本發(fā)明涉及免疫細胞治療領(lǐng)域，具體地涉及評估工程化自然殺傷細胞的特異性殺傷能力的方法。

背景技術(shù)：

1、自然殺傷細胞(natural?killer?cell，nk細胞)是一種先天淋巴細胞，最初發(fā)現(xiàn)它們具有主動自發(fā)殺死靶細胞的能力，這對控制病毒感染和消除惡性細胞至關(guān)重要。nk細胞可以通過獨特的機制識別腫瘤細胞，這種機制依賴于nk細胞的激活和抑制受體，這些受體能夠識別腫瘤細胞是否表達相關(guān)配體，如果腫瘤細胞表達相關(guān)配體，那么將活化nk細胞，使其具有迅速殺死腫瘤細胞的能力。

2、激活后的nk細胞會釋放穿孔素和顆粒酶，這些細胞毒性顆粒會直接裂解腫瘤細胞。不僅如此，nk細胞也可以通過死亡受體介導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，包括腫瘤壞死因子(tnf)相關(guān)的細胞凋亡誘導(dǎo)配體(trail)和fas配體(fasl)。在早期臨床試驗已經(jīng)證明了nk細胞的總體安全性，即使在同種異體環(huán)境中也是如此。nk細胞不需要hla匹配。它們以抗原非依賴性方式起作用的能力使其成為“現(xiàn)成”療法的可行選擇，這種療法可以大規(guī)模生產(chǎn)并易于分發(fā)給癌癥患者。

3、對nk細胞毒性的檢測反映了nk細胞殺傷腫瘤的活性，適合的評價nk細胞藥物在體外殺傷能力的方法將會助力于nk細胞藥物的開發(fā)。因此評估nk細胞細胞毒性的方法是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床研究中非常重要的工作。

4、目前常見的對免疫細胞毒性功能的評估手段包括熒光素酶(luciferase)報告基因法、基于流式的檢測方法、實時無標記細胞分析儀(rtca)、乙錠攝取及臺盼藍染料排除試驗(eutda)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)、mtt法和cr51放射性同位素法等。但上述方法適用的條件有限，且大多是終點法，無法實現(xiàn)實時動態(tài)的檢測。

5、因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種更具通用性、能實現(xiàn)實時動態(tài)地評估細胞多輪殺傷能力的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是提供一種更具通用性、能實現(xiàn)實時動態(tài)地評估細胞多輪殺傷能力的方法。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種實時動態(tài)檢測效應(yīng)細胞殺傷能力的方法，包括步驟：

3、a.構(gòu)建穩(wěn)定表達熒光蛋白的靶細胞；

4、b.提供待檢測的效應(yīng)細胞；將步驟a中的靶細胞分為實驗組和對照組，實驗組中加入所述效應(yīng)細胞進行共培養(yǎng)，對照組中僅含有靶細胞，實驗組和對照組的其他實驗條件保持一致；

5、c.在共培養(yǎng)過程中的一個或多個時間點，檢測實驗組和對照組中熒光蛋白的熒光強度；對于每個時間點，實驗組熒光強度記為r1，對照組熒光強度記為r0，用如下式i的公式計算該時間點的細胞殺傷能力c：

6、c(％)＝(1-r1/r0)×100％(式i)。

7、在另一優(yōu)選例中，步驟c進一步包括：計算多個時間點的細胞殺傷能力，并繪制細胞殺傷能力隨時間變化的曲線圖。

8、在另一優(yōu)選例中，步驟a進一步包括：

9、a1.構(gòu)建帶有熒光蛋白編碼基因的重組載體；

10、a2.將所述重組載體轉(zhuǎn)染至靶細胞；

11、a3.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，得到穩(wěn)定表達所述熒光蛋白的靶細胞。

12、在另一優(yōu)選例中，步驟b中，加入的效應(yīng)細胞與靶細胞的比例e:t為(0.1:1)～(10:1)。

13、在另一優(yōu)選例中，加入的效應(yīng)細胞與靶細胞的比例e:t為(0.3:1)～(9:1)。

14、在另一優(yōu)選例中，加入的效應(yīng)細胞與靶細胞的比例e:t為(1:1)～(9:1)。

15、在另一優(yōu)選例中，加入的效應(yīng)細胞與靶細胞的比例e:t為(3:1)～(9:1)。

16、在另一優(yōu)選例中，所述熒光蛋白為綠色熒光蛋白(gfp)。

17、在另一優(yōu)選例中，所述重組載體為質(zhì)?；虿《据d體。

18、在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒帶有供篩選用的抗性基因，例如puro抗性基因。

19、在另一優(yōu)選例中，所述重組載體為慢病毒載體。

20、在另一優(yōu)選例中，所述轉(zhuǎn)染為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

21、在另一優(yōu)選例中，所述轉(zhuǎn)染方法包括：病毒轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、或其組合。

22、在另一優(yōu)選例中，所述病毒轉(zhuǎn)染包括慢病毒轉(zhuǎn)染。

23、在另一優(yōu)選例中，所述靶細胞為腫瘤細胞。

24、在另一優(yōu)選例中，所述靶細胞為k562細胞或nalm6細胞。

25、在另一優(yōu)選例中，所述靶細胞為貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的腫瘤細胞。

26、在另一優(yōu)選例中，步驟b中，所述效應(yīng)細胞為經(jīng)過基因工程化改造或未經(jīng)改造的選自下組的細胞：nk細胞、t細胞、或其組合。

27、在另一優(yōu)選例中，所述效應(yīng)細胞為經(jīng)過基因工程化改造或未經(jīng)改造的nk細胞。

28、在另一優(yōu)選例中，所述nk細胞包括：多能干細胞來源的nk細胞、外周血來源的nk細胞、臍帶血來源的nk細胞。

29、在另一優(yōu)選例中，所述nk細胞為多能干細胞來源的nk細胞，優(yōu)選地為誘導(dǎo)多能干細胞(ipsc)來源的nk細胞。

30、在另一優(yōu)選例中，所述基因工程化改造包括：在細胞基因組中引入外源基因、將外源載體遞送進細胞、表達外源蛋白、在細胞基因組中敲除預(yù)定的內(nèi)源基因等。

31、在另一優(yōu)選例中，所述基因工程化改造為表達嵌合抗原受體(car)。

32、在另一優(yōu)選例中，所述效應(yīng)細胞為嵌合抗原受體-nk(car-nk)細胞。

33、在另一優(yōu)選例中，步驟b中，每組起始靶細胞的數(shù)量為10,000-40,000個，優(yōu)選地為15,000-30,000個，更優(yōu)選地為15,000-25,000個。

34、在另一優(yōu)選例中，步驟b中，加入不同數(shù)量的效應(yīng)細胞與靶細胞共培養(yǎng)，獲得不同效靶比下效應(yīng)細胞的殺傷能力。

35、在另一優(yōu)選例中，在步驟b中共培養(yǎng)6h后開始進行步驟c的檢測。

36、在另一優(yōu)選例中，在步驟b中共培養(yǎng)6h～72h期間的一個或多個時間點進行步驟c的檢測；優(yōu)選地，在共培養(yǎng)12～60h期間的一個或多個時間點進行步驟c的檢測；更優(yōu)選地，在共培養(yǎng)24～48h期間的一個或多個時間點進行步驟c的檢測。

37、在另一優(yōu)選例中，步驟b中每隔時間t進行步驟c的檢測；優(yōu)選地，所述t選自0.5h～4h，例如t為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h等。

38、在另一優(yōu)選例中，步驟c中，用自動細胞成像系統(tǒng)檢測所述熒光強度。

39、在另一優(yōu)選例中，步驟c中，檢測熒光強度的過程不影響細胞的共培養(yǎng)過程。

40、在另一優(yōu)選例中，步驟c中，在共培養(yǎng)的過程中多次對進行熒光強度的檢測。

41、在另一優(yōu)選例中，所述方法進一步包括步驟：

42、d.在實驗組中再次加入靶細胞，共培養(yǎng)后重復(fù)步驟c，計算效應(yīng)細胞對當前輪次的靶細胞的殺傷能力；

43、e.重復(fù)步驟d，計算效應(yīng)細胞對多輪靶細胞的殺傷能力。

44、在另一優(yōu)選例中，步驟d中，共培養(yǎng)6h～72h期間的一個或多個時間點進行步驟c的檢測；優(yōu)選地，在共培養(yǎng)12～60h期間的一個或多個時間點進行步驟c的檢測；更優(yōu)選地，在共培養(yǎng)24～48h期間的一個或多個時間點進行步驟c的檢測。

45、在另一優(yōu)選例中，所述方法為質(zhì)控方法，用于免疫制品生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

46、在另一優(yōu)選例中，所述免疫制品為nk細胞產(chǎn)品。

47、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種實時動態(tài)檢測效應(yīng)細胞殺傷能力的系統(tǒng)，包括以下模塊：

48、(m1)實驗?zāi)K，其被配置為包含細胞培養(yǎng)容器，以及位于所述容器中的待檢測效應(yīng)細胞和靶細胞，所述靶細胞穩(wěn)定表達熒光蛋白；所述實驗?zāi)K用于共培養(yǎng)所述待檢測效應(yīng)細胞和靶細胞；

49、(m2)對照模塊，其被配置為包含細胞培養(yǎng)容器，所述容器中僅含有靶細胞；所述對照模塊用于培養(yǎng)所述靶細胞作為對照；

50、(m3)熒光檢測模塊，用于實時動態(tài)檢測實驗?zāi)K和對照模塊中的熒光強度；

51、(m4)輸出模塊，用于輸出熒光檢測模塊檢測到的熒光強度值，其中實驗?zāi)K的熒光強度記為r1，對照模塊的熒光強度記為r0，用如下式i的公式計算并輸出細胞殺傷能力c：

52、c(％)＝(1-r1/r0)×100％(式i)。

53、在另一優(yōu)選例中，所述實驗?zāi)K和對照模塊處于相同的實驗條件。

54、在另一優(yōu)選例中，所述熒光檢測模塊包括自動細胞成像系統(tǒng)。

55、在另一優(yōu)選例中，所述系統(tǒng)還包括：(m5)控制模塊，其用于控制(m3)熒光檢測模塊在(m1)實驗?zāi)K和(m2)對照模塊運行6h～72h，優(yōu)選地12～60h，更優(yōu)選地24～48h期間的一個或多個時間點進行熒光強度檢測。

56、在另一優(yōu)選例中，(m5)控制模塊用于控制(m3)熒光檢測模塊每隔時間t進行進行熒光強度檢測；優(yōu)選地，所述t選自0.5h～4h，例如t為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h等。

57、在本發(fā)明的第三方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的方法在檢測效應(yīng)細胞免疫活性、免疫制品質(zhì)量控制或個體免疫功能評價中的應(yīng)用。

58、在另一優(yōu)選例中，所述效應(yīng)細胞為nk細胞。

59、在另一優(yōu)選例中，所述效應(yīng)細胞為car-nk細胞。

60、在另一優(yōu)選例中，所述免疫制品為nk細胞產(chǎn)品。

61、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

62、本發(fā)明的有益效果包括：

63、1.本發(fā)明的方法可以實時監(jiān)測腫瘤細胞的死亡情況，相比于終點法，可以長期持續(xù)地檢測細胞殺傷能力的變化情況。

64、2.本發(fā)明的方法可以實現(xiàn)體外模擬腫瘤侵襲的方法，連續(xù)多輪地檢測細胞的持續(xù)殺傷能力，用于全面地評價細胞產(chǎn)品在體外的存續(xù)及對腫瘤細胞的毒性。

65、3.本發(fā)明的方法可以同時適用于貼壁類型的靶細胞與懸浮類型的靶細胞，更具有通用性。

66、4.本發(fā)明的方法利用帶有g(shù)fp標簽的腫瘤細胞來替代其他試劑檢測靶細胞的死亡情況，極大地降低了成本，且高靈敏度、重復(fù)性好、操作簡單。