本發(fā)明涉及生物發(fā)酵，尤其涉及一種表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白廣泛分布于動物結(jié)締組織的一組蛋白質(zhì)家族，約占人體蛋白總量的三分之一。對維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復(fù)有重要作用。膠原蛋白因具有良好的物理性能和生物學(xué)特性，在醫(yī)藥、組織工程、食品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

2、目前各領(lǐng)域所用膠原蛋白主要采用酸、堿水解法或酶解法從動物皮、結(jié)締等組織中提取獲得，但這些方法制取的膠原蛋白難分離到純品，且在臨床上易造成致病污染和出現(xiàn)排異反應(yīng)，使其在醫(yī)藥應(yīng)用方面受到很大限制。針對以上遇到問題，利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)人ⅲ型重組人源膠原蛋白是一種更優(yōu)質(zhì)、更安全的新型膠原蛋白材料，且分子量確定，生產(chǎn)過程條件溫和，利于保持其生物活性。

3、但是利用基因重組技術(shù)表達(dá)天然人膠原蛋白也存在一些問題，譬如，通過畢赤酵母發(fā)酵獲得分泌型蛋白，在發(fā)酵過程中還存在表達(dá)量低的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中通過畢赤酵母發(fā)酵獲得分泌型蛋白表達(dá)量低的問題，本發(fā)明提供一種表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝以ph反彈和不反彈做為指標(biāo)，發(fā)酵反彈后，菌體生長明顯增快，蛋白表達(dá)較高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中通過畢赤酵母發(fā)酵獲得分泌型蛋白表達(dá)量低的問題。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，包括如下步驟：將畢赤酵母發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)至甘油培養(yǎng)階段，甘油流加結(jié)束后，待ph反彈，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段。

4、可選地，甘油流加結(jié)束后，待ph反彈至5.04以上，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段。

5、可選地，發(fā)酵培養(yǎng)至甘油培養(yǎng)階段，待培養(yǎng)至菌體od600范圍為100-150、150-180、180-200或200-240時甘油流加結(jié)束。

6、可選地，發(fā)酵培養(yǎng)至甘油培養(yǎng)階段后，待培養(yǎng)至菌體od600范圍為180-200時甘油流加結(jié)束。

7、可選地，所述畢赤酵母為表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的畢赤酵母，保藏編號為cctcc?m?20242213。

8、可選地，所述畢赤酵母發(fā)酵種子液的od600范圍為15-25。

9、可選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為：85％h3po426.7ml/l；caso4·2h2o?0.93g/l；k2so418.2g/l；mgso4·7h2o?14.9g/l；koh?4.13g/l；甘油40.0g/l；ptm1溶液4ml/l。

10、可選地，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃。

11、可選地，所述甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段溶氧為20％-30％。

12、本發(fā)明的有益效果是：

13、本發(fā)明提供的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，待甘油流加結(jié)束后，以ph反彈為指標(biāo)，待ph反彈后再開始甲醇誘導(dǎo)，使得菌體生長明顯增快，蛋白表達(dá)量提高，從而使得ⅲ型重組人源膠原蛋白能夠工業(yè)化生產(chǎn)，有助于為企業(yè)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價值。

技術(shù)特征：

1.一種表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，包括如下步驟：將畢赤酵母發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)至甘油培養(yǎng)階段，甘油流加結(jié)束后，待ph反彈，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段。

2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，甘油流加結(jié)束后，待ph反彈至5.04以上，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段。

3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)至甘油培養(yǎng)階段，待培養(yǎng)至菌體od600范圍為100-150、150-180、180-200或200-240時甘油流加結(jié)束。

4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)至甘油培養(yǎng)階段后，待培養(yǎng)至菌體od600范圍為180-200時甘油流加結(jié)束。

5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述畢赤酵母為表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的畢赤酵母，保藏編號為cctcc?m20242213。

6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述畢赤酵母發(fā)酵種子液的od600范圍為15-25。

7.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為：85％h3po4?26.7ml/l；caso4·2h2o0.93g/l；k2so4?18.2g/l；mgso4·7h2o?14.9g/l；koh?4.13g/l；甘油40.0g/l；ptm1溶液4ml/l。

8.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃。

9.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段溶氧為20％-30％。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達(dá)Ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，包括如下步驟：將畢赤酵母發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)至甘油培養(yǎng)階段，甘油流加結(jié)束后，待pH反彈，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段。本發(fā)明提供的表達(dá)Ⅲ型重組人源膠原蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝，待甘油流加結(jié)束后，以pH反彈為指標(biāo)，待pH反彈后再開始甲醇誘導(dǎo)，使得菌體生長明顯增快，蛋白表達(dá)量提高，從而使得Ⅲ型重組人源膠原蛋白能夠工業(yè)化生產(chǎn)，有助于為企業(yè)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價值。

技術(shù)研發(fā)人員：王帥靜,褚加冕,吳建國,馮婷婷,沈啟超
受保護(hù)的技術(shù)使用者：泰州市榕興醫(yī)療用品股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26