本發(fā)明屬于作物病害防控基因，具體涉及一株表達(dá)dsrna的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、rna干擾（rna?interference,?rnai）技術(shù)是較前沿的基因調(diào)控技術(shù)，可通過(guò)雙鏈rna（dsrna）產(chǎn)生的小干擾rna（sirna）干擾靶標(biāo)基因的表達(dá)，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值?；趓nai技術(shù)開(kāi)發(fā)的rna農(nóng)藥，是以特異性靶向并干擾有害生物關(guān)鍵基因表達(dá)的dsrna為有效成分，具有靶向性強(qiáng)、藥效優(yōu)異、環(huán)境及生態(tài)安全性高、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是農(nóng)藥發(fā)展史上的“第三次革命”。rna農(nóng)藥以生物大分子作為有效成分，一般認(rèn)為可歸類(lèi)為生物農(nóng)藥范疇，符合農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的需求，具有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。目前，針對(duì)dsrna在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用主要有兩個(gè)途徑，一是通過(guò)植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得表達(dá)dsrna的轉(zhuǎn)基因植株，利用寄主表達(dá)的有害生物靶標(biāo)基因的dsrna來(lái)干擾靶基因的表達(dá)，即寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced?gene?silencing，higs）技術(shù)；二是通過(guò)體外直接噴施dsrna沉默靶基因，即外源噴霧誘導(dǎo)基因沉默（spray-induced?gene?silencing，sigs）技術(shù)。然而，受部分作物缺少成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系、dsrna在環(huán)境中穩(wěn)定性差、dsrna遞送效率低、dsrna合成純化成本高等問(wèn)題的限制，這兩個(gè)應(yīng)用途徑無(wú)法滿足rnai技術(shù)在植保領(lǐng)域中的應(yīng)用推廣。為了實(shí)現(xiàn)rnai在植物病蟲(chóng)害防治中更加有效的利用，需要尋找新的dsrna應(yīng)用途徑。

2、利用大腸桿菌、釀酒酵母等微生物合成dsrna，可以極大的降低dsrna的生產(chǎn)成本。然而通過(guò)這些微生物合成的dsrna往往需要后期的純化過(guò)程，造成dsrna的損失，增加生產(chǎn)成本。以植物組織中優(yōu)勢(shì)定殖的內(nèi)生菌作為載體，構(gòu)建表達(dá)dsrna的工程菌株，并將工程菌株以活體菌劑的形式直接使用，利用內(nèi)生菌高效合成dsrna的同時(shí)，不斷向植物釋放dsrna，可有效解決dsrna合成成本高、遞送效率低、穩(wěn)定性差、施藥間隔周期短等問(wèn)題，在實(shí)現(xiàn)rna農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和田間應(yīng)用中具有巨大的研究和應(yīng)用價(jià)值。

3、球孢白僵菌（beauveria?bassiana）是一種雙重生防真菌，既能在數(shù)百種昆蟲(chóng)體內(nèi)寄生，用于防治蟲(chóng)害；又能在玉米、番茄等多種植物內(nèi)定殖，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗病性等多種作用。球孢白僵菌是一種廣泛應(yīng)用的生防真菌，對(duì)其生物學(xué)特性有良好的研究基礎(chǔ)，同時(shí)，球孢白僵菌具有易于培養(yǎng)、容易規(guī)?；a(chǎn)、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)勢(shì)，符合作為底盤(pán)微生物構(gòu)建表達(dá)dsrna工程菌株的要求，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在解決上述問(wèn)題，提供了一株表達(dá)dsrna的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述工程菌株bb-dsmucin是利用球孢白僵菌qse-f1菌株表達(dá)灰霉菌靶標(biāo)基因bcmucin基因的dsrna，該工程菌株能夠有效干擾靶標(biāo)基因bcmucin的表達(dá)，對(duì)番茄灰霉病具有顯著的防治效果。

2、為實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明通過(guò)以下方案予以實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供了一株表達(dá)dsrna的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin，所述球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin是將能夠干擾靶標(biāo)基因bcmucin表達(dá)的dsrna表達(dá)框架轉(zhuǎn)入到球孢白僵菌中獲得，所述dsrna表達(dá)框架的序列如seq?id?no.1所示。

4、進(jìn)一步的，所述球孢白僵菌為qse-f1菌株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no:?m?20241661。

5、進(jìn)一步的，所述dsrna能夠靶向灰霉菌的關(guān)鍵靶標(biāo)基因bcmucin。

6、本發(fā)明提供了所述的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

7、（1）dsrna表達(dá)框架由兩端序列相同、方向相反的臂序列和中間起連接作用的中心序列構(gòu)成，構(gòu)建dsrna表達(dá)框架；

8、（2）將dsrna表達(dá)框架連接到含有適合于球孢白僵菌的組成型啟動(dòng)子olic的pdht-bar載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建含dsrna的表達(dá)框架的質(zhì)粒；

9、（3）將構(gòu)建成功的含dsrna表達(dá)框架的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌菌株中，然后利用atmt技術(shù)向球孢白僵菌中轉(zhuǎn)入dsrna表達(dá)框架，利用含有除草劑的抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，獲得工程菌bb-dsmucin菌株。

10、進(jìn)一步的，所述步驟（1）中臂序列是bcmucin基因的部分編碼序列，序列如seq?idno.2所示，中心序列如?seq?id?no.3所示。

11、本發(fā)明還提供了所述工程菌株bb-dsmucin在防治番茄灰霉病中的應(yīng)用。

12、進(jìn)一步的，在應(yīng)用時(shí)，將所述工程菌株bb-dsmucin的孢子懸浮液均勻噴灑在整個(gè)番茄植株上。

13、進(jìn)一步的，所述工程菌株bb-dsmucin的孢子懸浮液的制備方法為：將工程菌株bb-dsmucin接種到y(tǒng)epd液體培養(yǎng)基中，在25℃，180rpm條件下震蕩培養(yǎng)4天，培養(yǎng)液經(jīng)3層擦凈紙過(guò)濾去除菌絲體，對(duì)濾液中的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用清水稀釋至孢子濃度為106-107?cfu/ml后使用。

14、進(jìn)一步的，所述工程菌株bb-dsmucin能有效抑制灰霉菌靶標(biāo)基因bcmucin的表達(dá)，進(jìn)而抑制灰霉菌的侵染。

15、進(jìn)一步的，所述工程菌株bb-dsmucin防治灰霉病，體現(xiàn)在灰霉菌侵染產(chǎn)生的病斑顯著減小，病斑上的灰霉菌生物量顯著降低。

16、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明利用植物內(nèi)生菌表達(dá)病原菌關(guān)鍵靶標(biāo)基因的dsrna，既可以低成本產(chǎn)生dsrna，有可以利用內(nèi)生菌在植物中的定殖不斷釋放dsrna發(fā)揮作用。本發(fā)明提供的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin，能夠有效干擾灰霉菌關(guān)鍵靶標(biāo)基因bcmucin的表達(dá)，從而有效防治灰霉病的發(fā)生。本發(fā)明提供的bb-dsmucin菌株可用于新型生物農(nóng)藥的創(chuàng)制，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一株表達(dá)dsrna的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin，其特征在于，所述球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin是將能夠干擾靶標(biāo)基因bcmucin表達(dá)的dsrna表達(dá)框架轉(zhuǎn)入到球孢白僵菌中獲得，所述dsrna表達(dá)框架的序列如seq?id?no.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin，其特征在于，所述球孢白僵菌為qse-f1菌株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no:?m?20241661。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin，其特征在于，所述dsrna表達(dá)框架含有靶標(biāo)基因bcmucin的部分編碼序列作為臂序列，臂序列如seq?id?no.2所示。

4.權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（1）中臂序列是靶標(biāo)基因bcmucin的部分編碼序列，序列如seq?id?no.2所示，中心序列如?seq?id?no.3所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（2）中所述球孢白僵菌為qse-f1菌株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no:?m?20241661。

7.權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌工程菌株bb-dsmucin在防治灰霉病中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述工程菌株bb-dsmucin制備成孢子懸液，均勻噴灑在整個(gè)植株上。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制備方法為：將工程菌株接種到y(tǒng)epd液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)濾紙過(guò)濾去除菌絲，獲得含孢子的孢子懸液。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述含孢子的孢子懸液中工程菌株bb-dsmucin的孢子濃度為106-107?cfu/ml，工程菌株bb-dsmucin能夠抑制灰霉菌靶標(biāo)基因bcmucin的表達(dá)，有效抑制番茄灰霉病的發(fā)生。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一株表達(dá)dsRNA的球孢白僵菌工程菌株Bb?dsMucin及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述球孢白僵菌是球孢白僵菌QSE?F1菌株，該菌株能夠在番茄葉部定殖。所述dsRNA能夠靶向灰霉菌關(guān)鍵基因BcMucin，通過(guò)RNAi的方式沉默BcMucin基因的表達(dá)。所述工程菌株是利用ATMT技術(shù)將含有靶基因序列的載體轉(zhuǎn)入球孢白僵菌QSE?F1菌株中，獲得能夠合成靶向BcMucin的dsRNA的工程菌株Bb?dsMucin。本發(fā)明還提供了工程菌株Bb?dsMucin的應(yīng)用，所述應(yīng)用是工程菌株Bb?dsMucin能夠干擾靶標(biāo)基因BcMucin的表達(dá)，進(jìn)而有效防治番茄灰霉病。本發(fā)明經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明提供的工程菌株Bb?dsMucin可用于制備防治灰霉病的生物制劑，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：劉孟潔,楊帆,牛宇飛,梁文星,張譽(yù)懷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23