本發(fā)屬于植物基因工程領(lǐng)域；尤其涉及小麥白粉病抗性基因tagap1、其編碼蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、小麥(triticum?aestivum)是一種非常重要的旱作糧食作物，而小麥白粉病是其主要病害之一，可極大降低小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。小麥白粉病是由布氏白粉菌小麥?；?blumeria?graminis?forma?specialis?tritici)引起的，主要危害小麥及其近緣種屬，該菌與作物葉片競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分并阻礙其光合作用。由于施用化學(xué)藥劑對(duì)該病原菌的控制效果非常有限，而且會(huì)污染糧食以及生態(tài)環(huán)境，因而培育具有白粉病抗性的小麥品種是最有效的應(yīng)對(duì)策略。從小麥及其近緣種屬中克隆、研究其所攜帶的高效抗源基因以滿足抗性育種之需是目前的當(dāng)務(wù)之急。

2、在植物中，存在許多具有c2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，根據(jù)其功能至少可分為四組不同的蛋白質(zhì)。含c2結(jié)構(gòu)域的蛋白經(jīng)常通過(guò)與其他分子的相互作用參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程(jambunathan?and?mcnellis?2003),如：c2結(jié)構(gòu)域可能參與磷脂結(jié)合，在調(diào)節(jié)或介導(dǎo)磷脂信號(hào)中起作用。此外，植物中小c2結(jié)構(gòu)域蛋白的功能研究表明，它們?cè)诨ǚ鄯敝骋约胺巧锩{迫和植物防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。tagap1蛋白不含任何跨膜結(jié)構(gòu)域，但含有單個(gè)c2結(jié)構(gòu)域?qū)儆谛2結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。一些含c2結(jié)構(gòu)域的蛋白可以與g蛋白結(jié)合并影響其活性(wang?etal.1999)。在秀麗隱桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，含有c2結(jié)構(gòu)域的rgs蛋白可結(jié)合g蛋白的α亞基(sato?etal.2003)。此外，在幾個(gè)gap中也發(fā)現(xiàn)了c2結(jié)構(gòu)域，包括syngap(pena?et?al.2008)；rasgaps(gawler?et?al.1995)、rhogaps(hallam?et?al.2002)和arfgaps(jensen?et?al.2009；zhang?et?al.2005)。有研究表明含有c2結(jié)構(gòu)域gtp酶激活蛋白質(zhì)可參與gtp酶的激活功能。syngap需要其c2結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)gap活性，c2結(jié)構(gòu)域向rap的開(kāi)關(guān)il區(qū)域協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，以協(xié)助gtpase刺激(pena?et?al.2008)。編碼gtp酶激活蛋白的osgap1與atgap1也是含有單個(gè)c2結(jié)構(gòu)域，且可激活非常規(guī)g蛋白的gtp酶活性(cheung?et?al.2008)。本研究獲得了小麥特異性的小c2結(jié)構(gòu)域蛋白gtp酶激活蛋白tagap1。

3、c2結(jié)構(gòu)域在控制蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位中發(fā)揮作用。研究表明，osgap1可激活osychf1的gtp酶活性，在細(xì)胞中不同位置激活不同的防御反應(yīng)。osgap1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，生物脅迫下，通過(guò)osgap1的磷脂結(jié)合能力，將osychf1可從細(xì)胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，激活osychf1的ntpase活性，防御反應(yīng)被激活(cheung?et?al.2010)。而在鹽脅迫下，osgap1和osychf1都定位于細(xì)胞質(zhì)中，osgap1激活osychf1的ntpase活性，鹽脅迫反應(yīng)被激活(cheung?et?al.2013)。此外，其他單c2結(jié)構(gòu)域蛋白也可以在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜之間轉(zhuǎn)運(yùn)，如調(diào)節(jié)水稻花粉育性的蛋白質(zhì)ospbp1具有鈣濃度依賴性磷脂結(jié)合活性，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ca2+濃度的變化響應(yīng)，定位轉(zhuǎn)換到細(xì)胞質(zhì)膜(yang?et?al.2008)。而本研究中的tagap1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(見(jiàn)圖4、圖5)。單個(gè)c2結(jié)構(gòu)域蛋白可參與不同物種的防御和脅迫反應(yīng)。擬南芥中的atbap1通過(guò)抑制細(xì)胞程序性死亡(超敏反應(yīng)的必要反應(yīng))來(lái)抑制植物防御，bap1功能的喪失增強(qiáng)了對(duì)毒性細(xì)菌和卵菌病原體的抗病能力，且這種增強(qiáng)的抗性是由水楊酸、pad4和抗病基因snc1介導(dǎo)的(yang?et?al.2006；yang?et?al.2007)。另一方面，atbap1或其同源物atbap2可減輕酵母的氧化應(yīng)激(yang?et?al.2007)。osgap1參與水稻的防御和高鹽脅迫反應(yīng)。高鹽誘導(dǎo)了osgap1、v-atp酶的跨膜亞基osvha-a1和小gtp酶osrab11的表達(dá)，osvha-a1可直接與osrab11及osgap1相互作用。在鹽脅迫條件下，這些相互作用調(diào)控osvha-a1在高爾基體網(wǎng)絡(luò)tgn和前液泡室pvc之間的囊泡運(yùn)輸以及osgap1在中央液泡的定位。osrab11與osgap1的相互作用促進(jìn)了osvha-a1的囊泡運(yùn)輸，以調(diào)節(jié)高鹽度導(dǎo)致的細(xì)胞質(zhì)中離子失衡(son?et?al.2013)。過(guò)表達(dá)osgap1增強(qiáng)了對(duì)水稻對(duì)黃單胞菌xoo不同小種的抗性，具有廣譜抗性，同時(shí)提高了三個(gè)防御標(biāo)記基因pr1、grcwp和pbz1的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平(chern?etal.2005；cheung?et?al.2008)。此外，轉(zhuǎn)osgap1的擬南芥增強(qiáng)了對(duì)pst?dc3000的抵抗能力及防御標(biāo)記基因pr1、pr2、pdf1.2和thi2.1的轉(zhuǎn)錄水平(thomma?et?al.1998；cheong?etal.2002；cheung?et?al.2008)。說(shuō)明osgap1可能參與多種信號(hào)通路，賦予廣譜抗病能力(cheung?et?al.2008)。

4、擬南芥atgap1也稱為為c2結(jié)構(gòu)域aba相關(guān)(car4)蛋白，參與脫落酸(aba)信號(hào)傳導(dǎo)。atgap1(car4)介導(dǎo)aba受體(rcar)的pyr/pyl調(diào)控組分以鈣依賴的方式被招募至質(zhì)膜，在此過(guò)程中發(fā)生短暫的相互作用，從而影響pyr/pyl的亞細(xì)胞定位(diaz?et?al.2016；rodriguez?et?al.2014)。同時(shí)，pyr/pyl和pp2c的互作可抑制由aba激活的蔗糖非酵解型激酶亞家族2(snrk2s)的去磷酸化活性，且atgap1(car4)可促進(jìn)二者之間的互作，正向調(diào)控aba通路。除此之外，經(jīng)snrk2s磷酸化的abf轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合aba分子響應(yīng)元件，以調(diào)控aba信號(hào)途徑中防御基因的轉(zhuǎn)錄(park?et?al.2009；ma?et?al.2009；yoon?et?al.2020)。car基因的缺失可導(dǎo)致對(duì)aba的敏感性減弱，從而抑制根系的生長(zhǎng)。據(jù)推測(cè)，環(huán)境脅迫可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ca2+水平的振蕩，而car蛋白可能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)aba和ca2+信號(hào)之間的串?dāng)_(diaz?etal.2016；rodriguez?et?al.2014)。此外，atgap1也參與生物脅迫反應(yīng)，過(guò)表達(dá)atgap1使擬南芥能更有效的對(duì)抗病原菌pst?dc3000壓力和提高pr1的表達(dá)水平。對(duì)pst?dc3000接種后過(guò)表達(dá)atgap1擬南芥植株的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示atgap1過(guò)表達(dá)通過(guò)增加病原菌感染前細(xì)胞壁修飾相關(guān)蛋白的積累，來(lái)增加葉肉細(xì)胞的細(xì)胞壁厚度，減小葉片氣孔孔徑，增強(qiáng)了擬南芥對(duì)病原菌pst?dc3000感染的抗性(cheng?et?al.2022)?？傊?，單個(gè)c2結(jié)構(gòu)域蛋白可調(diào)節(jié)植物免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和過(guò)程及增強(qiáng)植物對(duì)不利環(huán)境的抵抗能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供了一種小麥白粉病抗性基因tagap1、其編碼蛋白及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明涉及小麥白粉病抗性基因tagap1，通過(guò)ensembl?plants網(wǎng)站分析tagap1全長(zhǎng)513bp，編碼一個(gè)由170aa的gtp酶激活蛋白，蛋白大小為18.98kda。ncbi的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)該蛋白屬于arfgap家族，含有一個(gè)c2結(jié)構(gòu)域，其中6-150aa為c2結(jié)構(gòu)域。

4、在ensembl?plants和ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中查找發(fā)現(xiàn)tagap1在小麥中有三個(gè)拷貝，分別位于2a、2b、2d染色體。通過(guò)dnaman軟件對(duì)三個(gè)拷貝的序列進(jìn)行比對(duì)，三個(gè)拷貝之間的相似度很高，高達(dá)98％。

5、本發(fā)明所涉及的小麥白粉病抗性基因tagap1，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

6、本發(fā)明所涉及的小麥白粉病抗性基因tagap1編碼的蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.2所示。

7、本發(fā)明所涉及的小麥白粉病抗性基因tagap1的等位基因tagap1-1as，其編碼區(qū)核苷酸序列為：

8、<120>>traescs2a01g501300.1

9、

10、

11、其氨基酸序列為：

12、mlghlaglvkvrvtrgvnlairdlrssdpyvvvrmgkqklktrvvrksinpewndeltlsvedptipvkldvfdkdtffddpmgnaeldigplveaatmriqlqgvadgtvvkklvpnrqnclaeesavylsegtvkqdvvlrlrnvecgevelqlqwidipgskgasgf

13、本發(fā)明所述的小麥白粉病抗性基因tagap1的等位基因tagap1-2as，其編碼區(qū)核苷酸序列為：

14、<120>>traescs2d01g501800.2

15、

16、

17、其氨基酸序列為：

18、mlghlvglvkvrvtrgvnlairdlrssdpyvvvrmgkqklktrvvrksinpewndeltlsiedptipvkldvfdkdtffddpmgnaeldigplveaatmriqlqgvadnsvvkklvpnrqnclaeesaiylsegtvkqdvvlrlrnvecgevelqlqwidipgskgasgf

19、本發(fā)明還涉及小麥白粉病抗性基因tagap1在小麥白粉病抗性育種中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

21、本研究通過(guò)bsmv介導(dǎo)的瞬時(shí)沉默技術(shù)對(duì)tagap1進(jìn)行沉默，接種e09后，發(fā)現(xiàn)沉默植株白粉菌落數(shù)量明顯增加，白粉菌的生長(zhǎng)發(fā)育要快于對(duì)照植株，菌絲分支、長(zhǎng)度、侵染面積均顯著高于對(duì)照，病程相關(guān)蛋白的表達(dá)量下調(diào)，表明沉默tagap1降低了小麥對(duì)白粉病的抗性。