾膜后使用。

63、特別是，步驟a-2)中加入超純水洗滌過程中，混勻，離心，上層為水油混合物，下層為含有聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠層。

64、特別是，步驟b)中加入溶菌酶后，于37±1℃下培養(yǎng)8-12h后進(jìn)行離心處理，并移除上清液；然后再加入1×tk緩沖液，重新懸浮凝珠后再加入所述的蛋白酶k和tritonx-100。

65、其中，步驟b)中加入蛋白酶k和tritonx-100后，于(37±1)℃下培養(yǎng)30-45min；接著于(95±1)℃培養(yǎng)10-20min后進(jìn)行離心處理，并移除上清；然后再加入1×tk緩沖液，重新懸浮凝珠，獲得細(xì)胞溶解聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠。

66、特別是，所述溶菌酶的酶活力為4000u/μl；所述蛋白酶k的濃度為1mg/ml。

67、尤其是，重復(fù)加入蛋白酶k和tritonx-100的次數(shù)為2-3次，以酶解去除與核酸結(jié)合的組蛋白，使藻類細(xì)胞dna游離，以及破壞藻類細(xì)胞細(xì)胞膜。

68、特別是，在加入溶菌酶后，于37℃培養(yǎng)過夜并進(jìn)行離心處理，然后去除離心后的上清；向離心下層中加入1×tk緩沖液，重新懸浮聚丙烯酰胺凝珠，獲得溶菌酶溶解聚丙烯酰胺凝珠懸液；

69、特別是，在向溶菌酶溶解聚丙烯酰胺凝珠懸液中加入蛋白酶k和tritonx-100，于37℃培養(yǎng)30?-40min，然后95℃培養(yǎng)10-20min；再進(jìn)行離心處理并移除上清；然后向離心下層中加入1×tk緩沖液，重新懸浮聚丙烯酰胺凝珠，獲得細(xì)胞溶解聚丙烯酰胺凝珠重懸液。

70、特別是，步驟c)中所述的epic-pcr處理按照如下順序進(jìn)出的步驟進(jìn)行：

71、c-1)融合pcr反應(yīng)

72、以細(xì)胞溶解聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠為模板進(jìn)行融合pcr反應(yīng)，制得融合pcr反應(yīng)產(chǎn)物，即融合pcr純化dna，其中融合pcr反應(yīng)的引物為：

73、融合pcr正向引物f1(geo_cya728f)：5’-tcctaycaragagaagt-3’；

74、融合pcr反向引物r1(1492r)：5’-ggttaccttgttacgactt-3’；

75、融合pcr搭橋引物(515r-173ar)：5’-ttaccgcggckgctggcacctgccaatcctgaagtccttt-3’；

76、c-2)blocking?pcr反應(yīng)

77、以融合pcr產(chǎn)物為模板進(jìn)行blocking?pcr反應(yīng)，獲得blocking?pcr反應(yīng)產(chǎn)物，即blocking?pcr純化dna；

78、c-3)巢式pcr反應(yīng)

79、以blocking?pcr反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式pcr反應(yīng)，獲得巢式pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；其中巢式pcr反應(yīng)的引物為：

80、巢式pcr正向引物f2(173af)：5’-tgtgagtacccaagagg-3’；

81、巢式pcr反向引物r2(806r)：5’-ggactachvgggtwtctaat-3’。

82、特別是，步驟c)中所述融合pcr反應(yīng)還包括向融合pcr反應(yīng)體系中加入abil油，混合均勻后，再進(jìn)行融合pcr擴(kuò)增反應(yīng)，其中，所述abil油按照如下方法制備而成：em90和tritonx-100溶于礦物油中，其中em90的體積百分比濃度為4％；tritonx-100的體積百分比濃度為0.05％。

83、特別是，所述融合pcr反應(yīng)體系與abil油的體積之比為1:9，通常融合pcr反應(yīng)體系的體積為100μl；abil油的體積為900μl。

84、特別是，融合pcr反應(yīng)體系為：2×hi-fipcr?mix?50μl，正向引物(濃度為50μm，2μl)，反向引物(濃度為50μm，2μl)，搭橋引物(濃度為1μm，1μl)，模板(步驟c制備的細(xì)胞溶解聚丙烯酰胺-細(xì)胞凝珠，45μl)。

85、尤其是，融合pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性階段95℃，持續(xù)5min；高溫變性95℃，持續(xù)25s；低溫退火56℃，持續(xù)25s；延伸階段68℃，持續(xù)2min，反應(yīng)共35個(gè)循環(huán)。終延伸階段68℃，持續(xù)5min。

86、特別是，還包括步驟c-1)，對融合pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行清洗處理，即融合pcr擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在融合pcr反應(yīng)產(chǎn)物體系中加入終濃度為1mm的edta，制得融合pcr產(chǎn)物乳化體系；接著對融合pcr產(chǎn)物乳化體系進(jìn)行離心處理，去除上層油相；然后對下層水相分別依次使用水飽和乙醚、水飽和乙酸乙酯進(jìn)行溶劑清洗處理；再然后對溶劑清洗處理后獲得聚丙烯酰胺凝珠釋放細(xì)胞dna進(jìn)行磁珠清洗，獲得所述的融合pcr純化dna。

87、尤其是，所述溶劑清洗處理是分別依次加入水飽和乙醚、水飽和乙酸乙酯后，離心處理后吸棄離心上層液體。

88、特別是，所述磁珠清洗(dna?purification?by?ampure?xp?beads)按照如下步驟進(jìn)行：將ampure?xp磁珠充分搖勻，并平衡至室溫(即室溫下放置10-30min)；向裝有聚丙烯酰胺凝珠釋放細(xì)胞dna的離心管內(nèi)加入平衡至室溫的ampure?xp磁珠，其中每100μl聚丙烯酰胺凝珠釋放細(xì)胞dna樣品中加入85.5μl磁珠，輕輕混勻，在室溫下放置至少10min；將離心管置于磁珠磁力清洗架上2-5min，保持離心管放置在磁力架上，并用移液槍吸出離心管內(nèi)的懸液并丟棄；接著用70％乙醇清洗磁珠2-5次，然后，打開離心管蓋子，風(fēng)干15-30min，直至磁珠表面干燥；再接著取下離心管，并向離心管內(nèi)加入無菌水，輕輕混勻，在室溫中放置7-15min；最后再將離心管放置于磁珠磁力清洗架上2-5min，收集懸液；獲得融合pcr純化dna。

89、特別是，步驟c-2)中所述blocking?pcr反應(yīng)的引物為：

90、blocking?pcr正向引物(blockingf)：5’-ttttttttttgtgycagcmgccgcggtaa-3’；

91、blocking?pcr反向引物(blockingr)：5’-ttttttttttttaccgcggckgctgrcac-3’。

92、特別是，blocking?pcr反應(yīng)體系為：2×pcr?taq?mastermix?with?dye(50μl)，正向引物(濃度為100μm，3.2μl)，反向引物(濃度為100μm，3.2μl)，模板(融合pcr純化dna，40μl)，ddh2o(3.6μl)。

93、特別是，blocking?pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性階段95℃，持續(xù)5min；高溫變性95℃，持續(xù)45s；低溫退火55℃，持續(xù)45s；延伸階段72℃，持續(xù)1min，反應(yīng)共35個(gè)循環(huán)。終延伸階段72℃，持續(xù)10min。

94、特別是，還包括步驟c-2-1)：對blocking?pcr擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物體系進(jìn)行磁珠清洗處理：將裝有blocking?pcr反應(yīng)產(chǎn)物體系的離心管置于磁珠磁力清洗架上，保持離心管放置在磁力架上，并用移液槍吸出離心管內(nèi)的懸液并丟棄；接著用70％乙醇清洗磁珠2-5次，然后，打開離心管蓋子，風(fēng)干15-30min，直至磁珠表面干燥；再接著取下離心管，并向離心管內(nèi)加入無菌水，輕輕混勻，在室溫中放置7-15min；最后再將離心管放置于磁珠磁力清洗架上2-5min，收集懸液，獲得blocking?pcr純化dna。

95、blocking?pcr去掉未融合的dna片段，防止未融合dna片段在巢式pcr繼續(xù)擴(kuò)增，即未實(shí)現(xiàn)geoa基因和16s基因連接的dna片段與blocking引物結(jié)合后，通過后續(xù)的磁珠清洗去掉。磁珠清洗的目的是去掉非dna的成分或者短片段的dna，防止對后續(xù)pcr產(chǎn)生影響。

96、特別是，步驟c-3)中巢式pcr反應(yīng)體系為：2×pcr?taq?mastermix?with?dye(50μl)，正向引物(濃度為20μm，3μl)，反向引物(濃度為20μm，3μl)，模板(blocking?pcr純化dna，40μl)，ddh2o(4μl)。

97、特別是，巢式pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性階段95℃，持續(xù)5min；高溫變性95℃，持續(xù)45s；低溫退火56℃，持續(xù)45s；延伸階段72℃，持續(xù)1min，反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。終延伸階段72℃，持續(xù)10min。

98、融合pcr獲得16s?rrna基因和geoa基因連接的長片段，巢式pcr是分別選擇geoa基因和16s?rrna基因的兩個(gè)引物，將中間部分dna進(jìn)行擴(kuò)增。一方面提高擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量，另一方面相比融合pcr縮短了擴(kuò)增片段長度，以進(jìn)行后續(xù)的高通量測序。

99、巢式pcr的目的是縮短融合pcr產(chǎn)物長度，在geoa基因的中部和16s?rrna基因的中部各選擇一個(gè)引物擴(kuò)增其中間部分，縮短長度之后繼續(xù)進(jìn)行下一步的高通量測序，否則片段太長。產(chǎn)物是173af到806r的片段。

100、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和好處：

101、1、本發(fā)明篩選的融合pcr、巢式pcr反應(yīng)的引物的特異性高，經(jīng)測序驗(yàn)證可以用于geosmin產(chǎn)嗅藻的精準(zhǔn)識別和鑒定。

102、2、本發(fā)明方法在我國于橋水庫環(huán)境樣品中應(yīng)用，測序結(jié)果表明該方法可以實(shí)現(xiàn)功能基因(geoa基因)與16s基因的連接，達(dá)到識別geosmin產(chǎn)嗅藻的目的。

103、3、相比于純藻分離鑒定及宏基因方法，該方法成本低，通量高，可以實(shí)現(xiàn)環(huán)境樣品中g(shù)eosmin產(chǎn)嗅藻的精準(zhǔn)識別。

104、傳統(tǒng)的鑒別水體中的產(chǎn)geosmin藍(lán)藻的方法為純藻分離培養(yǎng)及geosmin檢測，由于水體中藍(lán)藻種類眾多且存在不可培養(yǎng)的藻種，該方法隨機(jī)性較大，成功率低，鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性差，基本無法實(shí)現(xiàn)將環(huán)境樣品中全部藍(lán)藻進(jìn)行分離并鑒定geosmin產(chǎn)生情況。宏基因組測序研究對象僅為優(yōu)勢物種，不適用于通常不成為優(yōu)勢物種的產(chǎn)嗅藻。

105、而由于本發(fā)明方法是在未培養(yǎng)的細(xì)胞中連接geoa基因和系統(tǒng)發(fā)育基因，不受限于細(xì)胞是否可培養(yǎng)，可以用于識別絕大多數(shù)geosmin產(chǎn)嗅藻。